Plga纤维-微球双载药复合支架及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种PLGA纤维?微球双载药复合支架及其制备方法，用于解决现有制备PLGA纤维?微球双载药复合支架的方法复杂的技术问题。技术方案是采用PLGA纤维与他汀类药物制备含有他汀类药物的静电纺丝液，再采用PLGA纤维与生物活性因子按质量比为20～600000:1配制均一的电喷溶液，最后将制备的静电纺丝液和电喷溶液同时电纺和电喷，将收集的支架材料置于真空干燥箱中干燥24～48h，得到他汀类药物和生物活性因子双负载的PLGA纤维?微球复合支架材料。由于采用乳液电喷的方法，形成油包水型乳液，避免药物与有机溶剂直接接触引起失活，方法简单。同时由于制备过程未使用表面活性剂和乳化剂，生物安全性更高。
【专利说明】
PLGA纤维-微球双载药复合支架及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种PLGA纤维-微球双载药复合支架，还涉及这种PLGA纤维-微球双载药复合支架的制备方法。
【背景技术】
[0002]药物控制释放系统的应用具有巨大的商业潜力，其在美国的年销售额超过10亿美元。随着药用可降解高分子材料的广泛研究及应用，控释体系日益增多。可降解高分子凝胶，微球及纳米纤维都可以作为药物载体。近年来，具有生物相容性及可降解的高分子生物材料作为新型组织工程支架材料为组织的修复及重建带来了希望。但是，现有的组织修复及重建的支架功能单一，难以满足组织修复及重建中的复杂需要。
[0003]静电纺丝技术是一种制备连续纤维结构的简单高效的方法。由静电纺丝法制备的组织工程支架具有较大的比表面积，其三维多孔结构类似于细胞外基质，利于细胞的粘附，增殖和生长。同时纤维支架也可以作为药物或某些活性因子的缓释载体，满足组织工程的要求。静电喷射技术是一种有前景的制备微纳米微球的技术，其制备的微球可以作为负载药物的良好载体，微纳米颗粒分散性良好，粒径可控。组织工程构建的三要素包括种子细胞，支架材料和生物活性因子。其中生物活性因子在组织修复和重建过程中是不可或缺的，但存在稳定性差，半衰期短和易被体内酶作用而失活等特点。利用静电纺丝及静电喷射技术制备具有药物缓控释功能的纤维-微球复合支架，以期促进组织修复及重建，满足组织修复和重建中的复杂要求。
[0004]文献1“专利公开号是CN 104448356 A”的中国发明专利，公开了一种空白PLGA微球及其制备方法。该空白微球由水-油-水乳胶法制备，PLGA溶于二氯甲烷中，添加乳化剂聚乙烯醇，磁力搅拌去除二氯甲烷，离心收集微球体，洗涤冻干得到PLGA微球，可在组织工程中充当良好的细胞载体。但单一的PLGA微球难以满足组织修复及重建中复杂的需求;而且制备方法中添加了乳化剂，后续操作中要通过搅拌作用除去有机溶剂，析出洗涤冻干得到微球，过程稍显复杂，限制了此方法的应用。
[0005]文献2“专利公开号是CN103585635 A”的中国发明专利，公开了一种可保持蛋白、多肽类药物活性的缓释聚乳酸类微球及其制备方法。由聚乳酸类生物可降解材料PLGA或聚乳酸(PLA)，生物玻璃和主药经静电喷射工艺制备。首先配制三种不同溶液，反应制备溶胶，烘制得凝胶再干燥，球磨筛分，煅烧得到纳米生物活性玻璃。在此过程中需要的化学试剂较多，且步骤繁琐，耗时，对工艺要求较高;之后将生物活性玻璃与蛋白、多肽类药物混合于聚乳酸类的有机溶剂中，进行静电喷射，所得液球要进一步在液氮中冻结，之后于低温环境中去除有机溶剂，沉积固化微球，该过程需要液氮装置及低温环境;整个制备过程步骤繁琐复杂，制备条件也较为苛刻。
[0006]PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid))是已经美国FDA认证的可临床应用的可降解高分子，其无毒性，无抗原性，生物相容性好，力学性能优良，降解速率可控，被广泛用于药物或基因控释以及皮肤、血管、肌腱、软骨及骨等组织工程方面。他汀类药物(辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀等)具有调节血脂的作用，近来发现他汀类药物对骨组织的修复及重建具有促进作用。但是，他汀类药物经口服后对肝脏具有高度选择性，被人体吸收后大部分随胆汁排出，在骨组织及周围组织中含量很低，因此直接将他汀类药物作用于修复部位有利于药物的高效利用。