用于治疗勃起功能障碍的脂肪间充质干细胞的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用脂肪间充质干细胞用于制造脂肪间充质干细胞的悬液，该悬液具有在制造注射液中的用途，其中，注射液可以用于治疗包括人在内的雄性动物勃起功能障碍。尤其适用于治疗包括人在内的雄性动物因糖尿病而引发的勃起功能障碍。脂肪间充质干细胞(ADSC)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，具有取材容易，培养简单，增殖迅速的优点，成为再生医生中重要的一种种子细胞。出乎意料的是，通过实验研究发现，在雄性动物的阴茎根部注射脂肪间充质干细胞的悬液后，可以有效的改善其勃起功能障碍。脂肪间充质干细胞来源可从待治疗的动物或人体自体获得。可减少操作的复杂性，也可以一定程度上防止出现生物排异现象。本发明通过脂肪间充质干细胞的移植，可以用于治疗雄性动物的ED障碍疾病，其实质是提供了一种脂肪间充质干细胞的移植新方向。
【专利说明】
用于治疗勃起功能障碍的脂肪间充质干细胞
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术当中的干细胞应用技术，尤其是涉及一种用于治疗勃起功能 障碍的脂肪间充质干细胞。
【背景技术】
[0002] 男性勃起功能障碍(ED)是一种严重威胁男性，尤其是老年男性健康的疾病之一， 在老年人和糖尿病以及心血管疾病患者当中，发病率非常的高。随着研究的深入，研究者发 现ED与多种代谢疾病及外伤有关，ED已经成为糖尿病患者一种主要的并发症，糖尿病会引 发阴茎海绵体动脉的粥样斑块形成，导致血流量减少，海绵体内的小动脉和窦状隙内皮细 胞的结构或功能破坏，影响勃起功能，导致疾病的发生。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种方案，从而能够解决上述问题中的至少一个。
[0004] 根据本发明的一个方面，提供了一种方案，利用脂肪间充质干细胞用于制造脂肪 间充质干细胞的悬液，该悬液具有在制造注射液中的用途，其中，注射液可以用于治疗包括 人在内的雄性动物勃起功能障碍。尤其适用于治疗包括人在内的雄性动物因糖尿病而引发 的勃起功能障碍。
[0005] 脂肪间充质干细胞(ADSC)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，具有取材容 易，培养简单，增殖迅速的优点，成为再生医生中重要的一种种子细胞。
[0006] 出乎意料的是，通过实验研究发现，在雄性动物的阴茎根部注射脂肪间充质干细 胞的悬液后，可以有效的改善其勃起功能障碍。
[0007] 在一些实施方式当中，脂肪间充质干细胞来源可从待治疗的动物或人体自体获 得。其有益效果是，直接从待治疗的生物体的自体当中提取脂肪间充质干细胞，可以减少操 作的复杂性，取材方面，同时自体提取的脂肪间充质干细胞，也可以一定程度上防止出现生 物排异现象。
[0008] 本发明通过脂肪间充质干细胞的移植，可以用于治疗雄性动物的ED障碍疾病，其 实质是提供了一种脂肪间充质干细胞的移植新方向。
【附图说明】
[0009] 图1为各实验组的阴茎尺寸对比图；
[0010] 图2为各实验组治疗前后的勃起次数对比图；
[0011] 图3为各实验组eNOS免疫荧光检测对比图；
[0012] 图4为各实验组e-NOS蛋白表达量对比图；
[0013] 图5为各实验组e-N0S/f3_actin蛋白表达灰度比的对比图；
