专利名称：亲和捕获串联质谱分析设备和方法
技术领域：
本发明属于化学和生物化学分析领域，且特别涉及通过串联质谱改善分析物及分析物间亲和相互作用的鉴定和表征的设备和方法。
背景技术：
与高性能且低成本的物质分析器相耦联的电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)技术的到来，在过去的十年中允许了质谱(MS)在用于生物相关性大分子研究，包括蛋白质从复杂生物系统中提纯，的标准分析工具中占据一席之地。
例如，在一种称为肽质量指纹的技术中，质谱被用来识别从生物样品中提纯的蛋白质。识别是通过将纯化蛋白质的蛋白水解碎片质谱与从预先添加到数据库中的初级序列预测出的质量相比较而实现的。Roepstorff，The Analyst 117299-303(1992)；Pappin et al.，Curr.Biol.3(6)327-332(1993)；Mann et al.，Biol.Mass Spectrom.22338-345(1993)；Yates et al.，Anal.Biochem.213397-408(1993)；Henzel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905011-5015(1993)；James et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.19558-64(1993)。
类似的数据库采掘方法已经发展起来，其采用从碰撞诱导解离(CID)或MALDI源后(post-source)衰变(PSD)获得的碎片质谱来识别纯化的蛋白质。Eng et al.，J.Am.Soc.Mass.Spectrom.5976-989(1994)；Griffin et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.91546-1551(1995)；Yates et al.，U.S.Patent Nos.5,538,897和6,017,693；Mannet al.，Anal.Chem.664390-4399(1994)。
允许对分离蛋白至少部分重新排序的质谱技术也已经发展起来。Chait et al.，Science 26289-92(1993)；Keough et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.967131-6(1999)；Reviewed in Bergman，EXS 8133-44(200)。
便于解析蛋白质质谱和采掘不受版权限制的序列数据库的软件资源现在较容易在国际互联网上获得从而利于蛋白质的鉴定。在这之中有蛋白质探勘者(http//prospector.ucsf/edu)，PROWL(http//prowl.rockefeller.edu)，和Mascot搜索引擎(Matrix ScienceLtd.，London，UK，www.matrixscience.com)。
尽管高精度的质量分配提供了有用的信息——例如，采用上述技术有利于识别纯化的蛋白质——这种信息仍然受到限制。大量额外的分析能力通过MS分析与靶蛋白的酶和/或化学改性的结合、进行结构组分的说明、翻译后的改性和进一步的蛋白质识别，将被释放出来。
此外，复杂的生物材料——例如血液、血清、淋巴液、淋巴、间质流体、尿、分泌液、整个细胞、细胞溶解物和细胞分泌产物——典型地含有数百种生物分子、以及妨碍直接质谱分析的有机和无机盐。因此，在MS观察之前典型地需要有大量的样品制备和纯化步骤。
样品纯化的标准方法，例如液相色谱(离子交换，尺寸排阻、亲和及反相色谱)、膜分离、离心、免疫沉淀和电泳，典型地需要大量的起始样品。甚至在获得了这么多量的样品时，次要组分在这些纯化过程中也趋向于丢失，其是由于非特异结合和稀释作用而遭受的分析物损失。这些方法常常是高劳动强度的。
因此，显然有对方法和装置的需要，其便于使存在于不均匀样品中的主要和次要蛋白质都被质谱检测且无需大量预先液相纯化。进一步还有对MS平台的需要，其在质谱分析之前不仅允许易得样品的纯化，而且允许串行的和并行的样品改性方法。
这些需要通过发展亲和捕获激光解吸电离方法而部分地满足。Hutchens et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.7576-580(1993)；U.S.Patent Nos.5,719,060，5,894,063，6,020,208和6,027,942。这种用于大分子MS分析的新策略使用了新颖的激光解吸电离探针，其在至少一个表面上有亲和试剂。该亲和试剂从不均匀样品中吸附所期望的分析物，使它们以一种适合于随后激光解吸电离的形式在探针表面浓缩。分析物吸收和解吸的耦合避免了离线的纯化方法，允许对更少量的起始样品进行分析且更加有利于在质谱分析之前直接在探针表面上的样品改性方法。
亲和捕获激光解吸电离技术允许质谱应用于诸多标准生物定量分析格式，包括免疫，Nelson et al.，Anal.Chem.671153-1158(1995)；和亲和色谱，Brockman et al.，Anal.Chem.674581-4585(1995)。亲和捕获激光解吸电离技术不仅应用于肽和蛋白质的研究，Hutchens etal.，Rapid Commun.Mass Spectrom.7576-580(1993)；Mouradian etal.，J.Amer.Chem.Soc.1188639-8645(1996)；Nelson et al.，RapidCommun.Mass.Spectrom.91380-1385(1995)；Nelson et al.，J.Monlec.Recognition 1277-93(1999).；Brockman et al.，J.MassSpectrom 331141-1147(1998)；Yip et al.，J.Biol.Chem.27132835-33(1996)，还应用于寡核苷酸，Jruinke et al.，Anal.Chem.69904-910(1997)；Tang et al.，Nucl.Acids Res.233126-3131(1995)；Liu etal.，Anal.Chem.673482-90(1995)，细菌，Bundy et al.，Anal.Chem.711460-1463(1999)，和小分子，Wei et al.，Nature 399243-246(1999)的研究。在商业水平上，亲和捕获激光解吸电离包含于Ciphergen的蛋白质芯片系统(Ciphergen Biosystems，Inc.Fremont，California，USA)中。
尽管亲和捕获激光电离技术解决了大量的技术问题，但还存在困难。
当这种方法应用于从生物样品中捕获蛋白质时，通常只有全部蛋白的一皮摩尔被检测捕获并能够用于随后分析的。典型地，在色谱表面生物芯片上的亲和捕获并不导致完全的纯化。此外，固相提取的样品中所观察到的消化效率，与在自由溶液或者二维凝胶变性环境中进行的消化相比较，较差。因此，如果大约50％的是感兴趣的蛋白质，且成功地消化了这种蛋白的大约10％，那么最多只有大约50飞摩尔的某种肽能够用于检测。
在数据库采掘实验中，使用有效的胰蛋白酶来消化牛胎球蛋白，据证实，例如，甚至用1.0ppm的极限精度(一个目前大多数MS技术不能达到的水平)，当检测这种复杂的真核基因组时，对于单个肽的质量只能获得较差的蛋白质ID匹配置信度。对于两个肽，同样获得了较低的置信度结果。只有在提供了3个肽之后，置信度结果才回到误差低于300ppm的质量分配。在此情况下，大多数设备将需要内部标准校验。然而，5个或更多的肽的情况下，对于好于1000ppm误差的质量精度，不会取得进一步的置信度。
而且，当许多蛋白质同时被消化时，会产生不均匀的肽池，且成功的数据库采掘不仅要求极高的精度，而且要有许多初级序列信息的实例。串联MS/MS方法已被证实非常利于提供初级序列信息。Biemann et al.，Acc.Chem.Res.27370-378(1994)；Spengler et al.，RapidCommun.Mass Spectrom.5198-202(1991)；Spengler et al.，RapidCommun.Mass Sepctrom.6105-108(1992)；Yates et al.，Anal.Chem.671426-1436(1995)；Kaufman et al.，Rapid Commun.Mass.Spectrom.7902-910(1993)；Kaufman et al.，Intern.J.Mass Spectrom.IonProcesses 131355-385(1994)。
然而直到最近，唯一能够获得的用于基于激光解吸分析的MS/MS方法是二次(post)源衰变分析(PSD)。虽然PSD能够为皮摩尔水平的肽提供相当多的序列信息，但是这种碎片处理的整体效率较低；当与此方法中经常出现的较差的质量精度和稳定性相结合时，其对在亲和捕获激光解吸电离探针上常常发现的少量蛋白质进行分析的应用能力极大地受到了限制。最近，激光解吸电离四极飞行时间质谱(LDI Qq-TOF)已经发展起来，其能够执行碰撞诱导解离(CID)MS/MS分析。Krutchinksy et al.，Rapid Commun.Mass Spectrom.12508-518(1998)。
因此，有对能够提高亲和捕获激光解吸质谱灵敏度和质量精度的装置和方法的需要。有对能够提高探针上的消化效率从而允许使由于消化不均匀的蛋白质混合物而产生的肽易于分解的方法和装置的需要。有对能够提高亲和捕获激光解吸串联质谱分析效率的装置和方法的需要。
发明内容
本发明的一个目的是提供能够提高现有亲和捕获激光解吸电离质谱分析的灵敏度、质量精度、质量分辨率的装置和方法，并提高MS/MS的性能。本发明的另一个目的是提供利用这些改进的分析性能进行生物分子分析方法。
在第一个方案中，本发明通过提供一种分析设备满足了技术中这样和那样的目的和需要。
本发明的分析设备包括，激光解吸电离源、亲和捕获探针界面和串联质谱仪，其中亲和捕获探针界面能够啮合亲和捕获探针并将探针定位从而使它能够在与串联质谱仪联络时被激光解吸源查询，因而允许离子从该探针释放出来并进入质谱仪。
典型地，激光解吸电离源包括激光激发源和激光光路系统；该激光光路系统起到将被激发的光子从激光激发源传导到探针界面的作用。在这一实施例中，激光光路系统典型地向每平方毫米被查询探针的表面传递大约20-1000微焦耳的能量。
激光激发源从包含连续激光器和脉冲激光器的组中选择，且在各种实施例中从包含氮气激光器、Nd:YAG激光器、铒:YAG激光器和CO2激光器的组中选择。在本优选实施例中，激光激发源为脉冲氮气激光器。