生物活性因子在组织修复及重建中具有不可或缺的作用，生长因子(血管内皮化生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)等)，活性蛋白(骨形态发生蛋白(BMP-2)、牛血清白蛋白(BSA)等)和DNA质粒已被成功负载于组织工程支架中以促进组织修复及重建。但这类生物活性因子多是水溶性的，在有机溶剂体系中难以保持活性，并且在体内半衰期短，需要较高的剂量，价格昂贵，因此研究其在体内的药物递送体系，达到控缓释，能够提高其促进组织修复及重建的效果。然而，如何将生物活性因子与支架材料良好结合以达到理想的控释效果是目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007]为了克服现有制备PLGA纤维-微球双载药复合支架的方法复杂的不足，本发明提供一种PLGA纤维-微球双载药复合支架及其制备方法。该方法采用PLGA纤维与他汀类药物制备含有他汀类药物的静电纺丝液，再采用PLGA纤维与生物活性因子按质量比为20?600000:1配制均一的电喷溶液，最后将制备的静电纺丝液和电喷溶液同时电纺和电喷，将收集的支架材料置于真空干燥箱中干燥24?48h，得到他汀类药物和生物活性因子双负载的PLGA纤维-微球复合支架材料。由于采用乳液电喷的方法，形成一种油包水型乳液，避免药物与有机溶剂直接接触引起失活，方法简单。同时由于制备过程未使用表面活性剂和乳化剂，具有更高的生物安全性。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种PLGA纤维-微球双载药复合支架，其特点是:由电纺PLGA纤维及电喷微球构成，他汀类药物和生物活性因子分别被包埋于PLGA纤维和电喷微球中。其中PLGA纤维直径为200?700nm，载药量为12.77±0.12%;微球粒径为4?8μπι，载药量为23.14 ± 0.75 %，包封率为92.55 ± 3.01 %。
[0009]—种上述PLGA纤维-微球双载药复合支架的制备方法，其特点是包括以下步骤:
[0010]步骤一、将电纺PLGA纤维与他汀类药物按质量比为4?20:1溶于有机溶剂中，配制混合溶液，密封，O?4°C静置12h，磁力搅拌4?6h，涡旋10?15min，超声30?60s消除气泡，得到均一的含有他汀类药物的静电纺丝液。
[0011]步骤二、将电纺PLGA纤维溶解于二氯甲烷中，密封，O?4°C静置12h，磁力搅拌4?6h，涡旋10?15min，再超声30?60s消除气泡，得到PLGA溶液;将生物活性因子溶解于I3BS缓冲溶液中；按所述质量比20?600000:1将含生物活性因子的PBS溶液加入到PLGA溶液中，在冰浴条件下，超声乳化，得到均一的含有生物活性因子的电喷溶液。
[0012]步骤三、将步骤一制备的静电纺丝液和步骤二制备的电喷溶液同时电纺和电喷，形成支架材料，将收集的支架材料置于真空干燥箱中干燥24?48h，得到他汀类药物和生物活性因子双负载的PLGA纤维-微球复合支架材料。
[0013]所述电纺PLGA纤维用PLGA的相对分子质量为100?120kDa。
[0014]所述电纺PLGA纤维用PLGA中乳酸:乙醇酸的摩尔百分比为75:25。
[0015]所述电喷微球用PLGA的相对分子质量为50?60kDa。
[0016]所述电喷微球用PLGA中乳酸:乙醇酸的摩尔百分比为50:50。
[0017]所述他汀类药物是辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、美伐他汀或者阿托伐他汀的任一种。
[0018]所述生物活性因子是VEGF、TGF-β、EGF、BMP-2、BSA或者DNA质粒的任一种。
[0019]所述有机溶剂为二氯甲烷与N，N_二甲基甲酰胺的混合溶剂。
[0020]本发明的有益效果是:该方法采用PLGA纤维与他汀类药物制备含有他汀类药物的静电纺丝液，再采用PLGA纤维与生物活性因子按质量比为20?600000:1配制均一的电喷溶液，最后将制备的静电纺丝液和电喷溶液同时电纺和电喷，将收集的支架材料置于真空干燥箱中干燥24?48h，得到他汀类药物和生物活性因子双负载的PLGA纤维-微球复合支架材料。由于采用乳液电喷的方法，形成一种油包水型乳液，避免药物与有机溶剂直接接触引起失活，方法简单。同时由于制备过程未使用表面活性剂和乳化剂，具有更高的生物安全性。
[0021]以下结合附图和实施例详细说明本发明。
【附图说明】
[0022]图1是本发明PLGA纤维-微球双载药复合支架制备过程示意图。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例参照图1。