[0014] 图6为各实验组透射电子显微镜观察结果的对比图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0016] 本发明当中使用脐带间充质干细胞(BM)和磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照组，通过 阿朴吗啡(ΑΡ0)来诱导大鼠勃起功能、血管源性一氧化氮合酶(eNOS)表达、海绵体内微血管 再生数量和阴茎海绵体内组织形状等方法，来评估脂肪间充质干细胞(ADSC)在改善雄性动 物的勃起功能障碍方面的功效。
[0017] 材料准备
[0018]雄性GK模型大鼠（10周龄)30只，正常SD大鼠（14周龄）10只，成人脂肪间充质干细 胞，脐带间充质干细胞，阿朴吗啡(ΑΡ0)，维生素 C注射液，4%多聚甲醛(PA)，组织蛋白提取 液，血管源性一氧化氮合酶(eNOS)抗体，戊巴比妥钠，HE染液，苯胺蓝染液，1 %锇酸，2 %戊 二醛。
[0019]实验方法 [0020] 一、模型制备和筛选
[0021] 10周龄的GK雄性大鼠在电刺激阴茎海绵体神经时，海绵窦内压（ICP)结果显示出 有明显的勃起功能障碍即为合格的实验对象，实验中可以选用阿朴吗啡(ΑΡ0)来进行辅助 筛选。
[0022] 30只GK雄性大鼠分成3组，每组10只。分别为脂肪间充质干细胞组(AD组）、脐带间 充质干细胞组(BM组），磷酸盐缓冲液组(PBS组）。
[0023] 二、阿朴吗啡(ΑΡ0)的配制
[0024] 采用无菌注射器抽取维生素 C注射液(2ml*0.1g)2ml，注入498ml生理盐水中溶解， 即配制成0.2mg/ml的Vc溶液，然后分装入瓶备用，用分析天平称取ΑΡ0共4mg，充分溶解于 100m 1制得的Vc溶液当中，即配制成为40mg/m 1的ΑΡ0溶液。
[0025]三、干细胞的移植
[0026] 选择脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞各1*107个和lml PBS重悬备用。将实 验组的30只大鼠全部经过戊巴比妥钠麻醉后暴露阴茎。其中，AD组的大鼠在阴茎根部每只 注射100ul脂肪间充质干细胞的细胞悬液，BM组的大鼠在阴茎根部每只注射100ul脐带间充 质干细胞的细胞悬液，PBS组的大鼠在阴茎根部每只注射100ul磷酸盐缓冲液。
[0027] 四、术后的观察及指标检测
[0028] 1、阴茎形态的直观统计:术后4周，将大鼠进行麻醉后暴露阴茎，测量并统计非勃 起状态下阴茎外观尺寸，包括长度、根部直径、中段直径、龟头直径，同时选用10周龄的可以 正常进行勃起的大鼠（Ctrl组)作为对照。
[0029]如图1所示，采用了脂肪间充质干细胞的AD组的阴茎长度增长明显，说明采用了脂 肪间充质干细胞后，可以有效的促进阴茎的增长、增大和增粗。
[0030] 2、阿朴吗啡(ΑΡ0)诱导大鼠勃起:在进行干细胞移植前和干细胞移植4周后，分别 使用阿朴吗啡(ΑΡ0)诱导大鼠阴茎勃起。实验开始前先将大鼠放入实验透明塑料笼当中（尺 寸26cm* 18cm* 18cm)，并保持安静，使其适应环境10min，记录勃起次数，勃起率是各组当中 有勃起现象的大鼠个数/该组大鼠的总数，再乘以100%，同时选用14周龄正常的大鼠作为 对照。
[0031]如图2所示，采用了脂肪间充质干细胞的AD组在治疗前后的勃起次数增长明显，说 明采用了脂肪间充质干细胞，可以明显的改善大鼠的勃起功能，增加勃起次数。
[0032] 3、血管源性一氧化氮合酶(eNOS)表达:其中一氧化氮合酶(N0)是一种重要的信号 分子，其主要作用于血管平滑肌细胞，N0可以促使血管平滑肌细胞舒张，动脉血管扩张，血 流灌注增加。血管源性一氧化氮合酶(eNOS)是主要的N0来源，其在组织中的含量与勃起功 能直接相关。