在一组实施例中，激光光路系统包括从包含透镜、反射镜、棱镜、衰减器和光束分离器的组中选择的光学部件。
在另一组实施例中，激光光路系统包含一个具有输入端和输出端的光学纤维，且激光激发源与该光纤的输入端耦联。
在一些光纤激光光路系统实施例中，激光光路系统还包含光学衰减器。该衰减器可以安装在激光激发源和光纤输入端之间，能够起到将激光激发源耦联到光纤输入端的作用，或者可以安装在光纤输出端与探针之间。
在某些光纤光学系统实施例中，光纤输出端具有大约200-400μm的最大直径，且输入端具有大约400-1200μm的直径。
该分析设备也可以包含探针观察光学部件，以允许探针在其与探针界面啮合之后仍然可见。
在某些实施例中，激光光路系统可以包含激光耦合器，其将激光激发源与光纤输入端耦联。如上所述，该耦合器能够起到光学衰减器的作用。在其他实施例中，耦合器在探针与探针界面啮合之后能够起到提高探针可视度的作用。
在这些后面的实施例中，耦合器或光纤被分支并且从所述的激光激发源中分离一部分能量。选择地，这种分叉能够允许导入可见光从而照亮解吸位点。
当光学系统中包含可视化光学部件时，或者当含纤维激光光路系统包含双叉或三叉时，该分析设备还能够包含固定CCD照相机以探测从所述探针反射回来的光线。
在典型的实施例中，亲和捕获探针界面包含能够可逆啮合亲和捕获探针的探针固定器。该界面还典型地包含本身能够可逆啮合探针固定器的探针导入口。
在典型的实施例中，探针界面还包含探针位置调节器组件和界面离子收集系统。当探针固定器与导入口啮合时，它被安装在与探针位置调节器相接触的位置；反过来，该探针位置调节器能够相对于激光电离源(典型地，相对于激光光路系统)和离子收集系统可动地定位探针固定器(典型地带着它所啮合的探针)。在典型的实施例中，该调节器能够平行或旋转定位所述的探针固定器。
探针界面还典型地包含与探针导入口相耦联的真空抽空系统，该导入口允许探针在低于大气压的压力下被激光解吸电离源查询。
本发明的分析设备包括串联质谱仪，其在各种实施例中从包含QqTOF MS，离子阱MS，离子阱TOF MS，TOF-TOF MS和傅立叶变换离子回旋加速器共振MS的组中选择。
在优选实施例中，串联质谱仪为QqTOF MS而激光激发源为脉冲氮气激光器，探针处的激光流量密度大约为最低解吸阈值的2-4倍，且串联质谱仪具有大约20-50ppm的外部标准质量精度。
本发明的分析设备被设计用来与亲和捕获激光解吸电离源啮合。此外，任何上述的实施例都能够包含与亲和捕获探针界面啮合的亲和捕获探针。
这些实施例中的亲和捕获探针典型地具有至少一个安装在与激光源有查询关系的位置上的样品吸附表面，样品吸附表面从包含色谱吸附表面和生物分子亲和表面的组中选择。典型地，这种色谱吸附表面从包含反相、阴离子交换、阳离子交换、固定金属亲和捕获和混合型表面的组中选择，且生物分子亲和表面的生物分子从包含抗体、受体、核酸、外源凝集素、酶、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、Staph蛋白A和Staph蛋白G的组中选择。
亲和捕获激光解吸电离探针可以具有多个能够放置在与激光源有查询关系的位置上并可各自寻址的样品吸附表面，并且可以包含至少两个不同的这种吸附表面。
在其它的实施例中，本发明的分析设备包含一个与串联质谱仪的检测器对接的数字式计算机。在一些实施例中，该设备还可以包含可由该数字式计算机执行的软件程序，其或者是该计算机的一部分或者能够由该计算机传达存取。这些实施例中的软件程序能够控制激光解吸电离源，或者控制串联质谱仪数据采集的至少一个方面，或者执行所述串联质谱仪数据采集的至少一个分析路线，或者这些功能的任何一个子集。
另一方面，本发明提供了用于分析至少一个检测蛋白的方法。
该方法包括(a)捕捉亲和捕获蛋白生物芯片上的测试蛋白，(b)在蛋白质生物芯片上用分解蛋白制剂产生检测蛋白的蛋白质分解产物；和(c)用串联质谱仪分析至少一个蛋白分解产物。这种方案的这些实施例中，分析步骤包括(i)将蛋白分解产物从蛋白质生物芯片释放到气相中以产生相应的母体离子肽，(ii)选择母体离子肽用于随后的第一质谱仪碎裂，(iii)在所选择的气相裂解条件下裂解所选择的母体离子肽以产生离子碎片产物和(iv)生成离子碎片产物的质谱。在这种方式中，质谱提供了对检测蛋白质的分析。
在本发明这一方案的某些实施例中，该方法还包括附加步骤(d)，通过将质谱递交给蛋白质数据库采掘协议，其是基于质谱与数据库中的蛋白理论质谱之间紧密配合的方法为数据库中的检测蛋白确定至少一种蛋白质候选特性，为检测蛋白确定至少一种蛋白质候选特性。
在这些实施例的细节中，步骤(d)还包括将检测蛋白的质量和原始检测蛋白的种类递交给该协议。
在其它实施例中，该方法还包括(e)将候选特性与检测蛋白相比较，其是通过(i)产生(b)中蛋白质裂解产物的质谱；(ii)将该蛋白质裂解产物的质谱递交给计算机协议，其确定了通过使用蛋白质水解试剂而预测产生的裂解产物候选特性的理论质谱与蛋白质裂解产物的质谱之间的紧密配合方法，借此，该方法表明蛋白质生物芯片上的蛋白裂解产物与检测蛋白一致。
然而该方法的其它实施例中还包括步骤(f)，当所选择的母体离子肽与由候选特性预期的蛋白质裂解产物不一致的时候重复步骤(c)；并且然后(g)重复(d)以选择(f)中的母体离子肽。
在本发明的这一方案中，检测蛋白可以是在第一和第二生物样品之间差异表达的蛋白。在一些这样的实施例中，第一和第二生物样品出自于正常源和病态源。
在第三个方案中，本发明提供了表征第一和第二分子结合配偶体(binding partner)之间结合相互作用的方法。
在此方案中，该方法包括结合第二结合配偶体到第一结合配偶体上，其中所述的第一结合配偶体被固定在激光解吸电离探针表面；裂解第二结合配偶体；而后用串联质谱仪测量方法探测至少一个碎片，其中被探测碎片的质谱表征了该结合相互作用。
在本发明此方案的某些实施例中，在第二结合配偶体结合到第一结合配偶体之前，第一结合配偶体首先被固定于亲和捕获探针的表面。
这种固定能够通过将第一结合配偶体直接结合到亲和捕获探针上，例如共价键合，而实现。典型的共价键合实施例包括第一结合配偶体的胺与所述探针表面羰基二咪唑(carbonyldiimidazole)的残基之间，以及所述第一结合配偶体的氨基或硫醇基团与探针表面的环氧基团之间的共价键合。
该固定也能够通过直接的非共价结合，例如第一结合配偶体与探针表面的金属，如金或铂，之间的配位或络合结合而实现。该固定还能够通过第一结合配偶体与从包括反相、阴离子交换、阳离子交换固定金属亲和捕获和混合型表面的组中选择的色谱吸附表面相互作用而实现。
选择地，该固定可以是间接的，但虽然是间接的也可以是共价的。在后面的某些实施例中，第一结合配偶体能够采用共价结合并通过衔接物，例如可裂解的衔接物而固定。间接固定也能够是非共价的，例如通过生物素/抗生物素蛋白，生物素/抗生蛋白链菌素的相互作用而固定到探针上。
在本发明的这一方案中，第一分子结合配偶体能够从包含蛋白质、核酸、碳水化合物和脂类的组中选择。典型地，第一结合配偶体是蛋白质，其可以是从包含多细胞真核生物、单细胞真核生物、原核生物和病毒的组中选择的有机体中自然产生的蛋白质，或者可以是非自然产生的蛋白质，例如重组融合蛋白质。
在第一结合配偶体是蛋白质的实施例中，该蛋白能够从包含混合于其它蛋白中的抗体、受体、转录因子、细胞骨架蛋白、细胞周期蛋白和核糖体蛋白的组中选择。
第二结合配偶体与固定的第一结合配偶体的结合，在典型的实施例中，受到第一结合配偶体与生物样品相接触的影响；该样品可以是从包含血液、淋巴液、尿、脑脊髓液、分泌滑液、乳汁、唾液、玻璃状液、水状体液、粘液和精液的组中选择的流体，或者是细胞溶解产物，或者某些其它形式的样品。
在各种实施例中，包括第一结合配偶体是蛋白质的实施例，第二结合配偶体可以是蛋白质。选择地，第二结合配偶体也可以是存在于组合库中的化合物，其中第二结合配偶体与第一结合配偶体的结合受到第一结合配偶体与部分化学合成组合库相接触的影响。然而在另一个选择中，第二结合配偶体可以是生物迟豫组合库的组分，例如相迟豫库。
在某些典型的实施例中，裂解受到第二结合配偶体与酶相接触的影响；当第二结合配偶体是蛋白质时，酶典型的是特殊的内在蛋白酶，例如胰岛素、Glu-C(V8)蛋白酶、内部蛋白酶Arg-C(半胱氨酸蛋白酶)、Asn-N蛋白酶和Lys-C蛋白酶。选择地，裂解可以受到所述第二结合配偶体与液相化学试剂，例如CNBr，相接触的影响。
在一些实施例中，该方法还包括，在第二结合配偶体与所述第一结合配偶体结合之后，裂解第二结合配偶体之前，使第二结合配偶体变性。
在多种实施例中，该方法还包括步骤，在第二结合配偶体裂解之后，用第一洗脱液，有时用第二洗脱液，冲洗探针，第二洗脱液在至少由一个洗脱特性与第一洗脱液有差别，例如pH、离子强度、去污强度和憎水性。
在典型的实施例中，在裂解之后且在探测第二结合配偶体碎片之前，该方法还包括步骤，将能量吸收分子施加到探针。在优选实施例中，探针随后与本发明分析设备的亲和捕获探针界面啮合，且用该设备的激光源将第二结合配偶体的碎片电离并从探针释放。
该设备能够用来生成这种方法的多种有效的测量方法，包括测量所有离子质量的方法，测量一部分碎片的质量的方法，以及单一离子的监控方法。
有效地，该方法的实施例包括步骤在第二结合配偶体碎片被质谱测量之后，将碎片测量结果与通过应用裂解酶裂解规则到第二结合配偶体初始氨基酸序列而作出的预测相比较，借此，这种比较便表征出了分子间的相互作用。
如果第二结合配偶体的特性未知，该方法还可以包括，在这种比较之前，通过MS/MS分析来确定第二结合配偶体的特性。这种MS/MS分析可以包括步骤，质谱测定地选择第二结合配偶体的第一碎片；在气相中裂解第二结合配偶体的第一碎片，而后将碎片频谱与从预先添加到数据库中的氨基酸序列数据预测出的碎片频谱相比较。氨基酸序列数据能够从包括实验数据和预知数据的组中选择，且该解离，在典型的实施例中，为碰撞诱导解离。
在该方法的一些实施例中，第一结合配偶体从包括抗体、T细胞受体和MHC分子的组中选择。在其它实施例中，第一结合配偶体是受体且第二结合配偶体从包括该受体的拮抗剂、该受体部分拮抗剂、该受体的对抗剂和该受体的部分对抗剂的组中选择。在其它的实施例中，第一结合配偶体是糖蛋白受体且第二结合配偶体是外源凝集素。
在第四个方案中，本发明提供了探测分析物的方法，该方法包括将亲和捕获探针与本发明分析设备的亲和捕获探针界面相啮合，该亲和捕获探针还具有分析物的限制物；用该设备的激光源从探针将分析物或碎片释放或电离；而后通过串联质谱仪测量被释放的离子来探测该分析物。
在这一方案中，该方法还能够包括，在解吸和电离步骤之后且在探测之前，实现该释放离子的碰撞诱导解离。在这种解离之前，在一些实施例中一部分离子可以选择出来以用于碰撞解离。
