处理组病毒滴度)/ 对照组病毒滴度X 100%。每种药物浓度下的相对病毒滴度百分比为Ξ次重复实验的平均 值±50。^药物浓度的对数值做横坐标、相对病毒滴度为纵坐标，通过SPSS 20软件使用 Probit回归法计算药物抑制空斑形成的EC50(表3)，无论EV71还是CVA16，螺旋霉素均表现 出明显的抗病毒活性，其次是阿奇霉素和交沙霉素。同时利用Graphpad软件作图，获得拟合 的量效曲线（图2)，图2中列出的是抗病毒效果明显的螺旋霉素、阿奇霉素和交沙霉素的量 效曲线图。
[0039] 1.5空斑法测定病毒滴度:将RD细胞接种于96孔板，lxl04cell/ml，过夜培养后，接 种按10倍比稀释的病毒上清，每种稀释度接种10个孔，测定TCID50。将Vero细胞接种于6孔 板中，在5%C02、37°C条件下培养18-20h后，将100TCID50的EV71-MZ201405或CVA16-MZ201509病毒感染比，弃去上清，加入含1.2%甲基纤维素 W及不同浓度的大环内醋类药物 的培养基培养4天左右，经多聚甲醒固定、结晶紫染色、清水漂洗、惊干后作空斑计数，计算 病毒滴度。
[0040] 表3.大环内醋类抗生素的半数抗病毒浓度
[0041]
[0042] 综上所述，所检测的六种大环内醋类抗生素皆具有体外抗肠病毒EV71和CVA16活 性，其中W螺旋霉素抑制作用最显著，其次为阿奇霉素和交沙霉素及克拉霉素。
[0043] 实施例2
[0044] 肠病毒是单链正义RNA病毒，基因组长度约为7408nt，含有一个开放阅读框、编码 产生一个多聚蛋白，其两侧为5'和3'非编码区（untranslated region,UTR)。多聚蛋白酶解 后产生病毒结构蛋白和非结构蛋白；5'UTR含有RNA复制信号和多肤翻译的起始信号IRES, 通过与宿主蛋白因子的结合在病毒基因组RNA的合成和翻译过程中发挥重要作用。本发明 W螺旋霉素抗EV71为例，通过生化和分子生物学研究手段，在细胞水平上对大环内醋类抗 生素抑制肠病毒复制的可能作用机制进行了分析。
[0045] 2.1检测药物加入时间对药物抗病毒活性的影响，为分析螺旋霉素阻断EV71感染 的环节提供线索：将5xl0 4个RD细胞接种至24孔板培养18~24h后用M0I = 5的EV71-MZ201405感染，于感染前化(-1)及感染后化、化、化、地、化、她加入100μΜ的螺旋霉素，感染 后lOh收集上清，通过空斑分析测定病毒滴度。作为对照，将病毒感染细胞后，在不同时间点 单加 DMS0,于感染后lOh收集上清并测定病毒滴度，排除溶剂DMS0对病毒产生的影响。如图3 所示，感染前至感染后化加入药物具有相似的抑制病毒产生活性，感染4h后再加入螺旋霉 素则对病毒滴度的抑制效应明显减弱，说明螺旋霉素在病毒复制的早期阶段(包括吸附、进 入及脱衣壳)或晚期阶段(组装及释放)并不发挥作用，此结果表明螺旋霉素阻断EV71的复 制很可能发生在RNA复制或蛋白翻译阶段。
[0046] 2.2RT-QPCR检测螺旋霉素对病毒RNA合成的影响：将5xl04Vero细胞接种于24孔 板，培养24小时后用M0I = 10的EV71-MZ201405感染比，去除病毒上清并加入含有DMS0或100 μΜ螺旋霉素的培养基。于感染后化，地，化，她分别用化izol提取细胞总RNA。经面ase消化 后，根据PrimeScript RT reagent Kit说明书进行反转录;然后WcDNA为模板进行QPCR;针 对 EV7 1 的引 物为 5 '-TGTATGTCTCATTATCAGGGG-3 '（ SEQ ID No.l^RS'-CCACCTGTTGCTTGTAACCGT-3'（SEQ ID No. 2)，扩增子为EV712C片段；W细胞的GAPDH为内参 进行校正，引物为5 ' -GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 '（ SEQ ID No. 3)，5 ' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 '（沈Q ID No. 4) dPCR采用两步法：94°C30sec，94°C5sec，60°C30sec，42巧cles。化时对照 细胞的病毒RNA相对丰度设定为1，实验重复Ξ次。如图4所示，螺旋霉素的存在明显抑制了 病毒RNA的合成，阻断机制可能发生在RNA复制或病毒蛋白合成环节。