[0024]实施例1:将PLGA( 10kDa，75/25)称取200mg，与50mg辛伐他汀溶于二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂(2:1，v/v)中，密封，4°C静置一夜，磁力搅拌4h，涡旋1min，超声30 s消除气泡，得到均一的含有辛伐他汀的静电纺丝溶液;将PLGA (50kDa，50/50)与BMP-2配制均一的电喷溶液。具体做法如下:将PLGA(50kDa，50/50)60mg溶解于二氯甲烷中，密封，4°C静置一夜，磁力搅拌4h，涡旋1min，再超声45s消除气泡，得到PLGA溶液;将BMP-2 200ug溶解于4mLPBS缓冲溶液中；将10yL含BMP-2的I3BS溶液加入到PLGA溶液中，在冰浴条件下，超声5s，停止5s，再超声5s，重复10次，乳化得到均一的含有BMP-2的电喷溶液;将上述得到的电纺溶液和电喷溶液同时电纺和电喷。高压静电纺丝电压为15kV，纺丝液流速为1.0mL/h，纺丝溶液浓度为0.15g/mL;高压静电喷射电压为12kV，电喷液流速为0.4mL/h，电喷液浓度为0.08g/mL。所收集的支架材料置于真空干燥箱中干燥24h，得到辛伐他汀和BMP-2双负载的PLGA纤维-微球复合支架材料。
[0025]实施例2:将PLGA(100kDa，75/25)称取200mg，与20mg洛伐他汀溶于二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂(2:1，v/v)中，密封，O°C静置一夜，磁力搅拌5.5h，涡旋15min，超声45s消除气泡，得到均一的含有洛伐他汀的静电纺丝液;将PLGA(55kDa，50/50)与EGF配制均一的电喷溶液。具体做法如下:将PLGA( 55kDa，50/50)60mg溶解于二氯甲烷中，密封，O°C静置一夜，磁力搅拌5h，涡旋1min，再超声608消除气泡，得到PLGA溶液;将EGF 1ug溶解于1mLPBS缓冲溶液中；将200yL含EGF的PBS溶液加入PLGA溶液中，在冰浴条件下，超声5s，停止5s，再超声5s，重复8次，乳化得到均一的含有EGF的电喷溶液;将上述得到的电纺溶液和电喷溶液同时电纺和电喷。高压静电纺丝电压为12kV，纺丝液流速为0.8mL/h，纺丝溶液浓度为0.10g/mL;高压静电喷射电压为15kV，电喷液流速为0.6mL/h，电喷液浓度为0.1Og/mL。所收集的支架材料置于真空干燥箱中干燥36h，得到洛伐他汀和EGF双负载的PLGA纤维-微球复合支架材料。
[0026]实施例3:将PLGA(120kDa，75/25)称取200mg，与1mg普伐他汀溶于二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂(2:1，v/v)中，密封，O °C静置一夜，磁力搅拌5h，涡旋15min，超声60s消除气泡，得到均一的含有普伐他汀的静电纺丝溶液;将PLGA(60kDa，50/50)与TGF-β配制均一的电喷溶液。具体做法如下:将PLGA(60kDa，50/50)60mg溶解于二氯甲烷中，密封，O °(:静置一夜，磁力搅拌4.5h，涡旋15min，再超声30s消除气泡，得到PLGA溶液;将TGFjlOug溶解于1mLPBS缓冲溶液中；将10yL含TGF-β的PBS溶液加入至IjPLGA溶液中，在冰浴条件下，超声5s，停止5s，再超声5s，重复10次，乳化得到均一的含有TGF-β的电喷溶液;将上述得到的电纺溶液和电喷溶液同时电纺和电喷。高压静电纺丝电压为18kV，纺丝液流速为1.2mL/h，纺丝溶液浓度为0.12g/mL;高压静电喷射电压为12kV，电喷液流速为0.6mL/h，电喷液浓度为0.06g/mL。所收集的支架材料置于真空干燥箱中干燥32h，得到普伐他汀和TGF-β双负载的PLGA纤维-微球复合支架材料。
[0027]实施例4:将？1^^(1201^)&，75/25)称取20011^，与4011^氟伐他汀溶于二氯甲烷与1N-二甲基甲酰胺的混合溶剂(2:1，v/v)中，密封，4°C静置一夜，磁力搅拌6h，涡旋15min，超声30s消除气泡，得到均一的含有氟伐他汀的静电纺丝溶液;将PLGA(60kDa，50/50)与BSA配制均一的电喷溶液。具体做法如下:将PLGA(60kDa，50/50)60mg溶解于二氯甲烷中，密封，O°C静置一夜，磁力搅拌6h，涡旋1min，再超声45s消除气泡，得到PLGA溶液;将BSA 300mg溶解于1mLPBS缓冲溶液中；将10yL含BSA的PBS溶液加入到PLGA溶液中，在冰浴条件下，超声5s，停止5s，再超声5s，重复10次，乳化得到均一的含有BSA的电喷溶液;将上述得到的电纺溶液和电喷溶液同时电纺和电喷。高压静电纺丝电压为15kV，纺丝液流速为0.8mL/h，纺丝溶液浓度为0.12g/mL;高压静电喷射电压为15kV，电喷液流速为0.6mL/h，电喷液浓度为