在其它的实施例中，可以执行将分析物吸附于探针上的先行步骤，而在另外的实施例中，在吸附分析物之后且在该探针与该探针界面啮合之前，可以执行用能量吸收分子将该探针与该分析物粘着接触的步骤。
本发明上述的及其它的目的和优点将通过参考下列详细的结合附图的说明而显而易见，附图中类似的符号自始至终代表类似的部分，其中图1扼要地表示了本发明分析设备的一个实施例；图2更详细地展示了本发明分析设备中优选使用的正交QqTOF串联质谱仪的元件；图3显示了单一BPH和前列腺癌患者的精液蛋白质特征测验图；图4展示了一种图3中可检测的上调的(upregulated)蛋白探针上分离的结果；图5展示了在富集生物标记物候选物被暴露并用胰岛素进行原位消化之后，用单一相MS分析探测的肽；图6展示了在本发明分析设备上相同纯化蛋白质肽的LDIQq-TOF MS分析；和图7展示了所选择的富集生物标记物候选物二倍荷电离子从本发明分析设备上获得的MS/MS结果。
具体实施例方式
I.定义正如此处所使用的，下面特别列出的术语具有如下的定义。如果没有另外定义，此处使用的所有术语具有本发明所属技术领域中的专业人士所通常理解的含义。
“分析物”是指希望被探测的样品的任何组分。该术语可以涉及该样品中的单一组分或多个组分。
“探针”是指这样的装置，当被定位啮合并与激光解吸电离源具有查询关系且在大气压或低于大气压的压力下与气相离子质谱仪保持并行联络时，能够用于引导来自于分析物的离子进入质谱仪。正如此处所使用的，该“探针”典型地与探针界面可逆啮合。
“亲和捕获探针”是指通过足以允许该探针从不均匀混合物中抽提和浓缩分析物的相互作用来结合分析物的探针。浓缩的纯度并不要求。该结合相互作用典型地是通过将分析物吸附到探针吸附表面而介导的。术语蛋白质芯片(ProteinChip)阵列是指本发明所使用的可以在商业上从Ciphergen生物系统有限公司，Fremont，California，获得的亲和捕获探针。
“吸附”是指分析物对吸附剂的可探测的非共价结合。
“吸附剂”是指任何能够吸附分析物的物质。此处使用的术语“吸附剂”既涉及单一的材料(“一元吸附剂”)(例如，一种化合物或一种功能基团)也涉及多种不同的材料(“多元吸附剂”)。多元吸附剂中的吸附材料涉及如“吸附剂物质”。例如，探针基质上的激光寻址吸附表面能够包括以许多具有不同结合特性的不同吸附剂物质(例如，阴离子交换材料、金属螯合剂或抗体)为特征的多元吸附剂。
“吸附表面”是指具有吸附剂的表面。
“色谱吸附表面”是指具有能够色谱识别或分离分析物的吸附剂的表面。因此该术语包括具有阴离子交换部分、阳离子交换部分、反相部分、金属亲和捕获部分和混合型吸附剂的表面，正如那些在色谱技术领域中所能够理解的术语。
“生物分子亲和表面”是指具有包括能够特异结合的生物分子的表面。
“特异结合”是指两种同时存在于不均匀(非均匀)样品中的分子物种相对于与样品中其它分子物种的结合更倾向于彼此相互结合的能力。典型地，特异结合相互作用比偶然结合相互作用在反应中的识别能力高至少两倍，更典型地超过10-100倍。当能够确定分析物存在于不均匀(非均匀)样品中时，在用来探测分析物时，特异结合足以用于识别。典型地，特异结合反应的亲和力或亲合力至少大约10-7M，在具有更大特异性的特异结合反应中典型地具有至少10-8M到至少大约10-9M的亲和力或亲合力。
“能量吸收分子”及相应的首字母缩写词“EAM”是指能够，当粘附于探针上时，从激光解吸电离源吸收能量并随后促进与之接触的分析物解吸和电离的分子。该词语包括在美国专利Nos.5,719,060，5,894,063，6,020,208和6,027,942中所述的所有分子，其公开的内容其中包括其全部的参考文献。该词语显然包括苯乙烯酸衍生物、芥子酸胆碱酸(“SPA”)、氰羟基苯乙烯酸(“CHCA”)和二羟基苯酸。
“串联质谱仪”是指任何气相离子质谱仪，其能够对离子混合物中的离子执行两个连续阶段的基于m/z的识别。该词语包括具有两个质量分析仪的质谱仪以及具有能够在质量分析之前选择性获得或保留离子的单一质量分析仪的质谱仪。因此该词语显然包括QqTOF质谱仪、离子阱质谱仪、离子阱-TOF质谱仪、TOF-TOF质谱仪，和傅立叶变换离子回旋加速器共振质谱仪。
“洗脱液”是指试剂，典型地是溶液，其用于影响或调节分析物对吸附表面吸附剂的吸附。此处洗脱液也涉及如“选择性阈值调节剂”。
“洗脱特性”是指洗脱液的物理或化学特性，其有利于它影响或调节分析物对吸附表面吸附剂吸附的能力。如果，当使分析物与洗脱剂接触时，分析物对洗脱剂的亲和程度不同，则两种洗脱剂具有不同的洗脱特性。洗脱特性包括，例如，pH、离子强度、无序程度、去污强度和温度。
“生物样品”和“生物学样品”都是指来自于能够复制的有机体至少一部分的样品。正如此处所使用的，生物样品能够来自于任何已知的分类学领域，包括病毒、原核生物、单细胞真核生物和多细胞真核生物。生物样品能够来自于有机体的整体或其一部分，包括来自于其培养部分。生物样品能够处于适合于上下文的任何物理形式，包括匀浆、亚细胞组分、溶解产物和流体。
“生物分子”是指能够在生物样品中发现，但不需要必须来自于生物样品的有机分子，例如类固醇、氨基酸、核酸、糖、多肽、多聚核苷酸、复合碳水化合物和脂类。
“有机小分子”是指尺寸可以与那些通常在药物中使用的有机分子相比较的有机分子。该术语不包括有机生物聚合物(例如，蛋白质、核酸等等)。此处使用的有机小分子典型地尺寸范围最高达大约5000Da、高达大约2500Da、高达大约2000Da或者高达大约1000Da。
“生物聚合物”是指能够在生物样品中发现，但不需要必须来自于生物样品的聚合物，例如多肽、多聚核苷酸、多聚糖和多聚甘油酯(例如，二或三甘油酯)。
“碎片”是指分析物的化学、酶或物理破碎产物。碎片可以处于中性或离子状态。
此处可以互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指自然发生的或合成的聚合物包括氨基酸单体(残基)，其中此处的氨基酸单体包括自然发生的氨基酸、自然发生的氨基酸结构变体，和能够参与肽键的合成的非自然发生类似物。多肽能够被调节，例如通过附加碳水化合物残基形成糖蛋白。术语“多肽”、 “肽”和“蛋白质”包括糖蛋白和非糖蛋白。
“多聚核苷酸”和“核酸”都是指自然发生的或合成的聚合物包括核苷酸单体(碱基)。多聚核苷酸包括自然发生的核酸，例如脱氧核糖核酸(“DNA”)和核糖核酸(“RNA”)，以及核酸类似物。核酸类似物包括那些包含非自然发生的碱基的类似物，和那些不是用自然发生的磷酸二酯键连接的核苷酸单体。核苷酸类似物包括，例如(且不限于此)亚磷酸硫酯(phosphorothioates)、亚磷酸二硫酯(phosphorodithioates)、磷酸三酯、磷酸分支酸盐(phosphoramidates)、磷酸硼烷、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-氧-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNAs)，以及类似物。
如此处所使用地，“分子结合配偶体”——及同等地，“特异结合配偶体”——是指显示特异结合的分子对，典型地是生物分子对。不限于此的例子如受体和配体、抗体和抗原、生物素和抗生物素蛋白，以及生物素和抗生蛋白链菌素。
“受体”是指分子，典型地是大分子，其能够在生物样品中发现，但不需要必需来自于生物样品，且其能够参与与配体的特异结合。该术语还包括保留特异配体结合能力的碎片和衍生物。
“配体”是指能够参与与设计的受体或抗体特异结合的任何组分。
“抗体”是指基本上由至少一个免疫球蛋白基因编码的多肽或至少一个免疫球蛋白基因的碎片，其能够参与与配体的特异结合。该术语包括自然发生的形式，以及碎片和衍生物。在此处所使用的术语领域内的碎片包括那些被用各种肽酶，例如Fab、Fab’和F(ab)’2碎片消化而产生的碎片，那些通过化学分解而产生的碎片，通过化学碎裂而产生的碎片，以及重组的碎片，只要该碎片保留与靶分子特异结合的能力。典型的重组碎片，如通过例如噬菌体显像而产生的，包括单链Fab和scFv(“单链可变区域”)碎片。该术语领域内的衍生物包括抗体(或其碎片)，其序列被调节，但仍然能够特异结合靶分子，包括种间嵌合体和人抗体。正如此处所使用的，抗体是能够通过任何已知的技术，包括通过噬菌体显像，或者类似技术从天然B淋巴细胞的细胞培养中获得的收获物、杂种细胞、重组表达系统。
“抗原”是指能够被抗体结合的配体。抗原不需要是免疫原。抗原与抗体相接触的部分被命名为“抗原决定簇”。
“流量密度(Fluence)”是指传递到被查询影象每单位面积上的能量。
II.亲和捕获探针串联质谱仪在第一个方案中，本发明提供了一种分析设备，其结合了亲和捕获激光解吸电离进样的优点和串联质谱仪高精度、高质量分辨率的优点。该结合比现有的用于执行已知技术操作的设备具有相当大的优势。而且，该新设备使发现蛋白质的新方法成为可能，也使对特异结合配偶体之间分子相互作用的识别和表征的，比现有方法更迅速、更有效、更灵敏的新方法成为可能。首先先总体上简要描述一下该设备；其后，再更详细地说明该亲和捕获探针界面的特性。
简要地，参考图1，设备100包括激光解吸/电离源13；亲和捕获探针界面10，和串联质谱仪14。图1所示的是一个优选实施例，其中激光源12是脉冲氮气激光器，而串联质谱仪14是正交四极飞行时间质谱仪(QqTOF)串联MS。
激光解吸/电离源激光解吸/电离源13产生高能光子，被适当地调节和引导，其解吸和电离粘着于亲和捕获探针16的蛋白质及其它分析物。激光解吸/电离源13包括激光源12、激光光路系统11和，选择地，探针观察光学部件18。
激光解吸/电离源13通过使用脉冲激光器12，或者，作为选择，通过机械地或电子地切割从连续激光器12传来的光束而产生脉冲激光能量。典型地，脉冲激光是优先选择的。优选的脉冲激光源包括氮气激光器、Nd:YAG激光器、铒:YAG激光器和CO2激光器。此处优选的是脉冲氮气激光器，因为其占地简单且成本相对较低。
从激光器12发出的光子通过激光光路系统11而被引导撞击探针16的表面。光学系统11能够包含一个由透镜、反射镜、棱镜、衰减器和/或光束分割器组成的配置，其起到收集、引导、聚焦、再分离和控制每一束激光脉冲强度的作用，从而将处于聚焦点形式的具有适当解吸流量密度的解吸能量传递到探针16上。
选择地，光学系统11能够包含一个光纤阵列，其起到收集、引导和再分离每一束激光脉冲能量的作用在这一实施例中，激光器12的输出端与光纤的输入端用光学耦合器耦联；该耦合器典型地包含一个焦距和直径均适合于光纤输入端数值孔径的透镜。
