一种米酒酒糟提取物及其制备方法和应用的制作方法

一种米酒酒糟提取物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种米酒酒糟提取物的制备方法及其制得的提取物和所述提取物的应用。所述制备方法包括步骤：（1）米酒酒糟二次发酵：往米酒酒糟中加入水发酵得料液1；（2）酶解：往步骤（1）所得的料液1中加入蛋白酶和糖苷水解酶进行酶解后过滤，得料液2；（3）纯化和浓缩：将步骤（2）所得的料液2进行脱色、脱臭后过滤，得料液3，将料液3进行浓缩，即得米酒酒糟提取物。所述制备方法还可以包括步骤（4）或步骤（4’）时，即相应制得米酒酒糟提取物的干粉或米酒酒糟提取物的液体制剂。本发明对米酒酒糟的利用全面和综合，大大提高了米酒酒糟的经济价值。
【专利说明】一种米酒酒糟提取物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种米酒酒糟提取物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]米酒中含有10多种氨基酸，其中8种是人体自身不能合成而又必需的氨基酸。《本草纲目》里记载，米酒可以开胃健脾、促进消化、除湿气、润皮肤、活血化游，是男女老少皆宜的营养品。近代的研究表明，米酒有美容养颜、活气养血的功效。
[0003]米酒酒糟是米酒酿造过程中的副产品。以稻米为原料的米酒酒糟中不仅含有未被发酵利用的稻米，而且还有大量的酵母。稻米中含有各种大小不同的肽，这些肽具有一定的抗氧化活性，对DPPH自由基具有较高的清除能力。酵母经破壁提取后可以获得其中的氨基酸、肽、核酸、维生 素等对人体具有滋养功效的天然活性成分。其中包括:氨基酸是皮肤角质层中自然保湿因子(NMF)的主要成分，易被皮肤吸收；寡肽类物质可加速皮肤真皮层中成纤维细胞合成胶原蛋白和弹性蛋白的速度，使老化的表皮恢复弹性，延缓皮肤衰老；核酸及核苷酸是人体的主要遗传物质，具有促进新陈代谢、提高蛋白质合成速度等作用。
[0004]我国是米酒生产和消费大国，米酒酒糟量大而集中，如果不及时加以处理，就会腐败变质，不仅浪费了宝贵的资源，还会严重污染周围环境。因此，对酒糟进行有效的综合利用对我国的资源开发和环境保护具有十分重要的意义。

【发明内容】

[0005]本发明所要解决的技术问题是针对目前对米酒酒糟尚缺乏有效利用的方法，一般都是直接丢弃或者作为养殖饲料和食用菌栽培原料，利用价值比较低的现状，而提供一种米酒酒糟提取物及其制备方法和应用。
[0006]本发明提供的技术方案之一是:一种米酒酒糟提取物的制备方法，其包括如下步骤:
[0007](I)米酒酒糟二次发酵:往米酒酒糟中加入水发酵得料液1，所述水的添加量为I~20mL/g米酒酒糟，所述发酵的温度为20~50°C，所述发酵的时间为2~48小时；
[0008](2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入蛋白酶和糖苷水解酶进行酶解后过滤，得料液2，所述蛋白酶的添加量为I~5g/L料液1，所述糖苷水解酶的添加量为I~5g/L料液1，所述酶解的温度为20~65°C，所述酶解的时间为I~16小时，所述蛋白酶的酶活为20~150万U/g，所述糖苷水解酶的酶活为20~150万U/g ；
[0009](3)纯化和浓缩:将步骤(2)所得的料液2进行脱色和脱臭处理后采用截留分子量为1500~2500道尔顿的超滤膜过滤，得料液3，将料液3进行浓缩，即得米酒酒糟提取物。
[0010]本发明中，步骤(1)中所述的米酒酒糟为本领域常规所述，一般指稻米(如糯米、粳米或籼米)等原料在酵母发酵工艺下进行制酒的过程中，将体系中的发酵液过滤后所剩余的残渣，为制备米酒所得到的副产物，其中富含酵母菌、未被酵母菌发酵利用的原料以及酵母发酵产物。[0011]本发明中，步骤(1)中所述的水为本领域常规所述，只要满足发酵工艺常规的洁净度要求即可，较佳地为蒸馏水。
[0012]本发明中，步骤(1)中所述发酵为将米酒酒糟进行二次发酵，以使米酒酒糟中剩余的物料得到更充分的分解利用，同时使米酒酒糟中含有的酵母菌得到充分增殖，并得到酵母菌的发酵产物。较佳地，所述水的添加量为3~15mL/g米酒酒糟，所述发酵的温度为25~45°C，所述发酵的时间为4~16小时。更佳地，所述水的添加量为4~10g/mL米酒酒糟，所述发酵的温度为32~40°C，所述发酵的时间为5~12小时。最佳地，所述水的添加量为3g/mL米酒酒糟，所述发酵的温度为40°C，所述发酵的时间为8小时。