0.06g/mL。所收集的支架材料置于真空干燥箱中干燥48h，得到氟伐他汀和BSA双负载的PLGA纤维-微球复合支架材料。
[0028]实施例5:将PLGA(100kDa，75/25)称取200mg，与30mg美伐他汀溶于二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂(2:1，v/v)中，密封，O °C静置一夜，磁力搅拌5h，涡旋15min，超声60s消除气泡，得到均一的含美伐他汀的纺丝溶液;将PLGA(50kDa，50/50)与DNA质粒配制均一的电喷液。具体做法如下:将PLGA( 50kDa，50/50) 60mg溶解于二氯甲烷中，密封，O °C静置一夜，磁力搅拌5h，涡旋15min，再超声45s消除气泡，得到PLGA溶液;将DNA质粒10ug溶解于ImLPBS缓冲溶液中；将10yL含DNA质粒的PBS溶液加入到PLGA溶液中，在冰浴条件下，超声5s，停止5s，再超声5s，重复6次，乳化得到均一的含有DNA质粒的电喷溶液;将上述得到的电纺溶液和电喷溶液同时电纺和电喷。高压静电纺丝电压为12kV，纺丝液流速为1.0mL/h，纺丝溶液浓度为0.15g/mL;高压静电喷射电压为12kV，电喷液流速为0.4mL/h，电喷液浓度为0.08g/mL。所收集的支架材料置于真空干燥箱中干燥48h，得到美伐他汀和DNA质粒双负载的PLGA纤维-微球复合支架材料。
[0029]按上述实施例得到具有不同投药比的他汀类药物和生物活性因子双负载的PLGA纤维-微球复合支架。
【主权项】
1.一种PLGA纤维-微球双载药复合支架，其特征在于:由电纺PLGA纤维及电喷微球构成，他汀类药物和生物活性因子分别被包埋于PLGA纤维和电喷微球中；其中PLGA纤维直径为200?700nm，载药量为12.77±0.12% ;微球粒径为4?8μπι，载药量为23.14±0.75%，包封率为92.55±3.01%。2.—种权利要求1所述PLGA纤维-微球双载药复合支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 步骤一、将电纺PLGA纤维与他汀类药物按质量比为4?20:1溶于有机溶剂中，配制混合溶液，密封，O?4°C静置12h，磁力搅拌4?6h，涡旋10?15min，超声30?608消除气泡，得到均一的含有他汀类药物的静电纺丝液； 步骤二、将电纺PLGA纤维溶解于二氯甲烷中，密封，O?4°C静置12h，磁力搅拌4?6h，涡旋10?15min，再超声30?60s消除气泡，得到PLGA溶液;将生物活性因子溶解于I3BS缓冲溶液中；按所述质量比20?600000:1将含生物活性因子的I3BS溶液加入到PLGA溶液中，在冰浴条件下，超声乳化，得到均一的含有生物活性因子的电喷溶液； 步骤三、将步骤一制备的静电纺丝液和步骤二制备的电喷溶液同时电纺和电喷，形成支架材料，将收集的支架材料置于真空干燥箱中干燥24?48h，得到他汀类药物和生物活性因子双负载的PLGA纤维-微球复合支架材料； 所述电纺PLGA纤维用PLGA的相对分子质量为100?120kDa; 所述电纺PLGA纤维用PLGA中乳酸:乙醇酸的摩尔百分比为75:25; 所述电喷微球用PLGA的相对分子质量为50?60kDa; 所述电喷微球用PLGA中乳酸:乙醇酸的摩尔百分比为50:50; 所述他汀类药物是辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、美伐他汀或者阿托伐他汀的任一种； 所述生物活性因子是VEGF、TGF-β、EGF、BMP-2、BSA或者DNA质粒的任一种； 所述有机溶剂为二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂。
【文档编号】A61L27/54GK105879123SQ201610224535
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月12日
【发明人】赵雯, 李姣姣, 刘文龙, 靳凯翔, 牛银波
【申请人】西北工业大学