进入光纤的能量数量能够通过仔细调节透镜相对于纤维的位置而加以控制；在此实例中，纤维的光学耦合器还能够作为光学衰减器。在另一个优选配置中，激光器全部的输出能量都被输入到纤维中且衰减器置于光纤输出端与光学系统解吸点聚焦元件之间。在另外一个优选配置中，光学衰减器置于激光器和光纤耦合器之间。在所有的实例中，光学衰减器均是用来保证传递适当的激光流量密度到探针16的表面，且独立于激光器12的输出能量。典型的激光流量密度处于20-1000微焦/平方毫米的量级。
正如所证实的那样，当接收从激光器传来的聚焦的能量时，纤维光学部件可能常常被损坏，故将纤维输入端的接收面积最大化是有利的，这样传入的激光能量的流量密度低于纤维的损坏阈值。后者也简化了在调整光学耦合器相对于激光器和光学纤维的位置时对光纤激光束的校准。然而，为了在探针16上获得相当高的解吸流量密度水平，在使用典型的氮气激光器传递最大能量为大约200μJ/激光脉冲时，最大引出端纤维直径不应超过400μm(微米)。这一问题的解决在于引入锥形光学纤维，其输入端具有400-1200微米量级的直径而输出端具有200-400微米的直径。
典型地，解吸点应该聚焦到使每一束脉冲产生的离子最大化的尺寸，其是通过在保持足以诱发解吸和电离的流量密度的同时，查询最大的探针16面积而实现的。在耦联四极-四极飞行时间串联质谱仪的激光解吸/电离源中，当使用典型的氮气激光器传递大约200微焦/脉冲的最大能量时，最适宜的激光点面积已被确定为在0.2-0.4平方毫米的范围。
激光解吸/电离源13能够包含，典型作为光学系统11的组成部分，探针观察光学部件18。观察光学部件18能够包含照明源、透镜、反射镜、棱镜、分色反射镜、带通滤波器和CCD相机以允许照明和观察解吸点，例如，探针6被激光查询的区域。
当激光光路系统11包含光学纤维时，观察光学部件18能够利用光学纤维本身发出的光线。
例如，纤维光学耦合器能够被分为两部分(被分叉)以分离一小部分的激光激发能量，从而作为一种用来监视所施加的激光能量的方法，或者它能够被分为两部分以允许引入可见光来照亮解吸点。
在这两个实施例的第一个实施例中，一小部分的激发能量被引导撞击作为激光能量回路组成部分的摄相探测器，其经过校准能够反射回有效数量的传递给探针16的激光能量。在第二个实施例中，可见光被引导照亮解吸点使得观察这一区域成为可能，其是或者通过一组单独的耦联CCD相机的摄相光学部件，或者通过在光纤和激光激发源之间使用棱镜或分色镜，其将反射到光纤主路的光线引导到CCD相机上，而实现的。选择地，棱镜或分色镜能够成直线地置于光学纤维照明纤维支路和照明源之间以允许任何耦合到此支路的反射回来的图象被引导撞击CCD相机。在另外一个实施例中，该纤维能够被分成三叉，从而一支传递解吸/电离激光脉冲，另一支传递用于照明解吸点的可见光，而第三支将从解吸点反射回来的光线递交给CCD相机。对于这些当中的每一个观察方案，合适的带通滤波器应该布置在CCD相机和观察光学系统之间，以避免将随着传入的激光脉冲的直接反射而发生的可能具有破坏性的高能光子传递到探针表面，或者避免二次光子作为受传入的激光脉冲的电子激发的直接后果而从探针表面逸出。
探针界面亲和捕获探针界面10能够可逆啮合亲和捕获探针16，定位探针16使之与激光源12具有查询关系，并同时与串联质谱仪14保持联络；该联络可支持从大气压到低于大气压的压力。
探针界面10包括探针固定器、探针导入口、探针位置调节器组件、真空和气动组件置，及界面离子收集系统。
探针固定器是探针界面10的部件，其被定形以便和探针16的形状因数(form factor)相一致。当探针16为蛋白质芯片阵列(Ciphergen生物系统有限公司，Fremont，CA USA)时，探针固定器与蛋白质芯片阵列的形状因数相一致。
探针固定器能够固定单一的探针16或者多个探针16。固定器将每一个探针16定位于相对于离子收集系统界面合适的方位，以被激光解吸/电离源13查询。
探针固定器与位置调节器组件紧密接触。
该调节器组件能够相对于激光解吸/电离源13和离子收集系统界面移动探针16的相对位置，从而探针的不同区域都能够被查询且由于此照射而产生的离子被收集以引入到串联质谱仪14中。
该调节器包括在使探针的位置相对于激光解吸/电离源和离子收集系统的位置保持恒定的同时支持探针16平行和/或旋转移动的电化学装置。这种电化学装置包括但不限于机械或光学位置传感器、螺线管、步进马达、DC或AC同步马达，其直接或间接地与线性移动调节器、线性或圆周移动导轨、万向节、轴承，或轴杆连通。
探针导入口允许探针固定器，包括所装载的探针16，置于探针位置调节器组件上而不引入不恰当水平的大气气体进入探针界面10和串联质谱仪14。
为了实现后者，探针导入口使用了真空抽空系统(探针导入口抽空系统)以泵出大气气体，在将芯片移入工作位置之前获得靶端口压力。在探针交换期间，探针调节器组件将探针从工作位置(与激光解吸源13和离子收集系统成一直线的位置)移动到交换位置。在这样的操作中，调节器能够在即将迅速提升到大气压的交换口与质谱仪输入端之间提供密封。在密封了质谱仪输入端之后，大气气体被探针导入口加压系统导入到探针导入口内。这便消除了探针固定器大气表面与导入口之间的压力差，允许探针固定器从探针位置调节组件移开。
伴随着先前已分析探针16的移走和新探针16的安装，探针固定器被放回到其位置调节器和样品装载过程开始的位置。如前所述，探针导入口能够用抽空系统抽吸到低于大气压的压力。一旦到达靶样品的导入压力，探针调节系统就将探针16从交换位置移动到工作位置，并在此操作中打开对质谱仪输入端的密封。
选择地，当离子在处于大气压的解吸室中产生并最终引导到离子光学部件上时，其将离子引导到质谱仪输入端，并不需要对探针导入口进行抽空和加压，因为其被保持在大气压下。
探针导入口抽空系统包括真空泵、压力传感器、真空兼容管道和连接配件，以及真空兼容阀，当共同工作时，其允许伴随着样品交换的同时对保留在导入口中的大气气体进行受控抽空，从而探针16能够被移动到工作位置。真空泵能够是(但不限制于此)单极或多极油机械泵、涡管泵，或无油膜片泵。在优选实施例中，真空兼容阀为电控螺线管阀。在相同实施例中，压力传感器为能够在从大气压到1毫托的压力范围工作的电子传感器。这种压力传感器包括(但不限于此)热电偶计和pirani计。在相同实施例中，此系统相同操作是在由模拟逻辑回路或数字微处理器提供的逻辑控制下实现的，其中模拟逻辑回路或数字微处理器与压力计和位置传感器的输入一致以允许作为整个系统操作一部分的样品口自动抽空。
探针导入口加压系统包括气体源、压力传感器、气体引导管道或配件，和气体兼容阀，当共同工作时，其允许受控导入对交换口加压的气体，从而允许将探针固定器从调节组件移走。
在一个实施例中，气体源是未经处理的大气气体。在另一实施例中，气体源是首先被引导通过吸水剂阱，并在导入加压系统之前选择地再通过特殊的过滤器的大气气体。在另外一个实施例中，在使用大气气体的场合，加压密封气体是通过由干燥不活泼气体如氮气或任何有成本效益的惰性气体组成的纯化源而提供的。
在优选实施例中，加压系统的气体引导管道、配件、某些阀和压力传感器是在抽空系统中所使用的。在相同的实施例中，此系统相同的操作是在由模拟逻辑回路或数字微处理器提供的逻辑控制下实现的，其中模拟逻辑回路或数字微处理器利用压力计和位置传感器的输入以允许作为整个系统操作一部分的样品口自动加压。
探针界面压力控制系统起到了在位于探针16样品存在(吸附)表面和离子收集系统之间的解吸室中提供选择性背景气压的作用。可以接受的解吸室压力范围从大气压一直到0.1微托。优选的压力范围为1托到1毫托。探针界面压力控制系统包括气体源、气体导入管道和配件、气体流量控制器和压力传感器。气体源能够是未经处理的大气气体。在另一个实施例中，气体源是首先被引导通过吸水剂阱并在导入控制系统之前选择地再通过特殊的过滤器的大气气体。在另外一个实施例中，控制气体是通过由干燥不活泼气体如氮气或任何有成本效益的惰性气体组成的纯化源而提供的。气体流量控制器可以是手动控制的流量限流器。选择地，气体流量控制可以通过使用电子控制流量限流器而实现。在优选实施例中，优选解吸室压力的闭环控制是在由模拟逻辑回路或数字微处理器提供的逻辑控制下，以自动的模式实现的，其中模拟逻辑回路或数字微处理器灵敏地与自动气体流量控制器相互作用以从压力计获得预先确立的读数。
界面离子收集系统包括静电离子收集组件、可选的气动离子收集组件和静电或RF离子引导装置。静电离子收集组件包括DC静电透镜元件配置，其起到收集在解吸室中解吸的离子并将其引导到质谱仪输入端的作用。
在一个实施例中，该组件包括两个静电元件。第一个元件包括探针固定器和探针表面，而第二个是分离透镜。分离透镜被放置在离阵列表面0.2-4mm远的地方。分离透镜包含直径范围为2-20mm的孔径，其围绕从解吸点中心延伸到质谱仪输入端中心的法线轴同心地放置。独立的DC电势施加到该组件的每一个元件。
在优选实施例中，分离透镜包含直径10mm的孔径且被放置于距离阵列表面1mm远的地方。在相同的实施例中，10伏电势差在分离器和阵列之间建立。
气动离子收集组件包括气体源、引导管道、气压传感器和气体逸出口，从而能够产生预先确定的气体流量以帮助解吸室中的解吸离子整体移动到质谱仪输入端内。
气体源能够是未经处理的大气气体。在另一个实施例中，气体源是首先被引导通过吸水剂阱再在导入系统之前选择地通过特殊过滤器的大气气体。在另外一个实施例中，离子收集气体是通过由干燥不活泼气体如氮气或任何有成本效益的惰性气体组成的纯化源而提供的。
气体流量控制器能够是手动控制的流量限流器。选择地，气流控制能够通过使用电子控制流量限流器而实现。压力传感器能够是(但不限于此)热电偶计和priani计。气体出口置于探针16后面以引导主体气体围绕探针流动并流到同心放置于解吸点和质谱仪输入端的法线轴。
在优选实施例中，气体流量通过使用模拟或数字控制电路而受到自动回路控制，从而产生了足够的离子扫描(sweeping)流量而不过度加压解吸室。
界面离子收集系统的最后一个部件是离子引导装置。离子引导装置起到了将所收集的离子传递到质谱仪14的作用。它可以属于静电或RF种类。优选实施例是多极RF离子引导装置。后者的一个例子是四极或六极离子导管。在下面更详细说明的优选Qq-TOF设备中，离子导管是四极RF离子导管。离子被分别由静电和气动离子收集系统产生的静电或气动加速力引导进入离子引导装置。在优选实施例中离子引导装置的DC静电电势比分离透镜的典型地小10-20伏。
串联质谱仪本发明的分析设备还包括串联质谱仪14。串联质谱仪14能够有效地从包括正交四极飞行时间(Qq-TOF)、离子阱(IT)、离子阱飞行时间(IT-TOF)、飞行时间-飞行时间(TOF-TOF)和离子回旋加速器共振(ICR)等类型的组中选择。
此处优选的，并在下面进一步说明的，是正交Qq-TOF MS。
QqTOF MS的主要实力是优越的质量精度和分辨能力；提高的肽灵敏度和低mw范围；以及通过采用低能碰撞诱导解离(CID)而产生的优良ms/ms性能。具有电喷雾电离源的正交QqTOF能够从AB/MDS Sciex(QSTARTM；AB/MDS-Sciex，Foster City，California，USA)在商业上获得。