[0013]本发明中，步骤(2)中所述的蛋白酶为本领域常规所述，较佳地选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合风味蛋白酶中的任一种。所述蛋白酶可以是常规市售的蛋白酶，如诺维信生物科技有限公司的碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合风味蛋白酶等均可以使用。所述的糖苷水解酶为本领域一般所述的糖苷水解酶，可以水解糖苷键，所述的糖苷水解酶较佳地选自葡聚糖酶或甘露聚糖酶。所述糖苷水解酶可以是常规市售的糖苷水解酶，如诺维信生物科技有限公司的葡聚糖酶或甘露聚糖酶等均可以使用。
[0014]本发明中，较佳地，步骤(2)中所述蛋白酶的添加量为2~4g/L料液1，所述糖苷水解酶的添加量为2~4g/L料液1，所述酶解的温度为35~60°C，所述酶解的时间为2~8小时。最佳地，步骤(2)中所述蛋白酶的添加量为3g/L料液1，所述糖苷水解酶的添加量为3g/L料液1，所述酶解的温度为55°C，所述酶解的时间为4小时。
[0015]如本领域技术人员所知，一般的酶解过程在结束后需要进行灭酶的操作，即将酶解反应体系于70~100°C下放置5~30min。因此，在本发明步骤(2)中，较佳地，所述酶解在结束后还包括灭酶的步骤，即将酶解反应体系于70~100°C下放置5~30min，以使反应体系中的蛋白酶和糖苷水解酶失活即可。
[0016]本发明中，步骤(2)中所述的过滤为本领域常规所述的过滤工艺，较佳地，所述过滤采用真空抽滤，其中过滤介质选择滤纸，并以硅藻土助滤。
[0017]本发明中，步骤(3)中所述的脱色和脱臭处理为本领域常规所述的脱色和脱臭处理工艺，一般指采用安全度符合要求的具有脱色和除臭功能的物质对反应体系进行处理以去除颜色和异味。较佳地，在步骤(3)中，所述脱色和脱臭处理为使用大孔树脂、硅藻土和活性炭中的任一种对体系进行处理，更佳地，所述脱色和脱臭处理为在料液2中加入0.5~8%的活性炭，于30~70°C下保温脱色、脱臭30~90分钟，所述百分比为活性炭占料液2的质量百分比。更佳地，所述脱色和脱臭处理为在料液2中加入I~3%的活性炭，于50~60°C下保温脱色、脱臭40~60分钟，所述百分比为活性炭占料液2的质量百分比。如本领域常规，所述脱色和脱臭处理的最后阶段一般都包括对反应体系进行过滤的步骤，以达到固液分离的目的，在过滤后收集所得滤液进行后续操作步骤。
[0018]本发明中，步骤(3)中所述的浓缩为本领域常规的浓缩处理工艺，一般指减少体系中的溶剂含量以提高溶液浓度的过程。较佳地，在步骤(3)中，所述浓缩为将料液3进行减压浓缩。
[0019]本发明中，在步骤(3 )之后较佳地还包括步骤(4 )或步骤(4 ’)；
[0020]所述步骤(4 )为:将步骤(3 )浓缩所得的浓缩液进行干燥，收集干燥所得的干粉即得米酒酒糟提取物的干粉；[0021]所述步骤(4’ )为:将步骤(3)浓缩所得的浓缩液与醇类混合得混合液，在所述混合液中加入防腐剂后采用0.2~0.25μπι微孔滤芯进行保安过滤，所得滤液即为米酒酒糟提取物的液体制剂。
[0022]本发明中，步骤(4)中所述的干燥为本领域常规所述的干燥工艺，如喷雾干燥、真空加热干燥等。本发明优选喷雾干燥。
[0023]本发明中，步骤(4’)中所述的醇类为本领域常规所述，优选丙二醇、丁二醇和乙醇中的任一种或多种，最优选丙二醇。所述醇类的用量为本领域常规所述，只要能充分混合所述浓缩液使成稳定的液体制剂即可，较佳地，所述醇类的用量为所述浓缩液体积的1/10~1/3。
[0024]本发明中，步骤(4’)中所述的防腐剂为本领域常规所述，一般是指加入后用以保持物质原有品质并抑制微生物繁殖从而达到延长保质期的一类添加剂，包括天然的和合成的防腐剂，只要安全性符合要求即可。本发明所述的防腐剂为一般的防腐剂即可，更优选自尼泊金酯、山梨酸、山梨酸钾和山梨酸钠中的一种或多种。所述防腐剂的用量为常规，根据不同防腐剂种类而定，如山梨酸、山梨酸钾或山梨酸钠的常规用量可为0.05%~0.15%，尼泊金酯类的常规用量可为0.01%~0.03%，所述百分比为防腐剂占混合液的质量百分比，如0.02%即指在100g混合液中加入0.02g防腐剂。
