专利名称：海藻培养中提高脂质和ω－3脂肪酸产量的方法
表3用L-半乳糖作为底物进行微量静止反应
L-GaLL-半乳糖酸-1，4-内酯；L-GaAL-半乳糖酸；++超过10mM；+10mM或更少；nd无法探测到。
参考文献W.Yongmanitchai和O.P.War(1989；omega-3 fattyocidsalternative sources of production；Proc.Biochem 24117-125)和J.K.Volman等。(1989；Fatty acid and lipid composition of 10species of microalgae used in mariculture；J.Exp.Mar.Biol.Ecol.128219-240)根据那些已知含有丰富脂肪酸的种类，如Crypthecodinium cohnii，已经初步建立了微藻生产PUFAs的海水养殖业。
微藻的脂质含量，例如PUFAs，根据其培养条件而变化。然而，为获得藻类中的这种浓度(concentration)脂肪酸而优化的条件不能相比于培养中藻类生长的那些必要条件。因此，富含如脂肪酸的脂质的藻类培养，只能在低浓度下得以实施。
因此，本发明优势在于通过减少培养容积来获得相同的PUFAs产量，从而提供高浓度生产PUFAs的方法。
发明概述本发明的一个目的是提供生产PUFAs的新方法，以获得高浓度的脂质。
根据本发明，通过抑制细胞分裂及其培养物生长、以获得富集脂质培养物，来提供生产PUFAs的方法。
然而根据本发明，提供从藻类生产多不饱和脂肪酸的方法，其步骤包括至少在藻类培养中应用生长限制因子、引起所述藻类培养分裂停止和通过培养的藻类生产和贮存多不饱和脂肪酸。
生长限制因子可以是例如缺乏(deprivation)硅酸盐的其他营养缺乏或例如光强度的物理因素。本发明的一个实施方案中，可同时地或并发地应用多种生长限制因子。实施本发明方法的优选藻类是硅藻(diatomaceous)Chaetoceros gracilis或硅藻Skeleonema costatum。
在本发明的一个实施方案中，在指数生长期的末期应用生长限制因子，优选藻类培养物达到至少107细胞/毫升的浓度的时候。在特定的时间点抑制培养中藻类细胞的分裂，以获得富含PUFAs、更具体是ω-3脂肪酸的藻类。
发明详述在适合生长的温度、pH和光照条件下以半连续方法培养藻类。更具体地，优选在温度18至20℃、pH7.5至8.0和培养瓶仅一侧光照的条件下培养藻类。通过Cool-whiteTM和GrowliteTM荧光灯在光强60至250uE s-1m-2的变化来提供光照。光周期为16小时光照循环，随即8小时黑暗。培养中用的水以在1μm条件下过滤并80℃灭菌。
在预实验中，将2-3ml原始藻类接种体加至含75ml f/2培养基(Guillard，R.，1975；Culture of phytoplankton for feediag marineinvertebrates inSmith，W.L.，Chanley，M.H.(Eds.)，Culture ofmarine invertebrates animals，(海洋无脊椎动物的培养)，Plenum出版社，纽约，pp.29-60)的125ml锥形瓶中。在接种七天后，将锥形瓶内含物转入含300ml f/2培养基的500ml锥形瓶容器中。五天后，将500ml锥形瓶内含物转入20升的培养瓶。在125和500ml锥形瓶的培养期间，培养物中不加入特殊的额外元素或营养物。
将8ml f/2培养基与18升水加入20升的培养瓶中。两天后，加入4ml硅酸盐和，在另外的3天后，将20升培养瓶的内容物转入7英尺高、170升的培养管中。然后将62ml f/2培养基和31ml硅酸盐加入此后用水充满的培养管中。根据生长的种类，每隔一天加入含或不含硅酸盐的营养物。在20升和170升的培养瓶或管中，以0.2至0.3L/min的速率加入过滤空气和CO2。