参考图2，简要地概括了QqTOF的原理和特点。
离子在第一个四极透镜“q0”之前的解吸室内产生。q0中的压力典型地维持在大约0.01-1托，但也能够维持在大气压下。在这一方法中，解吸离子在其形成之后不久便通过与背景气体碰撞而迅速冷却。
这种离子的整体冷却或衰减提供了三个主要的优点。
首先，冷却消除了解吸离子的起始能量分布并将其总能量降低到接近其热能的程度。这简化了正交分离的要求，弥补了离子位置和能量的不同，因此改进了最终的分辨能力。分辨率改善的直接结果是将质量精度提高到了较低的ppm水平。
碰撞冷却的第二个优点在于其能够降低长期离子衰变的速率。气体碰撞缓和了内部激励并改善了肽和蛋白质离子的稳定性。当离子在压力大约为1托的背景气体的存在下产生时，这种稳定化效应似乎被最大化了。其他人公开的测量表明能够有效地消除小基群的损失和背景碎片，改善了高mw蛋白质和其它不稳定生物聚合物(例如甘油共轭物，DNA，等等)的传递。还会发生更快的衰变机制(即时型和源内型衰变)。
q0碰撞冷却的最后一个优点是产生进入质量分析器的伪连续离子流。q0中的离子碰撞引起解吸云沿着q0的轴线展开。这一展开产生了一种情况，即其中各种解吸过程开始重叠，产生了对类似电喷雾的离子进入分析器的连续引导。
通过q0之后，离子进入到第二个四极22(“Q1”)。这一四极起到了或者作为离子导管或者作为质量过滤器的作用。在这里产生了用于ms/ms或单一离子监视(SIM)实验的离子选择。
离开Q1之后，离子进入到位于碰撞室26的第三个四极24(“q2”)中。在简单实验期间，q2行使简单rf离子导管的功能。对于ms/ms实验，q2用大约10-2托的碰撞气体填充以促进低能CID。
离开q2之后，离子通过施加到q2出口与聚焦栅极28之间的DC电势差略微加速。这种加速“偏向”沿Y轴的离子速度，因而此处其速度与其m/z的平方根成反比。如果全部的具有不同m/z的离子在正交分离和自由飞行之后都要撞击探测器的话，就必须实现这种偏向。如果这种偏向没有实现，不同m/z的离子将以相同的Y轴速度进入正交分离区域。
正如飞行时间中所一直存在的，具有较低m/z的离子会在具有较大m/z的离子之前撞击探测器。沿Y轴的绝对位移水平产生了离子沿Z轴的飞行时间和离子的Y轴速度。如果探测器被放置在某一个相对于中间态mw离子而言最优化的位置上，则较轻的离子将“射击低于”探测器，到达图2中探测器的右侧。相反地，具有较大m/z的离子将“射击超过”探测器而到达图2中探测器的左侧。结果，如果要所有的离子都撞击同一个探测器位点，就有必要使所有的离子都维持恒定的Z轴和Y轴速度比率。前述的栅极偏向方法就实现了这一目的。
通过聚焦栅极28之后，离子到达了正交分离元件的调节器区域30。调节器30以接近10,000脉冲/秒(10KHz)的速度被脉动调节。离子被推入到离子光学系统的加速器柱32内，而后离开它进入到正交飞行时间(O-TOF)的自由飞行区域34中。当离子进入离子放射镜36时，能量校正便完成了。在放射镜中，离子被转向并被引导撞击V形排列的微通道板探测器38而产生快反应。
这种原型配置的其它可选择方法也可以采用。
例如，上面提过的几何结构在高加速能量下带来了执行O-TOF的困难。已经较好地确定出，离子探测肽和蛋白质的灵敏度随着全体离子能量的上升而改善。对于人胰岛素(MW＝5807.65Da)，当使用典型的微通道板探测器时，在35keV的离子能量下，探测效率接近100％。如果离子被加速到具有20或30keV的能量，则自由飞行管衬里40和其它相关部件就必须分别浮动到-20kV或-30kV。在这种电势下，在简单离子光学元件上提供稳定电绝缘的困难是众所周知的。在这种电势下安全而可靠地浮动多个元件是困难的。一个解决办法就是采用后加速技术。
与上述装置不同，这种可供选择的装置采用了探测器后加速器(未显示)。离子在离开正交分离元件之后被加速到具有大约4keV的能量，而自由飞行区域被浮动到-4kV。随着离子进入后加速器探测器组件便实现了进一步的加速。在该组件中，离子经过保持在衬里电势下的场维持栅极。然后离子在场维持栅极和探测器初级离子转换表面之间建立起来的场中再一次受到加速。这种加速场处于10-20kV的量级，跨度为4-10mm。
因为正交设计将飞行时间的测量与离子的形成分离，实现了许多的优点。
激光流量密度相关问题，例如由于离子屏蔽和离子加速场叠加而产生的峰展宽，会因为离子的解吸热柱流在正交分离和加速进入TOF质量分析器之前有更长的时间(典型地为几毫秒)进行扩展和冷却而被消除。另外，正交分离消除了大量的大峰和基线异常，其在传统分离波谱的高激光能量开始时会由于过多的EAM中性负荷所产生的化学噪音而被观察到。因为中性粒子在调节器区域中不被分离，只有离子能被传递到探测器中，从而化学噪音被相当地减小了。
这些因素能够允许在平行连续或迟豫离子分离方法中使用比通常所使用的要大2-3倍的激光流量密度。其最终结果便是，甚至在较差的样品-EAM均一性的情况下，几乎完全消除了跟踪和搜索“扫描点”的需要，也改善了外部标准质量精度的确定(典型的误差为20-50ppm)，改善了定量分析的再现性，并改善了信号噪音比。另外的好处是消除了执行低或高激光能量扫描以分析具有较宽m/z范围的离子的需要。现在单一的激光流量密度就能够用来探测所有低和高mw的离子，大大简化了对未知混合物的分析方法。
当该装置与传统的平行分离办法相比较时，可能其中一个给人印象最深的优点便是其不需要对刚性样品进行定位的能力。因为TOF测量被基本上从离子形成过程中消除了，离子的原始位置也就不再重要了。而且，由于离子的形成在高压环境中无需伴随施加高压分离场便实现了，所以对进入系统的固态样品的设计要求便大大降低了。在保持优良的外部标准质量精度性能的同时，可以采用简单的方法代替二维样品控制器。另外，样品存在表面不再需要用金属或其它导电介质制作。
概括地讲，激光解吸电离(LDI)Qq-TOF MS相对于现有的LDI-TOF MS技术具有如下优点(1)提高了外部标准质量精度(典型地20-50ppm)；(2)提高了分辨率；(3)提高了ms/ms效率；(4)提高了用单一高激光能量水平产生信号的简易性，其消除了对高和低能扫描的需要；(5)通过使用TDC技术和比最低解吸阈值高2-4倍的激光流量密度提高了定量分析能力；(6)降低了对二维样品调节器的要求；(7)对样品存在的探针表面使用塑料部件的潜力(例如，注射模制的二维探针阵列)；(8)通过使用单一离子监测降低了化学噪音并提高了测量处于EAM化学噪音领域的离子的能量。
激光解吸电离(LDI)Qq-TOF MS相对于现有MALDI-PSD方法，在蛋白质表征和识别中具有如下优点。
LDI-QqTOF提供了更高的物质分辨能力和质量精度；在数据库采掘过程中，该提高的能力降低了错误阳性数据库击中的数量，简化了识别方法。而且，QqTOF还提供了比能够用PSD MS/MS获得的灵敏度大超过一个数量级的灵敏度。
本发明的分析设备证实了MS/MS惊人的能力以及对于单一MS分析低于20ppm的质量分配误差。后者允许对大量的保留在单一亲和捕获探针表面上的蛋白质同时进行识别。
其它部件亲和捕获探针串联MS设备100典型地还包括与串联质谱仪探测器对接的数字计算机。数字计算机典型地还与激光解吸源12对接，允许该计算机既控制离子的产生又参与数据的采集和分析。
分析软件可以被装载在计算机上或者处于远程控制，但可访问地与计算机联络。例如，计算机能够与因特网相连从而允许使用能够在万维网上获得的分析软件包，例如蛋白质探勘者、PROWL或者Mascot搜索引擎。分析软件也能够远远地驻留在LAN或WAN服务器上。
亲和捕获探针为了引导分析物，例如下面将在本部分所详细说明的，至少一个吸附了分析物的亲和捕获探针16被啮合在探针界面10上，并处于能被激光解吸/电离源13查询的位置，且传递解吸离子进入串联质谱仪14。
探针16典型地具有一个或更多的吸附表面18，它们的表面可以彼此互不相同(18a，18b，18c，18d)。典型地，如果有多个吸附表面18，所有的都暴露在探针16的公共面上。
吸附表面18典型地或者是色谱吸附表面或者是生物分子亲和表面。
色谱亲和表面含有能够色谱鉴别或者分离分析物能力的吸附剂。这种表面于是包括阴离子交换部分、阳离子交换部分、反相部分、金属亲和捕获部分，和混合模式吸附剂，这些术语在色谱技术中能够理解。生物分子亲和表面含有包含能够特异结合的生物分子的吸附剂。这种表面因而能够包含抗体、受体、核酸、外源凝集素、酶、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、Staph蛋白A和Staph蛋白G。吸附表面将在下面的部分作进一步的说明。
界面10将探针16放置在与激光解吸/电离源13有查询关系的位置上。典型地，希望激光器能够查询探针吸附表面18。此外，界面10将探针16吸附表面18放置在与激光解吸/电离源13有查询关系的位置。如果吸附表面18只定位在探针16的一个表面上，探针16和/或界面10的探针固定器可以形成不对称的尺寸，这样便将探针16沿着吸附表面18存在的方向强制性插入到激光解吸源13中。
当探针16具有多个吸附表面18时，将希望激光源12能够直接寻址每一个吸附表面18。这能够通过采用提供激光源12和/或可动界面10，或者采用其组合，将它光学嵌入到激光源12和界面10之间而实现。
探针16能够是亲和捕获探针，如目前在单一MS分析中所使用的(例如，那些从Ciphergen生物系统有限公司，Fremont，CA USA商业上获得的)。
III亲和探针串联MS设备的应用本发明的上述分析设备提供了重大的优点，并提供了新颖的方法，用于(1)蛋白质发现和识别及(2)表征特异结合配偶体之间的相互作用，现在将对其依次进行说明。
总体而言，上述分析设备的优点包括在单一物质MS中执行高质量精度测量的能力，及串联MS模式与亲和捕获探针技术，特别是与特异受体结合系统，相结合的能力。
A.蛋白质的发现和识别
1.本发明方法的优点蛋白质生物学家试图解决的一系列相关问题是蛋白质的发现、识别和测定开发(assay development)。蛋白质的发现是一个在一种例如因为起到了作为诊断的标志或者执行了关键细胞功能的作用而在生物学角度感兴趣的系统中发现蛋白质的过程。蛋白质识别是确定识别所发现的蛋白质的过程。测定开发是开发可靠的测定以探测蛋白质的过程。相对于先前的技术，本发明的方法为执行这些过程的专业人员提供了优势。
本发明最主要的优点是它提供了可执行从蛋白质发现到蛋白质识别到测定开发操作步骤的单一平台。基于SELDI技术的单一平台的提供显著地降低了从发现到测定确认之间的时间在使用先前技术时要花费数月时间的操作，而现在能够只需数周或者数天。本发明的方法还显著地减少了进行实验所要求的样品数量。在先前的方法中所需要的微摩尔量的分析物，本方法能够用皮摩尔量的分析物执行相同的实验。这便克服了当样品稀少或难以增浓时的明显障碍。