[0025]利用本发明所述的制备方法制得的米酒酒糟提取物主要由30%~95%的分子量小于1000道尔顿的寡肽、氨基酸和核苷酸组成，其物化性质能够满足化妆品和药品领域的使用要求。
[0026]本发明提供的技术方案之二是:如前所述的制备方法制备而得的米酒酒糟提取物。
[0027]本发明中，当前述制备方法优选地包括步骤(4)或步骤(4’)时，即相应制得米酒酒糟提取物的干粉或米酒酒糟提取物的液体制剂。
[0028]本发明提供的技术方案之三是:如前所述的米酒酒糟提取物、米酒酒糟提取物的干粉或米酒酒糟提取物的液体制剂在制备抗衰老、抗氧化、美白的化妆品和/或药物中的应用。
[0029]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0030]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0031]本发明的积极进步效果在于:本发明提供了一种从米酒酒糟中提取功效物质的方法，通过采用生物酶法技术、低温水解技术和脱色、脱臭技术等生产工艺，能够确保得到的米酒酒糟提取物的各项物化性质满足化妆品领域的使用要求，所述的米酒酒糟提取物具有良好的美白、抗衰老功效，可用于美白、抗衰老类护肤品。相比直接丢弃米酒酒糟会造成环境污染和浪费，或者传统的作为饲料或食用菌栽培原料利用价值低而言，本发明对米酒酒糟的利用全面和综合，大大提`高了米酒酒糟的经济价值。
【具体实施方式】
[0032]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0033]下述实施例中，所使用的碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合风味蛋白酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶购于诺维信生物技术有限公司，上述酶的酶活均为20~150万U/g。所使用的米酒酒糟购自上海相申调味品有限公司。
[0034]小牛血清购自上海尚谊化工科技有限公司。
[0035]DMEM培养基购自Hyclone公司。
[0036]人成纤维细胞购自四川省化妆品工程技术研究中心。
[0037]B16黑色素瘤细胞购自四川省化妆品工程技术研究中心。
[0038]HaCaT细胞购自四川省化妆品工程技术研究中心。 [0039]实施例1米酒酒糟提取物干粉的制备
[0040]制备步骤包括:
[0041](I)米酒酒糟二次发酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸馏水，在40°C下搅拌发酵4小时，得料液I ;
[0042](2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入lg/L料液I的复合风味蛋白酶和Ig/L料液I的β -葡聚糖酶，在55°C下酶解4小时后，将体系升温至80°C保温30min以灭酶，之后过滤，过滤后滤液澄清，即料液2 ；
[0043](3)纯化和浓缩:在料液2中加入占料液量质量百分比2%的活性炭，60°C，保温脱色、脱臭60min，将脱色、脱臭处理后的料液过滤，滤液再采用截留分子量为2000道尔顿的超滤膜过滤以去除大分子蛋白质，将所得滤液进行减压浓缩得浓缩液；
[0044](4)将步骤(3)所得的浓缩液喷雾干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0045]实施例2米酒酒糟提取物干粉的制备
[0046](I)米酒酒糟二次发酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸馏水，在40°C下搅拌发酵8小时，得料液I ;
[0047](2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入3g/L料液I的碱性蛋白酶和2g/L料液I的甘露聚糖酶，在55 C下酶解4小时后，将体系升温至80 C保温30min以灭酶，之后过滤，过滤后滤液澄清，即料液2 ；
[0048](3)纯化和浓缩:在料液2中加入占料液量质量百分比1%的活性炭，60°C，保温脱色、脱臭60min，将脱色、脱臭处理后的料液过滤，滤液再采用截留分子量为2000道尔顿的超滤膜过滤以去除大分子蛋白质，将所得滤液进行减压浓缩得浓缩液；