[0047] 2.3RNA转染合并巧光显微镜考察螺旋霉素阻断EV71复制的机制:经体外转录获取 携带巧光报告基因 GFP的EV71全长基因组RNA化V71-GFP RNA)。将293A传至24孔板，5xl04细 胞/孔，培养1她后，每孔用1.化1 Lipo2000转染化g EV71-GFP RNA，4h后更换为含有20或 100μΜ螺旋霉素的培养基，W未加药物的培养基为对照。观察12h时巧光表达情况，随机计数 100个视野并计算每个视野的平均GFP+细胞数，可W看出100μΜ螺旋霉素明显抑制了 GFP的 表达(图5)，说明螺旋霉素能阻断EV71病毒的多聚蛋白合成或加工。
[004引 2.4双报告基因检测螺旋霉素对6￥715'17^1365功能的影响：^口61^3-111(3为出发 质粒，将Renillaluc(R-luc)报告基因 PCR扩增后插入到pGL3-luc质粒报告基因 firefly luc(F-luc)的下游，两个报告基因之间由一段多克隆位点序列连接；然后将PCR扩增的 EV715'UTR插入到F-luc与R-luc之间、紧邻R-luc起始密码子的上游;所产生的质粒命名为 pGL3-dual 1UC-EV71IRES。将293A细胞传代至六孔板中，5x105细胞/孔，培养1她后转染 P化3-dual 1UC-EV71IRES，分别加入100μΜ螺旋霉素和四环素作用36h后测定F-luc和R-luc 的活性并计算相对比值，对照细胞中的R-luc/F-luc设定为1。数据显示螺旋霉素能特异性 抑制EV715 ' UTR的翻译功能，四环素抑制EV71复制的机制则与EV715 ' UTR的翻译功能无关 (图6)。该结果进一步表明螺旋霉素通过参与抑制EV715'UTR的IRES功能而发挥了抗病毒活 性。
[0049]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 W做出其它不同形式的变化或变动，运里无法对所有的实施方式予W穷举，凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 大环内酯类抗生素或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的大环内酯类抗生素或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应 用，其特征在于，所述大环内酯类抗生素包括红霉素、硬脂酸红霉素、琥乙红霉素、依托红霉 素、乳糖酸红霉素、克拉霉素、地红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、交沙霉素、麦迪霉素、螺旋霉 素、乙酰螺旋霉素、柱晶白霉素或麦白霉素。3. 根据权利要求1或2所述的大环内酯类抗生素或其药用盐在制备抗手足口病药物中 的应用，其特征在于，所述药物是以大环内酯类抗生素或其药用盐为有效成分与药学可接 受的辅料组合制成。4. 根据权利要求3所述的大环内酯类抗生素或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应 用，其特征在于，所述药物为口服制剂、注射制剂或局部施用制剂。
【专利摘要】本发明公开了大环内酯类抗生素或其药用盐在制备抗手足口病药物中的应用。实验表明，具有含有14元、15元和16元大环内酯母核的大环内酯类抗生素具有抗EV71和CVA16病毒的活性，具有开发为治疗手足口病的药物或先导化合物的潜在应用价值。
【IPC分类】A61K31/7048, A61K31/7052, A61P31/14
【公开号】CN105456283
【申请号】CN201511030722
【发明人】郭学敏, 曾施暖, 孟小斌, 黄清苑, 雷南风, 曾令斌
【申请人】中山大学, 梅州市人民医院
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2015年12月30日