先前，蛋白质发现和分离要伴随着使用二维凝胶或WesternBlots。然而，在凝胶之间相互比较以探测差异表达的蛋白质是一个困难的过程。
所发现的蛋白质现在能够通过使用质谱方法识别。重要的蛋白质在有蛋白酶的凝胶中能够被分离并最终裂解，且肽碎片能够用质谱仪和适当的生物信息学方法分析。然而，凝胶与当前的质谱仪方法不兼容，从而肽段必须从凝胶中移出。因为后面的过程不可避免地会导致样品损失，该方法需要有大量的起始蛋白和材料。当蛋白质稀少时，如重要蛋白可能遇到的情况，这便增加了处理的难度。
一旦该蛋白质被识别出来，专业人员就需要开发可靠的测定以探测该蛋白质。典型地，其涉及开发ELISA测定。这种技术，反过来，需要生产抗体。这可能是一个耗时的任务，特别是在如果感兴趣的蛋白难以产生足以用于免疫的数量的情况下。
因此，先前的技术可能需要有三种不同的技术以实现蛋白质发现、蛋白质识别和蛋白测定。本发明的方法能够用一种技术实现这些。
2.蛋白质发现、识别和测定开发(Assay Development)方法本发明的用于蛋白质的发现、识别和测定开发的方法包括制备不同的映射(map)以发现蛋白质或感兴趣的蛋白质，用亲和捕获探针串联MS识别蛋白质，和使用亲和捕获探针激光解吸电离色谱表面测定或亲和捕获探针激光解吸电离生物特异性表面测定进行验证。
该过程可如下进行。提供感兴趣的蛋白质或者通过，例如，使用保留物差异定位(difference mapping)研究来发现感兴趣的蛋白质。这些方法在，例如，WO 98/59362(Hutchens和Yip)中有说明。简单地说，两种在某些重要方面(例如，正常的与患病的；功能性的与非功能性的)不同的生物样品用保留物色谱方法检测。该方法包括将样品暴露于多个不同的色谱亲和和洗涤条件下，接着用亲和捕获探针激光解吸电离检测“保留蛋白”。在两个样品之间差异表达的蛋白便是作进一步检测的候选物。因为它们已经在质谱仪上检测过，故这些候选物蛋白的分子量是已知的。
通常，除了感兴趣的蛋白质之外还有许多蛋白质保留在芯片上。因此下一选择步骤便是改进亲和及洗涤条件，使蛋白质或者感兴趣的蛋白质保留下来从而为进一步分析精简样品。(这些在Hutchens和Yip的专利公开中也有说明。)尽管对单一感兴趣的蛋白的捕获较理想，但捕获不超过大约10个可检测蛋白则更加可取。该精炼方法为感兴趣的蛋白提供了改进的色谱测定。
然后保留蛋白在探针上用精选的蛋白水解试剂裂解，为随后的研究产生肽池。用特异的内在蛋白酶例如胰岛素消化更具有优势，因为该裂解模式已知且与生物信息学方法，包括存储于数据库中蛋白质的硅解离，兼容。然后产物肽用高分辨率、高精度的MS-MS(例如具有质量分配误差小于百万分之二十且分辨率大约10,000)分析。此时，似乎还不清楚特异肽段是兴趣蛋白的产物还是某一其它保留蛋白的产物。尽管如此，该分析仍然通过选择一个肽碎片(可能是随机的，可能基于与兴趣蛋白相一致的信息)和将该肽进行气相裂解而进行。其中一个此类的方法是碰撞诱导解离(CID)。肽不需要从芯品分离出来，因为MS-MS设备是在质谱仪中将兴趣肽与其它肽分离的。这将产生所选择肽段的进一步的裂解模式。
使用在技术上已经建立的方法，例如数据库采掘协议，从碎裂模式中获得的信息用来查询蛋白质数据库从而为产生该肽段的蛋白质生成一个或更多的假定识别候选物。该协议通常执行匹配紧密度分析的方法，其衡量蛋白质的预测质谱与选择碎片实际质谱的匹配程度。然后数据库中的蛋白质基于蛋白碎片与数据库蛋白一致性可信度的测量而被定级。了解均为已知的母体蛋白和原始物种的质量，将有助于限制所产生的候选物的识别数量。
然后，产生肽碎片的假定特征蛋白质被校核。利用从假定特征候选物初级序列数据库中和所使用的蛋白水解试剂的解离模式中获取的知识，便能够预知肽碎片，特别地，和它们的分子量，这是从特征候选物被蛋白水解试剂解离的碎片中所应该产生的。然后，这一系列预知碎片与基于质量而保留在芯片上的蛋白质水解之后所产生的实际碎片系列相比较。如果计算出了预知碎片，那么就可以确信假定特征候选物实际地与某种保留在芯片上的蛋白的识别相一致。如果没有，那么就必须通过排除的方法试验其它假定特征候选物直到产生碎片的蛋白质被识别出来。在这种状况下，所产生的与识别蛋白相一致的碎片能够从所产生的已计算过的碎片全体中排除出去。
如果在改进了亲和及洗脱条件之后只有一种蛋白质保留下来，那么就能够计算出全部的肽碎片，从而该过程便结束了。然而，如果有多于一种的蛋白质保留下来，情况就可能更加复杂。例如，分析中所使用的碎片可以是由感兴趣的蛋白质产生的，或者它可以是由保留在芯片上但不是感兴趣蛋白的蛋白质产生的。这种情况下，用所说明过的MS-MS方法重复对未计算出的肽碎片的分析的步骤直到识别出感兴趣的蛋白质或识别出所有的保留蛋白是有用的。
最后，感兴趣蛋白能够通过通过亲和捕获探针激光解吸电离方法，或者采用已被保留蛋白质确定的色谱表面或者能够被开发用来在亲和捕获探针激光解吸电离定量分析中使用的生物特异性表面，来做定量分析。生物特异性表面建立包括为识别蛋白提供结合配偶体，比如抗体，或者受体，如果一种受体已知的话，并将其结合在芯片的表面。然后，感兴趣的蛋白质就能够用已经说明过的SELDI做定量分析了。
B.分子相互作用的表征本发明的分析设备第一次使得为特异结合配偶体之间相互作用的研究提供一种灵敏、有效、单平台的方法成为可能。
特异结合相互作用处于广谱生物过程的核心。此外，测量和表征这种相互作用的能力对于全面了解这种过程是必需的先决条件；在临床水平上，测量和表征这种相互作用的能力对于理解这种过程中的病理失常和合理设计能够用于调节，或者甚至废除这种相互作用的试剂是很重要的。
在有组织性的真核组织水平上，例如，哺乳动物神经系统细胞间的信号便是通过神经递质与其同源受体间的相互作用而传播的。理解这种结合相互作用的分子机制对于全面了解这种信号机理是必需的。在临床水平上，理解这种结合相互作用的分子机制对于全面了解信号病状的机制，和对于合理设计减轻这种信号病状的药剂是必需的，药剂有利于疾病的治疗，其范围从帕金森病到精神分裂症，从强迫性行为紊乱到癫痫症。
在循环水平上，例如，B细胞受体与循环抗原的相互作用便是引发B细胞克隆扩展、分化和抗体特异性体液免疫反应所必需的。对于有利于抗原识别的抗原决定簇的了解，对全面了解免疫反应是很关键的。在临床水平上，这种理解对于设计提供更强的体液免疫的疫苗是重要的。类似地，T细胞受体与证明和抗原存在细胞上的MHC有联系的肽之间的相互作用对于引发细胞免疫是关键的。对有利于抗原识别的T细胞决定簇的理解对于设计能提供更强体液免疫的疫苗是重要的。
在单个细胞水平上，对细胞外信号的表型反应是通过至少一个，更经常地是一连串的细胞间的相互作用，从细胞表面受体与配体的起始相互作用到转导信号到细胞核的胞质内相互作用，再到蛋白质转录因子与DNA的相互作用，而传播的，然后基因表达的不同模式导致了能够观察到的表型反应。
例如，雌激素和孕酮通过卵巢细胞的差异结合对于排卵是必需的。了解类固醇激素受体与激素配体，以及另一方面，了解配体受体与基因组类固醇激素反应元件的结合相互作用的分子机制对于理解激素反应是重要的。反过来，这种理解对于理解不孕症，及对于合理设计旨在取消排卵、着床和/或胎儿成活力的药剂——例如RU486——是重要的。
这种相互作用不仅在真核系统中，而且在原核系统中及在原核与真核的相互作用中也能够发现。例如，某些革兰氏阴性菌具有侵入真核eurethra所必需的菌毛；从而理解这种相互作用对于全面了解该病理过程，及对于合理设计能够防止这种侵入的药剂是重要的。
已经有许多技术被用于该技术领域，用来研究和定位(map)特异结合配偶体之间的分子间相互作用。每一种都具有显著的优点。
在其中的第一个方法中，一个特异结合配偶体成员被固定在填充在色谱柱中的吸附剂上。为了定位(map)与第一(被结合)结合配偶体接触的第二(自由)结合配偶体的结构内的位置，第二(自由)结合配偶体被解离。尽管特异化学解离(例如，通过CNBr)或者甚至非特异化学水解也能做到，但典型地，这种解离是通过特异的蛋白水解酶。因此，消化液通过该柱以结合那些仍然与第一(固定)结合配偶体结合的第二(自由)结合配偶体。
而后，第二结合配偶体的肽被典型地用盐或pH梯度洗提，而后肽通过使用MALDI或者电喷雾电离引导进入质谱仪中而被识别。
这种方法具有多个众所周知的，而且显著的问题。首先，需要有大量纯化的第一结合配偶体以产生特异吸附。第二，需要有大量的，典型是纯化的，第二结合配偶体以用于消化、解吸和洗提，因为这些阶段的每一个都存在稀释效应和分析物损失。而且，尽管随后的质谱分析可能是高灵敏度的，然而液相分析与MS相连接偶尔也会产生分析物的损失。
也许更根本的缺点是，通过在结合第一结合配偶体之前解离第二结合配偶体，使第二结合配偶体上只有那些适当保持其分子结构的肽碎片才会结合，并随后被探测。如果，例如，抗体与抗原的结合是不连续的，而不是线性的，决定簇，这种不连续的决定簇会被裂解所破坏；不能再维持与固定化抗体的结合，从而这种抗原决定簇便不能被探测到。
该技术中的第二个方法是使用点突变来定位在蛋白结合配偶体内那些有利于分子间结合的残基。
后一方法需要已克隆蛋白质结合配偶体，产生期望的点突变，重组转化的蛋白质的表达，以及其纯化。而后，测量转化蛋白的其它结合配偶体的结合动力学，从而确定突变残基对分子间相互作用的影响。
除了经常使用的，结合配偶体之间的接触情况也能够用结合配偶体的X-射线结晶学来说明。这种技术高度有效，并能提供原子水平的分辨率，但是需要每一个结合配偶体都高度纯化，而且还需要形成合适的晶体。
本发明的亲和捕获串联质谱设备提供了改进的方法，其所需要的起始材料要少得多，排除了点突变分析、结晶，并且显著地降低了纯化的要求。
第一步是将结合配偶体的其中一个固定在亲和捕获探针上。
每一个结合配偶体都能被固定；然而是自由的结合配偶体，其有关结合接触的结构信息将被获取。利用受体/配体的相互作用作为该方法的典范，将配体固定在探针上以允许识别受体参与结合配体的区域；将配体固定在探针上也将允许识别配体参与结合受体的区域。当配体是蛋白质时——例如蛋白质激素、细胞素或者化学激活剂(chemokine)——顺次使用每一个结合配偶体的分离实验将产生对分子间接触的双边理解。
探针结合的配偶体能够通过共价的或强非共价的相互作用而固定。该选择取决于该即将固定的配偶体上适当反应基团的可获得性和探针表面的化学本质。适当的化学性质在分析技术领域中是众所周知的。
例如，当即将固定的结合配偶体具有自由氨基酸基团时，在固定结合配偶体的自由氨基酸基团与探针表面的碳酰二咪唑之间能够形成共价键。类似地，也能够利用固定结合配偶体的自由氨基酸或硫醇基团将该结合配偶体共价键合到具有环氧基团的探针表面上。强配位键或配价(dative)键能够在固定结合配偶体的自由巯基基团与探针表面上的金或铂之间形成。