[0049](4)将步骤(3)所得的浓缩液进行真空加热干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0050]实施列3米酒酒糟提取物干粉的制备
[0051](I)米酒酒糟二次发酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸馏水，在40°C下发酵12小时，得料液I ;
[0052](2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入2g/L料液I的中性蛋白酶和2g/L料液I的甘露聚糖酶，在55 C下酶解4小时后，将体系升温至80 C保温30min以灭酶，之后过滤，得料液2 ;
[0053](3)纯化和浓缩:在料液2中加入占料液量质量百分比1%的活性炭，60°C，保温脱色、脱臭60min，将脱色、脱臭处理后的料液过滤，滤液再采用截留分子量为2000道尔顿的超滤膜过滤以去除大分子蛋白质，将所得滤液进行减压浓缩得浓缩液；[0054]实施例4米酒酒糟提取物干粉的制备
[0055]制备步骤包括:
[0056](I)米酒酒糟二次发酵:往300g米酒酒糟中加入300ml蒸馏水，在50°C下搅拌发酵2小时，得料液I ;
[0057](2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入lg/L料液I的复合风味蛋白酶和5g/L料液I的β -葡聚糖酶，在20°C下酶解16小时后，将体系升温至80°C保温30min以灭酶，之后过滤，过滤后滤液澄清，即料液2 ；
[0058](3)纯化和浓缩:在料液2中加入占料液量质量百分比5%的活性炭，60°C，保温脱色、脱臭60min，将脱色、脱臭处理后的料液过滤，滤液再采用截留分子量为1500道尔顿的超滤膜过滤以去除大分子蛋白质，将所得滤液进行减压浓缩得浓缩液；
[0059](4)将步骤(3)所得的浓缩液喷雾干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0060]实施例5米酒酒糟提取物干粉的制备
[0061]制备步骤包括:
[0062](I)米酒酒糟二次发酵:往300g米酒酒糟中加入6000ml蒸馏水，在20°C下搅拌发酵48小时，得料液I ; [0063](2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入5g/L料液I的复合风味蛋白酶和Ig/L料液I的β -葡聚糖酶，在65°C下酶解I小时后，将体系升温至80°C保温30min以灭酶，之后过滤，过滤后滤液澄清，即料液2 ；
[0064](3)纯化和浓缩:在料液2中加入占料液量质量百分比0.5%的硅藻土，60°C，保温脱色、脱臭60min，将脱色、脱臭处理后的料液过滤，滤液再采用截留分子量为2500道尔顿的超滤膜过滤以去除大分子蛋白质，将所得滤液进行减压浓缩得浓缩液；
[0065](4)将步骤(3)所得的浓缩液喷雾干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0066]实施例6米酒酒糟提取物干粉的制备
[0067]制备步骤包括:
[0068](I)米酒酒糟二次发酵:往300g米酒酒糟中加入4500ml蒸馏水，在45°C下搅拌发酵15小时，得料液I ;
[0069](2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入4g/L料液I的中性蛋白酶和4g/L料液I的葡聚糖酶，在35°C下酶解8小时后，将体系升温至80°C保温30min以灭酶，之后过滤，过滤后滤液澄清，即料液2 ；
[0070](3)纯化和浓缩:在料液2中加入占料液量质量百分比8%的活性炭，60°C，保温脱色、脱臭60min，将脱色、脱臭处理后的料液过滤，滤液再采用截留分子量为2000道尔顿的超滤膜过滤以去除大分子蛋白质，将所得滤液进行减压浓缩得浓缩液；
[0071](4)将步骤(3)所得的浓缩液喷雾干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0072]实施例7米酒酒糟提取物干粉的制备
[0073]制备步骤包括:
[0074](I)米酒酒糟二次发酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸馏水，在25°C下搅拌发酵16小时，得料液I ;
[0075](2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入3g/L料液I的中性蛋白酶和3g/L料液I的β -葡聚糖酶，在60°C下酶解2小时后，将体系升温至80°C保温30min以灭酶，之后过滤，过滤后滤液澄清，即料液2 ；
[0076](3)纯化和浓缩:在料液2中加入占料液量质量百分比8%的大孔树脂，60°C，保温脱色、脱臭60min，将脱色、脱臭处理后的料液过滤，滤液再采用截留分子量为2000道尔顿的超滤膜过滤以去除大分子蛋白质，将所得滤液进行减压浓缩得浓缩液；
[0077](4)将步骤(3)所得的浓缩液喷雾干燥，得到米酒酒糟提取物干粉。
[0078]实施例8米酒酒糟提取物液体制剂的制备
[0079](1)米酒酒糟二次发酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸馏水，在40°C下发酵24小时，得料液I ;
[0080](2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入4g/L料液I的复合蛋白酶和2g/L料液I的甘露聚糖酶，在55 C下酶解4小时后，将体系升温至80 C保温30min以灭酶，之后过滤，得料液2 ;
[0081](3)纯化和浓缩:在料液2中加入占料液量质量百分比3%的活性炭，60°C，保温脱色、脱臭60min，将脱色、脱臭处理后的料液过滤，滤液再采用截留分子量为2000道尔顿的超滤膜过滤以去除大分子蛋白质，将所得滤液进行浓缩得浓缩液；
[0082](4’)调节步骤(3)所得浓缩液的pH值为4.5，向其中加入占浓缩液体积1/3的丙二醇，并加入占料液量质量百分比0.02%的尼泊金酯防腐剂，搅拌混合均匀，然后将料液用
0.22 μ m微孔滤芯进行保安过滤，滤液直接分装入事先灭菌、洁净的包装容器中，即得米酒酒糟提取物液体制剂。
[0083]实施例9米酒酒糟提取物液体制剂的制备
[0084](I)米酒酒糟二次发酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸馏水，在40°C下发酵24小时，得料液I ;
[0085](2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入4g/L料液I的复合蛋白酶和2g/L料液I的甘露聚糖酶，在55 C下酶解4小时后，将体系升温至80 C保温30min以灭酶，之后过滤，得料液2 ;
[0086](3)纯化和浓缩:在料液2中加入占料液量质量百分比3%的活性炭，60°C，保温脱色、脱臭60min，将脱色、脱臭处理后的料液过滤，滤液再采用截留分子量为2000道尔顿的超滤膜过滤以去除大分子蛋白质，将所得滤液进行浓缩得浓缩液；
[0087](4’)调节步骤(3)所得浓缩液的pH值为4.5，向其中加入占浓缩液体积1/4的丁二醇，并加入占料液量质量百分比0.05%的山梨酸，搅拌混合均匀，然后将料液用0.25μπι微孔滤芯进行保安过滤，滤液直接分装入事先灭菌、洁净的包装容器中，即得米酒酒糟提取物液体制剂。
[0088]实施例10米酒酒糟提取物液体制剂的制备
[0089](I)米酒酒糟二次发酵:往300g米酒酒糟中加入900ml蒸馏水，在40°C下发酵24小时，得料液I ;
[0090](2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入4g/L料液I的复合蛋白酶和2g/L料液I的甘露聚糖酶，在55 C下酶解4小时后，将体系升温至80 C保温30min以灭酶，之后过滤，得料液2 ;
[0091](3)纯化和浓缩:在料液2中加入占料液量质量百分比3%的活性炭，60°C，保温脱色、脱臭60min，将脱色、脱臭处理后的料液过滤，滤液再采用截留分子量为2000道尔顿的超滤膜过滤以去除大分子蛋白质，将所得滤液进行浓缩得浓缩液；
[0092](4’)调节步骤(3)所得浓缩液的pH值为4.5，向其中加入占浓缩液体积1/4的乙醇，并加入占料液量质量百分比0.1%的山梨酸钾，搅拌混合均匀，然后将料液用0.2μπι微孔滤芯进行保安过滤，滤液直接分装入事先灭菌、洁净的包装容器中，即得米酒酒糟提取物液体制剂。
