一种保持生物活性医用胶原的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种保持生物活性的I型医用胶原材料的提取方法，其特点在于综合利用酸法、碱法和酶法，在严格控制温度、pH值、反应时间及控制蛋白酶用量的条件下，生产出保持胶原特有生物活性、低免疫原性、高生物相容性的高纯度医用胶原材料，该方法提取的医用胶原收率达到90％以上，纯度达到99％以上，且适合工业化大规模生产。该材料可用于生产高档止血材料、骨融合材料、组织再生膜片、注射美容用活性胶原溶液等。
【专利说明】一种保持生物活性医用胶原的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种保持生物活性的医用胶原的制备工艺及其应用。
【背景技术】
[0002]胶原是一种天然的生物大分子，来源丰富，去除其抗原所在的端肽后可加工制备成具有良好生物相容性的生物材料，国内外均投入了大量人力、物力开展医用胶原材料的研究。
[0003]胶原是细胞外基质(ECMs)的主要成分，具有独特的三螺旋结构，它不仅对组织和器官起支持和保护作用，而且参与介导一系列生物过程，包括细胞的粘附、迁移和分化以及组织再生，胶原的这些特殊生物学功能是通过膜受体、可溶性因子以及其它ECM组分等生物活性分子与胶原三螺旋结构的特异性结合来实现的。因此，对于胶原三螺旋结构和功能的研究己成为当今生物材料领域的热点。胶原的热变性过程是三螺旋结构连续发生变化的过程，随着温度的升高，三螺旋会发生解旋，并最终形成无规则的单条多肽链，这个过程可以归纳为“三螺旋一单体”的热变性过程。在这个过程中，稳定三螺旋结构的氢键作用力逐渐被破坏，胶原热变性后，三螺旋结构被完全破坏，并且该过程不可逆，去除其抗原所在的端肽后可加工制备成具有良好生物相容性的生物材料。
[0004]胶原利用其独特的三螺旋结构不仅能够形成一个表面，允许细胞以及其它酶类或者生物活性因子与其相结合，而且这种螺旋状的构造包含着信息，使得生物体的生理环境得以有条不紊地运行。
[0005]胶原的三股螺旋是一种能容纳胶原蛋白特有的氨基酸组成和序列的结构。生物医用材料的研究和临床应用已从第一代生物惰性材料、第二代生物活性材料及生物可降解材料发展到基于细胞和分子水平的第三代生物材料，第三代生物材料的一个重要研究方向是模拟细胞外基质环境，在材料上引入特殊的蛋白质、多肽以及其他生物分子，使材料在分子水平上刺激细胞产生特殊应答反应，引起细胞整合素的相互作用，诱导细胞增殖、分化以及细胞外基质的合成与组装，从而启动机体的再生系统，并且对于动物体的热平衡发挥着重要的调节作用。另外胶原具有良好的生物相容性，是研究和应用广泛的生物医用材料，如组织工程支架、可吸收缝合线、组织引导再生隔膜等，但如何通过常规手段获得保持这种具有活性的三螺旋结构的胶原以及利用这种胶原制备生物相容性医用材料是人们追求的目标。
【发明内容】
[0006]本发明人经过反复试验，并经紫外光谱、红外光谱及电镜测试，结果证明本发明制备方法制备的I型胶原完整的保存了胶原的三螺旋结构，并有效去除端肽，降低了胶原的免疫原性,使其具有更好的生物相容性。
[0007]本发明的目的在于提供一种抗原性低、保持生物活性具备三螺旋结构的I型医用胶原的制备方法。[0008]本发明的又一目的在于提供一种以本发明的I型医用胶原为原料制备而成的骨融合生物材料以及这种骨融合生物材料的制备方法，所制备的骨融合生物材料可用于骨缺损损伤部位的修复。
[0009]本发明的另一目的在于提供一种以本发明的I型医用胶原为原料的生物组织再生膜及其制备方法，所制备的生物膜片不仅可用于高档止血材料，同时也可用于皮肤及脑膜再生领域。
[0010]本发明保持胶原生物活性的制备方法具有提取收率高、抗原性低的特点，普通的提取方法得到的可溶性纯胶原收率只能达到10-20%，一般只能用于实验室研究，而本发明所提取活性胶原的收率可以达到90%以上，极大的提高了动物组织的利用率，适合大规模工业化生产。
[0011]本发明的保持生物活性具备三螺旋结构的I型生物胶原可由下述方法步骤制备:
[0012]I)、原料前处理:选取新宰杀牛的牛跟腱，运输过程在冰水中保存，到达加快处理地后，立即加工处理，用剪刀去除多余组织，放置于-20度冰箱中冷冻，后用刀片刮去表面多余的筋膜，用铝箔捆扎成IOmm大小圆柱状，放置于冰箱中冷冻存放，备用。
[0013]2)、胶原提取:
[0014]A、取冷冻后的牛跟腱，切制成0.5毫米左右的薄片，用组织破碎机粗碎后，用5% -20%的NaCl溶液浸泡15_30min，再用加入0.5%的KH2PO4，在0-5°C的溶液浸泡l_3h，用纯化水冲洗至PH值为中性，后加入乙醇和三氯乙烷混合液(I: I)浸泡，在缓慢搅拌条件下脱脂1-3小时，得预处理原料。
[0015]B、原料用纯化水冲洗后加入含23% NaCl-0.05mol/L Tris-HCl (PH值7.5)缓冲液浸泡3h，期间随时吸取液面上的油脂，至无脂质浮在液面。
[0016]C、后用组织破碎机进行细碎，调节溶液PH值至6.8，加入1: 100无花果蛋白酶，4°C条件下，二十分钟搅拌一次，处理5小时，反复冲洗后用I %的H2O2处理4h后清洗。
[0017]D、将以上所得胶原加入饱和NaCl溶液中(PH7.0-7.2)，在4°C条件下静置6-24小时，后加入IM的NaOH溶液和0.5M氯化铵溶液浸泡，15_20°C条件下静置36小时，最后用HCl进行中和，调节PH值至7.2，搅拌条件下用纯化水冲洗3次，再用pH为6.8的注射用水在5°C温度下浸泡3小时，滤过，除去多余水份，冷冻保存，即得。
[0018]以本发明制备方法制备的I型医用胶原为原料制备生物止血膜可由以下方法制成:
[0019]1、冻干:将所得胶原按3% (质量分数)比重加入到0.5M冰醋酸溶液中，用在线式高速均质机分散2-3遍，其温度控制在10°C以下，分散后的液体真空去除气泡，放入冷冻干燥机冻干托盘，使厚度在4-6mm，在零下5°C (-5°C )至_15°C预冻2小时，再在_45°C至-55°C冻干30小时，在-10°C度升华15小时，15°C二次升华3小时，即得本发明的生物膜。
[0020]2、加强:将膜片浸泡于3%的京尼平溶液中6小时，进行化学交联后，放入真空干燥箱，90-110°C真空干燥15-20小时。
[0021]3、灭菌:将所得膜片用铝塑复合膜进行双层包装，将包装后的产品用伽马射线进行灭菌处理，即得。
[0022]所得膜片不仅可用于高档止血材料，同时也可用于皮肤及脑膜再生领域。
[0023]以本发明制备方法制备的I型医用胶原为原料制备骨融合医学材料可用以下方法制备:将胶原溶于含0.1 % -1 %的有机酸(柠檬酸或冰醋酸)水溶液中，调节pH值至
2.0-5.0，采用高速剪切机进行分散，期间温度控制在0°C _5°C，分散好后分别加入与胶原重量份比例为1: 50-100: 50-100的磷酸三钙和羟基磷灰石，再进行分散，混合均匀，灌装，灭菌，即得。
[0024]以本发明制备方法制备的I型医用胶原为原料制备外用皮肤抗衰美容霜可由以下方法制成:将本发明的I型医用胶原溶于柠檬酸中，经高速剪切机分散，再用超高压均质机将分散后的胶原液进行纳米级破碎，即得到可透皮吸收的活性纳米胶原，与其他辅料混合，按常规护肤用乳剂制成护肤品即得。
【具体实施方式】:
[0025]实施例1
[0026]本发明的I型胶原的制备方法。
[0027]1、原料前处理:选取新宰杀牛的牛跟腱，运输过程在冰水中保存，到达现场后，用剪刀去除多余组织，放置于-20度冰箱中冷冻，后用刀片刮去表面多余的筋膜，用铝箔捆扎成IOmm大小圆柱状，放置于冰箱中冷冻存放，待用。
[0028]2、胶原提取:
[0029]I)将冷冻·后的牛跟腱lOOOg，切制成I毫米厚的薄片，用5%的NaCl溶液浸泡20min,用0.5%的KH2P4，温度5°C浸泡2h，用纯化水冲洗至PH值为中性，后加入乙醇和三氯乙烷混合液(I: I)浸泡，在缓慢搅拌条件下脱脂I小时，得预处理原料950g。
[0030]2)用纯化水冲洗后加入含23% NaCl-0.05mol/L Tris-HCl (PH值1.5)缓冲液浸泡3h，期间随时吸取液面上的油脂，至无脂质浮在液面。