而后，选择地，探针表面上的残余反应位点会被封闭以减少对活化探针的非特异性结合。
然后，第二(自由)结合配偶体与亲和捕获芯片相接触并被允许与第一(固定)结合配偶体结合。
如果第二结合配偶体是已知的并且是可以获得的，或者，更典型地，是从不均匀混合物，例如怀疑含有第二结合配偶体的生物样品中捕获出来的，第二(自由)结合配偶体在溶液中能够是暂时纯净的。该生物样品，如在较早前描述过的生物标记物的发现方法中，可以是生物流体，例如血液、血清、血浆、淋巴、间质流体、尿、分泌液，也可以是细胞溶解物、细胞分泌物，或者其中部分分馏和纯化的组分。
然后，该探针用一种或更多的具有确定的洗脱性质的洗脱液冲洗。这些冲洗用于减少与探针非特异结合的物种的数量。
然后，将能量吸附分子加入到，典型地是，液相中，并被允许干燥。能量吸收分子的应用会受到影响，其与现在所使用的亲和捕获探针所受的影响的方式相同；当使用蛋白质芯片阵列(Ciphergen生物系统有限公司，Fremont，CA，USA)时，能量吸收分子根据制造商的使用说明书使用。
然后，非共价结合亲和捕获探针的物质——如与第一(固定)结合配偶体特异结合的第二结合配偶体、非特异结合探针表面的分子、非特异结合第一结合配偶体的分子——在激光解吸电离质谱的第一相中被探测。
质谱仪可以是单级亲和捕获LDI-MS设备，比如Ciphergen生物系统有限公司(Fremont，CA，USA)的PBS II。但是，本发明的亲和捕获串联MS提供了更高的质量精度和更高的质量分辨率，从而是优先选择的。
典型地，第二(自由)结合配偶体可从较早前的研究中获知，且它的存在或不存在可以用质谱迅速地确定。如果第二(自由)结合配偶体未知，则每一种结合到探针上的物质可能都要依次被检测。如果可检测物种的数量太高，可以用具有不同洗脱性质(典型地，严格性递增)的洗脱剂冲洗该亲和捕获探针，以减少所存在的用于分析的物种的数量。
一旦第二(“自由”)结合配偶体与第一(固定)结合配偶体的结合被确认，第二结合配偶体便被解离。这典型地伴随着第二结合配偶体(在这种情况下，其非共价地，但特异地与第一结合配偶体结合，顺次地，第一结合配偶体被固定在探针表面上)与特殊的内在蛋白酶，如胰岛素、Glu-C(V8)蛋白酶、内在蛋白酶Arg-C(或者是丝氨酸蛋白酶，或者是半胱氨酸蛋白酶Arg-C酶)、Asn-N蛋白酶，或者Lys-C蛋白酶，的接触。
消化之后，肽被质谱探测。
如果第二结合配偶体所有的碎片都要识别的话——例如，用于证实通过肽质量指纹分析对第二结合配偶体的识别——可以施加能量吸附分子并用探针通过激光解吸电离引导肽进入质谱。出于这种目的，可以使用Ciphergen PBS II单加速级线性TOF MS；本发明，能提供更高质量精度和质量分辨率的串联MS是优先选择的，因为增高的分辨率和精度降低了在任何给定的置信度水平上从任何给定数据库查询中返回的假定“命中”的数量。
然而更典型地，还是希望能够分析那些与固定化第一结合配偶体结合最紧密的第二结合配偶体的碎片。在这种情况下，在添加能量吸附分子之前，用一种或者更多的洗脱剂冲洗探针。
在这种情况下，探针插入到本发明串联MS的界面当中，而后第二结合配偶体的碎片(典型的是肽)被探测。
如果第二(自由)结合配偶体的识别已知，则被探测碎片的质量通过将解离酶已知的解离规则应用到第二结合配偶体的初级氨基酸序列中，便能够与所预测的质量作比较。在这种方法中，每一个碎片都能够被识别出来，这样便确定出了第二结合配偶体的结构中导致与第一结合配偶体结合的部分的位置。
尽管，理论上可以使用单级MS设备，但实际上还存在不是从第二结合配偶体中产生的碎片，这使得分析变得混乱。因此通常情况下的最终识别会从本发明设备的高质量分辨率和质量精度中受益，且进一步会从MS/MS分析中受益。
如果第二(自由)结合配偶体未知，则该结合配偶体能够用MS/MS分析识别。
典型地，这种分析采用如下形式，即在MS的第一阶段中选择第一母体肽，将选择的肽解离，且然后在MS分析的第二阶段产生碎片的质谱。在气相中，解离优选地通过碰撞诱导解离而实现。在本发明的亲和捕获串联质谱仪的优选实施例中，CID在q2中会受到与大约10-2托的氮气相碰撞的影响。
而后，利用该碎片谱通过已知的运算法则，如Yates et al.，美国专利号Nos5,538,897和6,017,693所公开的，及蛋白质勘探者MS-TAG(http//prospector.ucsf/edu)模块所使用的，来查询序列数据库。
假定的识别可以进一步通过选择第二母体肽并重复该方法而被验证，正如为了证实所有肽均来自于一种可确认的母体所需要的那样。
其后，一旦第二结合配偶体被识别出来，正如上面所提及的，分子间相互作用的机制便能够被研究了。将裂解酶(或化学试剂，如CNBr)已知的解离规则应用到刚刚识别出的第二结合配偶体的初级序列上，且将实验测量的肽定位到理论消化(theoretical digest)上，由此便识别出了已经结合在固定化第一结合配偶体上，且因此在天然分子中也有利于与固定化第一结合配偶体的结合的肽。且如上所述，可以通过递增严格性的洗脱重复该实验以识别那些结合最紧密的肽。
也可以执行其它的微扰以进一步阐释分子间结合的机制。
可以改变在第二结合配偶体裂解之后冲洗探针的洗脱剂的洗脱性质，以识别促成最强相互作用的碎片，或者识别有利于结合的pH依赖或盐依赖的接触。
这一原理在色谱和分子生物学技术领域中当然是众所周知的，即随着洗脱严格性的上升(例如，盐浓度上升，温度升高)，那些与固定化第一结合配偶体结合较不紧密的碎片将从第一结合配偶体上洗脱下来。在现有几何体系中，这种结合较差的碎片将从探针上洗脱下来，并在随后的质谱分析中丢失掉。因此，能够执行一系列的，其探针或相同对应物的探针以递增的严格性冲洗的实验，于是便产生了一系列分级的第二结合配偶体碎片的子集。
如上面所提及的，第一(固定)和第二(自由)结合配偶体可以互换，从而允许洗脱另外一个结合配偶体的结合接触部位。
更有用的摄动(微扰)是去除或改变一个或两个结合配偶体上的后翻译改性。例如，如果第一结合配偶体是糖蛋白，在结合第二结合配偶体之前和/或之后，用一种或更多种特异的或非特异的糖蛋白酶处理将有助于阐释糖残基对结合的贡献。
类似地，当其中一个结合配偶体是核酸时，在结合了另一个结合配偶体之后用核酸酶处理核酸结合配偶体能够有助于识别关键的结合残基。
上面所述的表征分子间相互作用的方法代替了先前技术的多平台、高劳动强度、低灵敏度的技术操作，代之以单平台、更有效率、高灵敏度的方法。该方法能够应用于多种不同的生物系统和问题之中。
如上面所建议的，本发明的方法能够用于抗原决定簇的定位(mapping)——也就是，识别抗原中有利于结合抗体、T细胞受体、或MHC的接触部位。该方法能够用于阐释多蛋白复合体中生物配体与其受体，转录因子与核酸，转录因子与其它转录因子的结合的机制。
尽管上面专门讨论讨论了蛋白/蛋白相互作用，但本发明的方法能够实践地说明外源凝集素与糖蛋白之间，蛋白质与核酸之间，及小分子与受体之间的结合相互作用。
尤其对于小分子配体，该方法也能够应用于设计已知受体的激动剂和对抗物。
在过去十年里，许多技术已经发展起来用于组合产生大量的小分子，并具有在各种均匀的和活细胞测定中筛选这些分子用于影响一种或更多的生物过程的能力。例如，均匀闪烁邻近测定能够用来筛选与已知受体结合的组合库；基于图象的数字细胞测定能够用于筛选组合库中的复合物用于下游效应，如受体的细胞质/细胞核转运，改变细胞内钙的分布，改变细胞活动性。
但是，一旦这种先导化合物被识别出来，对小分子与其受体的相互作用的理解将有助于明智地设计具有更好药物代谢动力学和治疗学指数的分子。本发明的技术非常适合于这种用途。
如果小分子提供的信号接近于通过能量吸收分子而得出的信号，那么MS将以单离子监视方式执行，从而只寻找组合库组分中已知的物质。
举例1前列腺癌生物标记物的识别传统地，前列腺癌在发现血液水平的前列腺特异抗体(PSA)增高之后通过活组织切片检查而诊断。在正常男性中，PSA存在水平低于1ng/ml。对于BPH和前列腺癌肉瘤，PSA水平可以提高到4-10ng/ml。Chen et al.J.Urology 1572166-2170(1997)；Qian et al.，Clin.Chem.43352-359(1997)。PSA已知具有胰凝乳蛋白酶活性，能够裂解酪氨酸和亮氨酸的C末端。Qian et al.，Clin.Chem.43352-359(1997)。
使用蛋白质芯片差异显示技术来分析从BPH患者及前列腺癌患者获取的精液浆。图3显示了单一BPH和前列腺癌患者精液蛋白的测验图。虚拟(virtual)凝胶显示用于提高样品之间的可视化比较。前列腺癌减去BPH的蛋白质测验图的差异位点显示在凝胶观测点的下方。差异位点的阳性显示信号暗示蛋白质在前列腺癌中被上调了(upregulated)，而负峰代表前列腺癌向下的蛋白调节。探测到了多个独特的上调信号，这表明可能是前列腺癌的生物标记物。
在探针上分离其中一个该被上调的蛋白是通过使用混合模式表面和中性pH缓冲液冲洗(见图4)而实现。在这种情况下，该蛋白被富集以接近均衡(homogeneity)。然后，该富集的生物标记物候选物被用胰岛素暴露以原位消化。培育之后，添加饱和的CHCA(基质)溶液并且随后用SELDI-TOF分析消化产物。
有多种肽被探测出来(见图5)。生成的肽信号被提交以进行蛋白质数据库分析，并且进行人类semenogellin I的初步识别。这种识别有些复杂，因为生物标记物具有大约5751Da的分子重量，远小于semenogellin I的重量(MW 52,131Da)。
相同的纯化蛋白质被提交以用于蛋白质芯片LDI Qq-TOF MS检测(见图6)。因为处于5751Da的母体离子，超过了目前LDI Qq-TOFMS/MS分析的质量限制(3000M/z)，因此使用了二价离子用于CIDMS/MS排序(见图7)。CID MS/MS结果用于执行蛋白质数据库采掘。26种MS/MS离子中的15种被映射(mapped)回人类精液碱性蛋白(SBP)，semenogellin I的蛋白质水解导出碎片，提供了这一候选生物标记物的最终识别。
尽管例如这些初始研究快速显示了蛋白质的生物标记物，任何生物标记物的完全确认都需要分析成打的或者甚至上百的相关样品以获得关于表达和发病率的统计上显著的信息。
所有在此处提到的专利、专利公布和其它公开发行的参考文献都特此整体引用以为参考，每一个都独立地而具体地参考引用。通过本文中各种参考文献的引用，申请人不承认任何特别的参考文献是其发明的“现有技术”。