[0033] ΑΡ0实验完成后，每组随机挑选5只动物用4%PA灌注固定，固定取材后的组织经 30 %蔗糖脱水后做冰冻切片（10um)。待切片完全干燥后做免疫荧光染色，eNOS阳性信号为 细胞内的荧光颗粒。每张切片随机选择10个视野做半定量观察：阳性率为〇%_1〇%定义为 阴性信号(-)、阳性率为10%-50%定义为弱阳性信号( + )、阳性率为50%-75%定义为较强 阳性信号(++)、阳性率为75%以上定义为强阳性信号(+++)，同时选用14周龄的正常大鼠作 为对照。
[0034]如图3所示，采用了脂肪间充质干细胞的AD组大鼠的细胞内的荧光颗粒明显多于 其它对照组。说明采用了脂肪间充质干细胞，可以明显的增强大鼠的动脉血管扩张，血流灌 注增加，从而提升勃起的效果。
[0035] ΑΡ0实验完成后，对每组剩余的5只大鼠断颈处死，取部分中间段阴茎组织，加入适 量预冷的蛋白萃取液，于4°C环境当中均浆，提取组织蛋白。提取的蛋白变性后做Wersten Blot，用于检测组织中eNOS的表达量，用β-actin做为内参，同时选用14周龄正常大鼠做为 对照。
[0036] 如图4和图5所示，其中图4为e-N0S蛋白表达量对比图，图5为e-NOS/0-actin蛋白 表达灰度比的对比图。从图4和图5当中，可以看出，采用了脂肪间充质干细胞的AD组大鼠的 组织当中的eNOS的表达量明显增加，从而可以明显的增强大鼠的动脉血管扩张，血流灌注 增加，从而提升勃起的效果。
[0037] 4、阴茎海棉体组织切片染色：糖尿病可以引起阴茎细胞的凋亡增加，阴茎动脉官 腔变小和管壁增厚，海绵体组织中胶原成分增加，继而发生组织纤维化，这是糖尿病引发勃 起功能障碍的结构基础。
[0038] ΑΡ0实验完成后，大鼠阴茎组织固定脱水后做石蜡切片，再对切片做HE染色，每个 标本随机选取20个视野做半定量观察，统计海绵体组织中毛细血管再生数量及血管半径。 [0039]表1、HE染色显微镜下观察计数血管数目
[0040]
[0041] 从表1当中，可以看出，采用了脂肪间充质干细胞的AD组大鼠的组织当中血管数目 相对于BM治疗组而言，数量有所增长。血管数目增长从而可以明显的增强大鼠的动脉血流 灌注增加，从而提升勃起的效果。
[0042]另外，取适当的切片，用苯胺蓝对组织中的胶原纤维染色，比较各组中纤维化水 平。
[0043] 5、透射电子显微镜检查：大鼠完成ΑΡ0实验后处死，取阴茎中段组织于2%戊二醛 中固定，PBS清洗后换成1%锇酸室温固定2h，清洗后脱水处理，包埋并做超薄切片，经过醋 酸铀和枸橼酸铅双染色后观察海绵体组织中平滑肌细胞的形态。
[0044]如图6所示，采用了脂肪间充质干细胞的AD组大鼠的海绵体组织中平滑肌细胞明 显舒张膨大。说明采用了脂肪间充质干细胞，可以明显的增强大鼠的海棉体组织，从而提升 勃起的效果。
[0045]以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。
【主权项】
1. 脂肪间充质干细胞用于制造脂肪间充质干细胞的悬液，该悬液在制造注射液中的用 途，所述注射液用于治疗包括人在内的雄性动物勃起功能障碍。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述注射液用于治疗包括人在内的雄性动 物因糖尿病而引发的勃起功能障碍。3. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞来源可从待治 疗的动物或人体自体获得。
【文档编号】A61K35/28GK105902568SQ201610280021
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】张宁, 王铁, 朱建斌, 邱伟勤, 焦阳
【申请人】张宁, 苏州瑞思坦医疗技术有限公司