专利名称：：儿童急性淋巴细胞白血病基因分型诊断芯片的制作方法
技术领域：
：本发明涉及儿童急性淋巴细胞白血病基因分型诊断芯片。
背景技术：
：儿童白血病是儿童期最常见的恶性肿瘤，占儿童肿瘤的30%。我国每年新发儿童白血病2万例左右，其中儿童急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)是最常见的类型，占儿童白血病的75%80%。20世纪80年代后，由于多药联合强化疗及有力的支持治疗，儿童ALL的治愈率在世界发达国家已达80M以上，在北京、上海等先进医院已达75%以上，但近30年来ALL治愈率无明显提高，且临床研究证实，更强烈的化疗未必能提高治愈率，反而会增加与化疗相关的死亡率和继发第二肿瘤。其重要原因是白血病的发病机理至今不清、缺乏合理的分子分型，很难实施特异性和个性化治疗。所以对儿童ALL的研究重点是在初诊时作出精确的标准化分型，继而指导合理的临床危险度分型和有效的分层治疗，这样不仅能进一步提高儿童ALL的治愈率，还将减少化疗并发症、提高康复儿童的生存质量。目前国际上对儿童ALL的分型采用MICM分型，即形态学(morphology)、免疫学(immunology)、细胞遗传学(cytogenetics)和分子生物学(molecularbiology)分型，在MICM分型的基础上，结合临床表现如年龄、初诊白细胞数、对强的松诱导治疗的反应性、诱导缓解治疗结束时的骨髓缓解情况等特点，将儿童ALL进一步划分为标危、中危、高危等不同临床危险度组，然后给予不同强度的治疗方案。形态学分型1976年法国(French)、美国(American)和英国(Britain)的血细胞形态学专家讨论制订了关于急性白血病的分型诊断标准，简称"FAB"分型。据此标准，将ALL分成L1L3三型，各型的形态学特点见表l。表lALL的形态学分型及特点FAB分型细胞核核仁胞质颗粒Ll以小原淋巴细胞为主核染色质均匀，核形规则核仁小，不明显胞浆少无颗粒以大原淋巴细胞为主，大小不一核染色质不均匀，核形不规则核仁1个或数个、较大胞浆量中等，胞浆空泡不定无颗粒L3以大原淋巴细胞为主核染色质细点状，均匀核形规则，核仁1个或数个胞浆量中等，胞质内含大量空泡无颗粒免疫学分型淋巴细胞在不同的发育和分化阶段表达不同的抗原，用单克隆抗体检测淋巴细胞的分化抗原，可将ALL分成B-ALL和T-ALL两大系列及不同的亚型，见表2。表2ALL的免疫学分型3<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>*在临床实际工作中，T-ALL已不再分亚型细胞遗传学和分子生物学分型分别从亚细胞水平和分子水平检测白血病细胞的染色体DNA的变化情况，所以两者在本质上是一致的。常见的染色体异常和相应融合基因以及临床预后见表3。表3ALL的细胞遗传学和分子学分型<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>近30年来MICM分型一直是指导临床分层治疗的主要依据，发达国家已普遍采用，如患儿白血病细胞只要含有t(9;22)即BCR-ABL融合基因，则划分入高危组治疗；而含有t(12;21)即TEL-AMLl或t(l;19)E2A-PBXl，则提示对化疗反应较好，可能划入标危组或中危组治疗。在国内MICM分型只能在大城市的先进医院开展，而绝大部分的基层医院仅能开展形态学和部分免疫学检査，使儿童白血病得不到正确的诊断分型和危险度分组，严重影响了疾病的合理治疗，造成了许多不必要的并发症、复发甚至死亡，不仅给患儿本身、而且给家庭及社会带来了不可弥补的严重伤害和不和谐因素。目前，在国内能开展MICM分型的医院，这四项检査不仅耗时较长、而且费用较贵，平均需要时间周期5-7天，费用3000元左右。同时，30年来的临床实践发现，一半以上的儿童ALL至今未能检出染色体易位(融合基因)，即使检出有相同融合基因的患儿采用相同的治疗方案也出现治疗反应不同的表现，说明具有相同形态学、免疫学的ALL还具有更微观水平的其他区别。目前已公认白血病是多基因、多信号通路改变造成的肿瘤，因此探索新的基因分型方法以指导临床合理危险度分型已成为儿童白血病个性化治疗的迫切需要。随着人类基因组计划即全部核苷酸序列测序的完成，人们可以通过对全基因组的分析来了解个体在不同生长发育阶段或不同生理状态下的大量基因信息和相应生物功能。由此应运而生的基因芯片技术以其无可比拟的大信息量、高通量、快速、准确的特点，已被广泛用于生物研究领域，其中基因表达谱芯片技术在儿童白血病i会断分型和预测预后方面具有广阔的应用前景。