尽管提供了具体的例子，上面的描述是例证性的，但不限于此。先前说明过的实施例的任何一种或更多的特征能够以任何方式与本发明任何其它实施例的一种或更多的特征相结合。而且，在审阅说明书时，本发明的多种变体对于那些本技术领域中的技术人员而言将是显而易见的。因此，本发明的范围不应当根据上面的描述而确定，而是应当根据附加的权利要求书及其完全的等价物范围而确定。
权利要求
1.一种分析设备包括激光解吸电离源；亲和捕获探针界面；和串联质谱仪，其中该亲和捕获探针界面能够啮合亲和捕获探针，并将该探针放置在与该激光源有查询关系并且同时与该串联质谱仪联络的位置。
2.权利要求1中的分析设备，其中该激光解吸电离源包含激光激发源和激光光路系统，该激光光路系统能够将激发光子从该激光激发源传送到该探针界面。
3.权利要求2中的分析设备，其中该激光光路系统从该激光激发源向每平方毫米查询探针表面递送大约20-1000微焦的能量。
4，权利要求2中的分析设备，其中该激光激发源从包含连续激光器和脉冲激光器的组中选择。
5，权利要求2中的分析设备，其中该激光激发源从包含氮气激光器、Nd:YAG激光器、铒:YAG激光器和CO2激光器的组中选择。
6.权利要求2中的分析设备，其中该激光激发源是脉冲氮气激光器。
7.权利要求3中的分析设备，其中该激光光路系统包括从包含透镜、反光镜、棱镜、衰减器和光束分割器的组中选择的光学部件。
8.权利要求3中的分析设备，其中该激光光路系统包括具有输入端和输出端的光学纤维，其中该激光激发源与该光学纤维输入端耦连。
9.权利要求8中的分析设备，其中该激光光路系统还包括光学衰减器。
10.权利要求9中的分析设备，其中其中该衰减器放置在该激光激发源和该光学纤维输入端之间。
11.权利要求9中的分析设备，其中该衰减器是光学耦合器，该耦合器将该激光激发源耦合于该光学纤维输入端。
12.权利要求9中的分析设备，其中该衰减器放置于该光学纤维输出端与该探针之间。
13.权利要求8中的分析设备，其中该光学纤维输出端具有大约200-400μm的最大直径。
14.权利要求13中的分析设备，其中该光学纤维输入端具有大约400-1200μm的直径。
15.权利要求2中的分析设备，其中该激光解吸电离源还包括探针观察光学器件。
16.权利要求8中的分析设备，还包括光学耦合器，该耦合器将该激光激发源耦合于该光学纤维输入端。
17.权利要求16中的分析设备，其中该耦合器或该纤维被分叉并从该激光激发源分离出一部分能量。
18.权利要求17中的分析设备，其中该耦合器或该光学纤维被分叉并允许引导可见光照明解吸点。
19.权利要求15或18中任何一个的分析设备，还包括CCD照相机，该CCD照相机被定位以探测从该探针反射回来的光。
20.权利要求1中的分析设备，其中该亲和捕获探针界面包括探针固定器，该探针固定器能够可逆地啮合该亲和捕获探针。
21.权利要求20中的分析设备，其中该亲和捕获探针界面还包括探针导入口，该探针导入口能够可逆地啮合该探针固定器。
22.权利要求21中的分析设备，其中该亲和捕获探针界面还包括探针位置调节器组件和界面离子收集系统，当该探针固定器啮合于该界面中时，该探针位置调节器能够接触该探针固定器，并且相对于该激光激发源和该离子收集系统可动地定位该探针固定器和该探针。
23.权利要求22中的分析设备，其中该调节器能够平移或旋转定位该探针固定器。
24.权利要求22中的分析设备，其中该界面还包括真空抽空系统，该系统耦合于该探针导入口。
25.权利要求24中的分析设备，其中该真空抽空系统能够在该探针界面内产生低于大气压的压力。
26.权利要求1中的分析设备，其中该串联质谱仪从包含QqTOFMS、离子阱MS、离子阱TOF MS、TOF-TOF MS和傅立叶转换离子回旋加速器共振MS的组中选择。
27.权利要求26中的分析设备，其中该串联质谱仪是QqTOFMS。
28.权利要求2中的分析设备，其中该串联质谱仪是QqTOF MS，该激光激发源是脉冲氮气激光器。
29.权利要求1中的分析设备，其中该串联质谱仪具有20-50ppm的外部标准质量精度。
30.权利要求1中的分析设备，其中该探针上的激光流量密度大约是最小解吸阈值的2-4倍。
31.权利要求1中的分析设备，还包括亲和捕获探针，其中该亲和捕获探针啮合在该亲和捕获探针界面内并放置在与该激光源有查询关系的位置且同时与该串联质谱仪联络。
32.权利要求31中的分析设备，其中该亲和捕获探针具有至少一个定位于与该激光源有查询关系位置的样品吸附表面。
33.权利要求32中的分析设备，其中该至少一个样品吸附表面从包含色谱吸附表面和生物分子亲和表面的组中选择。
34.权利要求33中的分析设备，其中该至少一个样品吸附表面是色谱吸附表面。
35.权利要求34中的分析设备，其中该色谱吸附表面从包含反相、阴离子交换、阳离子交换、固定化金属亲和捕获，和混合模式表面的组中选择。
36.权利要求33中的分析设备，其中该至少一个样品吸附表面是生物分子亲和表面。
37.权利要求36中的分析设备，其中该生物分子从包含抗体、受体、核酸、外源凝集素、酶、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、Staph蛋白A和Staph蛋白G的组中选择。
38.权利要求31中的分析设备，其中该亲和捕获探针具有多个放置在与该激光源有查询关系位置上的可单独寻址的样品吸附表面。
39.权利要求38中的分析设备，其中每一个该可单独寻址的样品吸附表面从包含反相色谱吸附表面、阴离子交换色谱吸附表面、阳离子交换色谱吸附表面、固定化金属亲和捕获色谱吸附表面、混合模式色谱吸附表面、抗体亲和表面、受体亲和表面、核酸亲和表面、外源凝集素亲和表面、酶亲和表面、生物素亲和表面、抗生物素蛋白亲和表面、抗生蛋白链菌素亲和表面、Staph蛋白A亲和表面和Staph蛋白G亲和表面的组中选择。
40.权利要求38中的分析设备，其中该多个可单独寻址的样品吸附表面包含至少两种不同的吸附表面。
41.权利要求1中的分析设备，还包括数字计算机，其中该数字计算机与该串联质谱仪的探测器连接。
42.权利要求41中的分析设备，还包括软件程序，该软件程序由该数字计算机执行。
43.权利要求42中的分析设备，其中该软件程序本地定位于该计算机。
44.权利要求42中的分析设备，其中该软件程序是非本地的但可通信访问该计算机。
45.权利要求42中的分析设备，其中该软件程序能够控制该激光解吸电离源。
46.权利要求42中的分析设备，其中该软件程序能够通过该串联质谱仪控制数据采集的至少一个方面。
47.权利要求42中的分析设备，其中该软件程序能够在通过该串联质谱仪获得的数据上执行至少一个分析程序。
48.权利要求42中的分析设备，其中该软件程序能够控制该激光解吸电离源，能够通过该串联质谱仪控制数据采集的至少一个方面，并能够在通过该串联质谱仪获得的数据上执行至少一个分析程序。
49.一种用于分析至少一个检测蛋白的方法包括(a)在亲和捕获蛋白质芯片上捕获一个或多个测试蛋白；(b)用蛋白水解试剂在蛋白质芯片上产生测试蛋白的蛋白质裂解产物；和(c)用串联质谱仪分析至少一个蛋白裂解产物，其中分析包括(i)将蛋白裂解产物从蛋白质芯片解吸到气相中以产生相应的母体离子肽，(ii)用第一质谱仪选择母体离子肽用于随后的碎解，(iii)在气相中所选择的碎解条件下碎解该选择的母体离子肽以产生产物离子碎片和(iv)产生产物离子碎片的质谱；由此，该质谱提供了对测试蛋白的分析。
50.权利要求49中的方法，还包括(d)通过递交质谱到蛋白质数据库采掘协议，为测试蛋白确定至少一个蛋白识别候选物，该蛋白质数据库采掘协议根据该质谱和数据库中蛋白质的理论质谱之间匹配紧密度的测量而在数据库中为测试蛋白识别至少一个蛋白质识别候选物。
51.权利要求50中的方法，其中(d)还包括将测试蛋白的质量和测试蛋白的原始物种递交给协议。
52.权利要求50中的方法，还包括(e)比较识别候选物与测试蛋白，这通过(i)产生(b)中蛋白裂解产物的质谱，(ii)将蛋白裂解产物的质谱递交给计算机协议，该协议确定通过使用蛋白水解试剂而产生的预测的识别候选物裂解产物的理论质谱与蛋白裂解产物的质谱之间的匹配紧密度测量，由此，该测量指示了对应于测试蛋白的蛋白质芯片上的蛋白裂解产物。
53.权利要求52中的方法，还包括(f)重复(c)，其中所选择的母体离子肽与由识别候选物预测的蛋白裂解产物不对应；和(g)对于(f)中的所选择的母体离子肽重复(d)。
54.权利要求49中的方法，其中测试蛋白是在第一和第二生物样品之间差异表达的蛋白质。
55.权利要求54中的方法，其中第一和第二生物样品来源于正常源和病理源。
56.一种探测分析物的方法，该方法包括将亲和捕获探针啮合在权利要求1分析设备的亲和捕获探针界面中，该亲和捕获探针具有结合其上的分析物；用该激光源从该探针解吸和电离该分析物或其碎片；且然后通过在该解吸离子上的串联质谱仪测量探测该分析物。
57.权利要求56中的方法，还包括在该解吸和电离步骤之后及该探测步骤之前，执行该解吸离子的碰撞诱导解离的步骤。
58.权利要求57中的方法，还包括，在解吸和电离步骤之后及执行该解吸离子的碰撞诱导解离步骤之前，选择将要碰撞解离的离子的一个子集的步骤。
59.权利要求58中的方法，还包括在该亲和捕获探针界面中啮合该亲和捕获探针之前，将该分析物吸附到该探针上的步骤。
60.权利要求59中的方法，还包括在该将该分析物吸附到该探针上之后及将该探针啮合到该探针界面内之前，用能量吸附分子使该探针与该分析物粘着接触的步骤。
61.一种亲和捕获探针界面，用于啮合亲和捕获探针和将该探针定位成与激光源有查询关系并同时与串联质谱仪联络，包括亲和捕获探针固定器；亲和捕获探针导入口；亲和捕获探针位置调节器及组件；真空和气动组件；和界面离子收集系统，其中该亲和捕获探针固定器可通过该导入口啮合，其中该探针固定器，当啮合在该口中时，被放置成与该亲和调节器和组件相接触，其中该真空和气动组件当与该口啮合时能够降低该探针周围的压力，并且其中该调节器能够通过该离子收集系统定位该探针固定器以用于离子收集。
62.权利要求22中的分析设备，其中该离子收集系统包括静电离子收集组件、气动离子收集组件和从包含静电离子引导装置和RF离子引导装置的组中选择的离子引导装置。
63.权利要求24中的分析设备，其中该导入口抽空系统包括真空泵、压力传感器、真空兼容管道及连接配件和真空兼容阀。
全文摘要
本发明提供了分析装置，其包括亲和捕获探针界面、激光解吸电离源和串联质谱仪。也提出了一种用于蛋白质发现及识别和利用本发明的装置表征分子相互作用的新方法。
文档编号H01J49/40GK1502116SQ00819959
公开日2004年6月2日 申请日期2000年10月11日 优先权日2000年10月11日
发明者史高特·温伯格, 沃纳·安斯, 亚历山大·拉博达, 维克托·斯派塞, 雷蒙德·G·布赖恩, 肯·史旦丁, 比德·托纳托, G 布赖恩, 斯派塞, 史高特 温伯格, 大 拉博达, 安斯, 托纳托, 旦丁 申请人:赛弗根生物系统股份有限公司