在170升管中培育6-7天后，藻类培养物进入其指数生长期的末期，这样达到最大浓度。为了调节/改变藻类的代谢，只有在指数生长期的末期才通过缺乏其营养来胁迫藻类。对胁迫产生反应的藻类，停止分裂并开始贮存主要是PUFAs的脂质。合适的天然营养物或施加于藻类的环境胁迫取决于所培养的种类。对于某些种类，当其与未缺乏营养的同一藻类培养比较时，PUFAs的浓度几乎是其两倍。
根据本发明，发现了施加于藻类培养中胁迫，其引起藻类停止生长并开始贮存主要是PUFAs的脂质。施加于藻类培养的多种胁迫类型，例如在细胞培养中缺乏营养物的营养胁迫，或调节pH和/或光照条件的环境胁迫，以至于引起藻类停止生长/分裂。优选地，一旦藻类完成指数生长期，便对藻类施加胁迫，此时培养的藻类浓度为最佳。本领域技术人员不难理解为了获得尽量多的脂质，理想的是有最大浓度的藻类轮流生产最大浓度的脂质。然而，在本发明中，表明营养缺乏或其他方面胁迫藻类培养的会引起藻类停止生长/分裂和开始贮存脂质。
根据本发明，已检验了多种藻类并表明本发明的方法的确有效，并可获得富集脂质的藻类培养物。然而，本领域技术人员容易理解多种藻类在代谢过程中具有相同的变化，即停止(arrest)细胞分裂，以及提供相同重要的在PUFAs方面的增殖。
本发明通过以下涉及的用于举例说明本发明而不是限制其范围的实施例更容易地得到理解。
实施例1以大于107细胞/ml的浓度在170升的半连续系统中培养硅藻Chaetoceros gracilis。在一些培养管中补充完全营养物，而在其他培养管中缺乏硅酸盐。下文表2所示的结果表明脂肪酸按照所处理的分布。
表2不同培养条件所获得的多种脂肪酸的浓度
在胁迫(缺乏硅酸盐)开始7天后对培养条件进行分析。
实施例2在170升的半连续系统中培养硅藻Skeletonema costatum。在一些培养管中缺乏硅酸盐，而在其他培养管中维持完全营养。下文表3所示的结果表明脂肪酸按照所施加胁迫的分布。
表3相应缺乏硅的情况下多种脂肪酸的分布有硅酸盐 无硅酸盐％ ％205n3 16. 37.6226n3 5.5 7.54PUFA总量41.0 59.9n3总量 24.6 42.0这里再次，在缺乏硅酸盐开始7天后对培养条件进行分析。
在此给出的上述实施例用于说明但不限制本发明。根据本发明，在此其表明，在胁迫藻类培养并引起其分裂停止和生长降低的基础上，可增加脂肪和尤其是PUFAs和ω-3的产量。
对本发明以及其具体实施方案进行了描述，应当理解其能进一步进行修改，并且本申请包括所有的变化，用途或本发明下述的修改，总的来说，根据本发明的原理，以及包括在本领域已知的或常规技术对本说明书所作的这种改变都在本发明的范围之内，并且如上文所述的可适用于必要特征的内容，归入所附加的权利要求的范围之内。
权利要求
1.从藻类中生产多不饱和脂肪酸的方法，其包括下述步骤在藻类培养中至少应用生长限制因子，引起所述藻类培养的生长停止和通过培养中的藻类产生和贮存多不饱和脂肪酸。
2.权利要求1的方法，其中生长限制因子是硅酸盐缺乏。
3.权利要求1的方法，其中生长限制因子是营养物缺乏。
4.权利要求1、2或3的方法，其中应用一种以上的生长限制因子。
5.权利要求1、2、3或4的方法，其中藻类是diatomaceous Chaetocerosgracilis。
6.权利要求1、2、3或4的方法，其中藻类是diatomaceous Skeleonemacostatum。
7.权利要求1、2、3、4、5或6的方法，其中在指数生长期的末期应用生长限制因子。
8.权利要求1、2、3、4、5、6或7的方法，其中一旦藻类培养达到至少107细胞/ml的浓度时应用生长限制因子。
全文摘要
本发明涉及从藻类中生产多不饱和脂肪酸的新方法。方法包括至少在藻类培养中应用生长限制因子、引起所述藻类培养物生长停止和多不饱和脂肪酸通过在培养的藻类中产生和贮存的步骤。
文档编号C11C1/00GK1681934SQ03821618
公开日2005年10月12日 申请日期2003年7月22日 优先权日2002年7月22日
发明者雷琼·特伦布莱, 法布里斯·佩尼特, 埃德温·布格特 申请人:舍布鲁克大学, 拉瓦尔大学, 里瓦尔S.E.C.公司