[0093]效果实施例1米酒酒糟提取物对成纤维细胞的活化功效
[0094]用含小牛血清的DMEM培养基培养人成纤维细胞，传代2次，确认细胞生长情况稳定，取生长融合率为80%左右的细胞待用。
[0095]在无菌操作台中将培养皿中生长至80%左右的细胞回收至离心管中，通过细胞计数仪计数，接种至6孔细胞培养板中进行培养，在培养基中添加实施例1的提取物，使其在培养基中的浓度(w/v)为0.1% (0.lg/100mL)和0.01%,同时设立不添加本发明的提取物的一组为空白对照组。
[0096]培养3天后，用细胞计数仪测定每孔细胞数量，并进行统计分析。
[0097]检测结果:样品经过3天的培养后，含有样品浓度0.1%、0.01%作用组的细胞存活率为106.36 ±3.15%、109.33 ±4.78%，对成纤维细胞分别增殖约6.36%与9.33%。
[0098]效果实施例2米酒酒糟提取物对角质形成细胞的活化功效
[0099]用含小牛血清的DMEM培养基培养HaCaT细胞(永生化的上皮角质形成细胞)，传代2次，确认细胞生长情况稳定，取生长融合率为80%左右的细胞待用。
[0100]在无菌操作台中将`培养皿中生长至80%左右的HaCaT细胞回收至离心管中，通过细胞计数仪计数，接种至6孔细胞培养板中进行培养，在培养基中添加实施例1的提取物，使其在培养基中的浓度(w/v)为0.01%和0.005%，同时设立不添加本发明提取物的一组为空白对照组。
[0101]培养3天后，用细胞计数仪测定每孔细胞数量，并进行统计分析。
[0102]检测结果:样品经过3天的培养后，含米酒酒糟提取物样品浓度0.01%和0.005%的作用组同空白组比较，细胞存活率分别增加约25%与22%。效果实施例1和2的结果说明，本发明的米酒酒糟提取物具有良好的抗衰老功效。
[0103]效果实施例3米酒酒糟提取物对黑色素生成的抑制效果
[0104]用含小牛血清的DMEM培养基培养B16黑色素瘤细胞，传代2次，确认细胞生长情况稳定，取生长融合率为80%左右的细胞待用。
[0105]在无菌操作台中将培养皿中生长至80%左右的黑色素瘤细胞回收至离心管中，通过细胞计数仪计数，接种至6孔细胞培养板中进行培养，在培养基中添加实施例3的提取物，使其在培养基中的浓度(w/v)为0.5%、0.25%,0.1%、0.05%,0.01%,同时设立不添加本发明提取物的一组为空白对照组。
[0106]培养72h后，显微镜下观察细胞内黑色素颗粒，了解细胞状态。回收细胞，使用细胞计数仪进行细胞计数。提取细胞中黑色素，用酶标仪测定检测液的吸光度值。以阴性对照组的黑色素含量为100%，进行对照计算样品组黑色素含量，并进行统计分析。
[0107]检测结果:在安全的米酒酒糟提取物浓度作用下，均检测出抑制黑色素生成的效果。本发明的提取物在浓度分别为0.5%、0.25%、0.1%、0.05%、0.01%时，对应其黑色素抑制率为 92%、85%、69%、52%、20%。[0108]效果实施例4米酒酒糟提取物对酪氨酸酶活性的抑制效果
[0109]L-酪氨酸溶液和酪氨酸酶发生反应后，呈现棕色，在470nm处有最大吸收波长。加入酪氨酸酶抑制剂后，酶活性降低，溶液颜色变浅或变为无色，470nm处的吸光度变小。
[0110]选取实施例2的提取物，使其在反应体系中的浓度(w/v)为0.085%、0.0425%、
0.0369%,0.0212%,0.0106%,同时设立不添加本发明提取物的一组为空白对照组。
[0111]通过测定470nm处的吸光度值，与空白对照组对比，计算不同浓度抑制剂对酪氨酸酶的抑制效果。
[0112]检测结果:米酒酒糟提取物对酪氨酸酶活性抑制率的IC50为364ppm。
[0113]效果实施例3和4的结果说明，本发明的米酒酒糟提取物具有良好的抑制黑色素生成的功 效。
[0114]效果实施例5米酒酒糟提取物对DPPH自由基的清除效果
[0115]I, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为520nm。
[0116]当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在520nm处的吸光度变小，通过测定吸光度值，并与对照组比较，计算样品对自由基的清除率。