[0031]3)后用组织破碎机将片状跟腱进行破碎，调节溶液PH值至6.8，加入1: 100无花果酶，4°C条件下缓慢搅拌5小时，反复冲洗后用1%的H202处理4h后清洗。
[0032]4)将以上所得胶原加入饱和NaCl溶液中(PH7.2)，在4度条件下静置12小时，后加入IM的NaOH溶液和0.5M氯化铵溶液浸泡，15度条件下静置36小时，最后用HCl进行中和，调节PH值至7.2，搅拌条件下用纯化水冲洗3次，再用PH为6.8的注射用水，5°C浸泡3小时，去除多余水份，得到910克纯胶原。
[0033]实施例2
[0034]本发明的生物膜的制备
[0035]将本发明的I型医用胶原经分散乳化后冻干，再高温物理交联，包装、灭菌，即得。具体如下:
[0036]1、冻干:将所得胶原按3% (质量分数)比重加入到0.5M冰醋酸溶液中，用在线式高速均质机分散2-3遍，其温度控制在10°C以下，分散后的液体真空去除气泡，放入冷冻干燥机冻干托盘，使厚度在4-6mm，在零下5°C (-5°C )至_15°C预冻2小时，再在_45°C至-55°C冻干30小时，在-10°C度升华15小时，15°C二次升华3小时，即得本发明的生物膜。
[0037]2、加强:将膜片浸泡于3%的京尼平溶液中6小时，进行化学交联后，放入真空干燥箱，90-110°C真空干燥15-20小时。
[0038]3、灭菌:将所得干燥后的膜片用铝塑复合膜进行双层包装，将包装后的产品用伽马射线进行灭菌处理，即得本发明的生物膜。[0039]实施例3
[0040]本发明的注射用骨融合材料的制备
[0041]将本发明的I型医用胶原溶于有机酸中(柠檬酸或冰醋酸)，经高剪切分散后，与一定比例的磷酸三钙和羟基磷灰石均匀混合，包装，灭菌，即得。具体如下:
[0042]1、分散:取1000ml注射用水，加入0.5%冰醋酸，调节PH值至3.2，后加入6g胶原，用高速分散机在21000转/分的条件下搅拌4个小时，期间温度控制在3-5°C。
[0043]2、混合:取灭菌后的磷酸三钙400g、羟基磷灰石600g，加入到上述分散好的胶原液中，用分散机混合均匀。
[0044]3、包装:将所得混合物封装在IOml注射器中，密封包装。
[0045]4、灭菌:包装后的产品用伽马射线进行灭菌处理，即得本发明的注射性骨融合材料。
[0046]实施例4
[0047]本发明的皮肤抗衰老霜的制备
[0048]将本发明的I型医用胶原溶于柠檬酸中，经高剪切分散，再用TIS超高压均质机将分散后的胶原液进行纳米级破碎，得到可透皮吸收的活性纳米胶原，与其他辅料混合做成除皱抗衰霜，具体如下:
[0049]配方:
[0050]配料名称:含量(％ Wt)
[0051]1、维生素A棕榈酸脂1.00
[0052]2、维生素E乙酸脂0.5
[0053]3、(山嵛酰乳酰乳酸钠) 1.5
[0054]4、十六十八醇(50/50) 3.00
[0055]5、单甘酯2.60
[0056]6、棕榈酸异丙酯4.00
[0057]7、高级橄榄油5.00
[0058]8、去离子水69.20
[0059]9、甘油3.00
[0060]10、DMDM 乙内酰脲0.20
[0061]11、抗坏血酸磷酸酯镁盐和卵磷酯6.00
[0062]12、活性纳米胶原3.00
[0063]13、棕榈酰羟化小麦蛋白1.00
[0064]工艺:
[0065]1、按配方量称取原料1-7，加入不锈钢桶内搅拌，混合均匀，加热至80C，制成油相。
[0066]2、再取配方量甘油，加入到去离子水中，在不锈钢桶内混合搅拌，加热至80C，制成水相。
[0067]3、将制好的水相倒入高速均质罐内，再将油相加入，启动高速均质机均质两遍，冷却至25°C，再加入DMDM乙内酰脲、抗坏血酸磷酸酯镁盐和卵磷酯、纳米胶原和棕榈酰羟化小麦蛋白，15°C低温条件下用高剪切进行均质搅拌120分钟，得到纯白色膏状抗衰老霜。[0068]4、将所得霜膏在15-25°C条件下加入灌装机，进行灌装，封口。
[0069]5、将灌装好的膏液瓶送至外包装间，贴标、装盒，即得成品。
[0070]经实验测试，用此方法制成的胶原化妆品因含活性胶原成分，透皮吸收后，能够在皮下形成新的网状胶原支架，帮助新的皮下细胞再生，能有效的去除因皮肤衰老而产生的皱纹，经临床验证，效果非 常明显。
【权利要求】
1.一种保持生物活性I型医用胶原材料的制备方法，其特征在于: 1)、原料前处理:选取新宰杀牛的牛跟腱，运输过程在冰水中保存，到达加快处理地后，立即加工处理，用剪刀去除多余组织，放置于-20度冰箱中冷冻，后用刀片刮去表面多余的筋膜，用铝箔捆扎成10_大小圆柱状，放置于冰箱中冷冻存放，备用。 2)、胶原提取: A、取冷冻后的牛跟腱，切制成0.5-2毫米厚的薄片，用5% -20%的NaCl溶液浸泡15-30min，再用0.5%的KH2P4温度在0_5°C的溶液浸泡I_3h，用纯化水冲洗至PH值为中性，后加入乙醇和三氯乙烷混合液(I: I)浸泡，在缓慢搅拌条件下脱脂1-3小时，得预处理原料。 B、原料用纯化水冲洗后加入含23%NaCl-0.05mol/L Tris-HCl (PH值7.5)缓冲液浸泡3h，期间随时吸取液面上的油脂，至无脂质浮在液面。 C、后用组织破碎机将片状跟腱进行破碎，调节溶液PH值至6.8，加入1: 100无花果酶，4°C条件下缓慢搅拌5小时，反复冲洗后用I %的H2O2处理4h后清洗。 D、将以上所得胶原加入饱和NaCl溶液中(PH7.0-7.2)，在4°C条件下静置6_24小时，后加入IM的NaOH溶液和0.5M氯化铵溶液浸泡，15_20°C条件下静置36小时，最后用HCl进行中和，调节PH值至7.2，搅拌条件下用纯化水冲洗3次，再用pH为6.8的注射用水在5°C温度下浸泡3小时，滤过，除去多余水份，冷冻保存，即得。
2.一种生物止血膜，其 特征在于:它是由权利要求1制得的具有生物活性保持胶原三螺旋结的胶原为原料制备而成。
3.—种生物止血膜的制备方法，其特征在于:它是由权利要求1制得的具有生物活性保持胶原三螺旋结的胶原为原料通过下述方法制备而成: 1)、冻干:将胶原按3%(质量分数)比重加入到0.5M冰醋酸溶液中，用在线式高速均质机分散2-3遍，温度控制在10°C以下，分散后的液体真空去除气泡，放入冷冻干燥机冻干托盘，使厚度在4-6mm，在零下5°C至零下15°C预冻2小时，再在_45°C至_55°C冻干30小时，在-10°C度升华15小时，15V二次升华3小时，备用； 2)、加强:将膜片浸泡于3%的京尼平溶液中6小时，进行化学交联后，放入真空干燥箱，90-110°C真空干燥15-20小时。 3)、灭菌:将所得膜片用铝塑复合膜进行双层包装，将包装后的产品用伽马射线进行灭菌处理，即得。
4.一种生物骨融合医学材料，其特征在于:它是由权利要求1制得的具有生物活性保持胶原三螺旋结的胶原为原料制备而成。
5.一种生物骨融合医学材料的制备方法，其特征在于:它是由权利要求1制得的具有生物活性保持胶原三螺旋结的胶原为原料通过下述方法制备而成:将胶原溶于含0.1% -1 %的有机酸(柠檬酸或冰醋酸)水溶液中，调节pH值至2.0-5.0，采用高速剪切机进行分散，期间温度控制在0°C _5°C，分散好后分别加入与胶原重量份比例为I: 50-100: 50-100的磷酸三钙和羟基磷灰石，再进行分散，混合均匀，灌装，灭菌，即得。
6.一种皮肤抗衰美容霜，其特征在于:它是由权利要求1制得的具有生物活性保持胶原三螺旋结的胶原为原料制备而成。
7.一种皮肤抗衰美容霜的制备方法，其特征在于:它是由权利要求1制得的具有生物活性保持胶原三螺旋结的胶原为原料通过下述方法制备而成:将本发明的I型医用胶原溶于柠檬酸中，经高速剪切机分散，再用超高压均质机将分散后的胶原液进行纳米级破碎，即得到可透皮吸收的保持三螺旋结构的活性纳米胶原，与其他辅料混合，按常规护肤用乳剂制成护肤 品即得。
【文档编号】A61Q19/08GK103566409SQ201210262253
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月27日 优先权日:2012年7月27日
【发明者】高广田 申请人:高广田