[0117]选取实施例3的提取物，使其在反应体系中的浓度(w/v)为0.1052%,0.0526%,
0.0263%,0.0131%,0.0066%,同时设立不添加本发明提取物的一组为空白对照组。
[0118]检测结果:米酒酒糟提取物对DPPH自由基清除率的IC50为115ppm。
[0119]效果实施例5的结果说明，本发明的米酒酒糟提取物具有良好的抗氧化功效。
[0120]基于上述效果实施例的结果可以得知，本发明获得的米酒酒糟提取物的活性功效较高，其中含有氨基酸、寡肽、核苷酸和矿物质等成分，表现出理想的抗衰老、美白和抗氧化功效。
[0121]应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种米酒酒糟提取物的制备方法，其包括如下步骤: (1)米酒酒糟二次发酵:往米酒酒糟中加入水发酵得料液1，所述水的添加量为I~20mL/g米酒酒糟，所述发酵的温度为20~50°C，所述发酵的时间为2~48小时； (2)酶解:往步骤(1)所得的料液I中加入蛋白酶和糖苷水解酶进行酶解后过滤，得料液2，所述蛋白酶的添加量为I~5g/L料液I，所述糖苷水解酶的添加量为I~5g/L料液I，所述酶解的温度为20~65°C，所述酶解的时间为I~16小时，所述蛋白酶的酶活为20~150万U/g，所述糖苷水解酶的酶活为20~150万U/g ； (3)纯化和浓缩:将步骤(2)所得的料液2进行脱色和脱臭处理后采用截留分子量为1500~2500道尔顿的超滤膜过滤，得料液3，将料液3进行浓缩，即得米酒酒糟提取物。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水的添加量为3~15mL/g米酒酒糟，所述发酵的温度为25~45°C，所述发酵的时间为4~16小时。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的蛋白酶选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合风味蛋白酶中的一种或多种，所述的糖苷水解酶选自葡聚糖酶或甘露聚糖酶；或， 所述蛋白酶的添加量为2~4g/L料液1，所述糖苷水解酶的添加量为2~4g/L料液1，所述酶解的温度为35~60°C，所述酶解的时间为2~8小时。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述脱色和脱臭处理为使用大孔树脂、硅藻土和活性炭 中的任一种对体系进行处理。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)之后还包括步骤(4)或步骤(4，)； 所述步骤(4)为:将步骤(3)浓缩所得的浓缩液进行干燥，收集干燥所得的干粉即得米酒酒糟提取物的干粉； 所述步骤(4’ )为:将步骤(3)浓缩所得的浓缩液与醇类混合得混合液，在所述混合液中加入防腐剂后采用0.2~0.25 μ m微孔滤芯进行保安过滤，所得滤液即为米酒酒糟提取物的液体制剂。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的干燥为喷雾干燥或真空加热干燥。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4’)中，所述的醇类选自丙二醇、丁二醇和乙醇中的任一种或多种；所述醇类的用量为所述浓缩液体积的1/10~1/3。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4’)中，所述的防腐剂选自尼泊金酯、山梨酸、山梨酸钾和山梨酸钠中的一种或多种。
9.如权利要求1~8任一项前所述的制备方法制备而得的米酒酒糟提取物。
10.如权利要求1所述的米酒酒糟提取物、如权利要求5所述的米酒酒糟提取物的干粉和权利要求5所述的米酒酒糟提取物的液体制剂中的任一种在制备抗衰老、抗氧化、美白的化妆品和/或药物中的应用。
【文档编号】A61Q19/02GK103757084SQ201410011117
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月10日 优先权日:2014年1月10日
【发明者】骆峰, 杨海延 申请人:上海辉文生物技术有限公司, 骆峰