由于基因芯片技术的发展，近10年来基因表达谱芯片用于儿童白血病诊断分型研究进展迅速1999年Golub等首先在Science报道了基因芯片在白血病中的应用，作者分析了27例儿童ALL和11例成人AML标本，发现了1100个相关表达基因，优化出50个基因对白血病进行ALL和AML分类，并用另一组34例白血病标本进行检验，正确率达100%。其后美国St.Jude儿童研究医院Yeoh及Ross等分别利用寡核苷酸芯片分析了300多例儿童ALL标本，采用非监控性的系统聚类分析方法，识别出6个具有独特临床特点的白血病亚型，即T-ALL、BCR-ABL+ALL、E2A-PBX1+ALL、TEL-AML1+ALL、MLL基因重排+ALL和超二倍体且2n〉50的ALL，另外还有部分标本具有独特的基因表达谱，可能属于某种尚未发现的新亚型。Willman等利用Vxlnsight软件，发现JL童ALL可分为9个组，包括2个T-ALL组和7个前体B-ALL组，每组都具有独特的基因表达谱，但在任一组中都没有确定出共同的细胞遗传学异常具有t(12;21)或超二倍体的病例趋向于聚集在一起，主要在C组、Z组和X组的顶部，具有t(l;19)的病例，Y组中者较A、B组中者治疗效果差，具有t(9;22)的病例也并不简单地聚集在一起，而是分布于全部前体B-ALL组中。Hoffmann等检测了104例ALL患儿的微阵列数据，用基于决策树的监控下的机器学习算法分析得出用26个基因即可进行准确的分型，并且其中70%的基因是先前未经鉴定的新标志。虽然全基因组芯片在白血病的基因诊断和分型中已被证明是有效的，但昂贵的价格、复杂的分析方法使其在临床应用上面临巨大的困难。因此，研究人员力图从表达谱中提取出少数基因进行基因分型。Yeoh及Ross等利用监控性聚类分析方法，分别识别出271个或588个基因，可以准确地识别出上述亚型，准确率达到97%。Kohlmann等利用这些基因在成人ALL中也得到了相似的结果。
发明内容本发明的目的是提供一种儿童急性淋巴细胞白血病基因分型诊断芯片。本发明所提供的儿童急性淋巴细胞白血病基因分型诊断芯片，是在载体表面固定有62种DNA片段阵列的DNA芯片，所述62种DNA片段阵列的核苷酸序列分别为序列表中的序列1至序列62。本发明所述基因芯片可用来对儿童急性淋巴细胞白血病进行基因分型。本发明的另一个目的是提供一种儿童急性淋巴细胞白血病基因分型方法。本发明所提供的儿童急性淋巴细胞白血病基因分型方法，是用所述基因芯片进行表达检测，对儿童急性淋巴细胞白血病进行分型。儿童ALL常规MICM分型需要时间周期S-7天，费用3000元左右。用本发明的基因芯片进行分型检测费用仅需1000元左右，且检测时间将縮短至l-2天。更重要的是，本发明的基因芯片能提供精确的分型，有助于临床正确选用合适强度的化疗方案，减少并发症、提高治愈率和生存质量。应用本发明的基因芯片对儿童ALL进行基因学分型，不仅可以节约诊治费用，而且对保护劳动力资源、促进家庭及社会和睦具有重大意义。图1为535例儿童ALL层次聚类分型。图2为北京儿童医院100例儿童ALL的基因芯片非监控聚类分析。具体实施例方式采用北京儿童医院儿童ALL(IOO例)和国外已发表的儿童ALL(535例)全基因组Affymetrix芯片数据(YeohEJ,RossME,ShurtleffSA,etal.Classification,subtypediscovery,andpredictionofoutcomeinpediatricacutelymphoblasticleukemiabygeneexpressionprofiling.CancerCell,2002,1(2):133-143.RossME,ZhouXD，SongGC，etal.Classificationofpediatricacutelymphoblasticleukemiabygeneexpressionprofiling,Blood，2003，102(8):2951-2959.HoffmannK，FirthMJ,BeesleyAH,etal.Predictionofrelapseinpaediatricpre-Bacutelymphoblasticleukaemiausingathree-generiskindex.BritishJournalofHaematology,2008,140(6):656—664.)，样本总计635例。其儿童ALL的分型情况见表4:表4儿童ALL分型ALL亚型北京儿童医院ALL病例国外发表ALL病例合计病例BCR-ABL63440E2A-PBX174855MLL-AF444852T-ALL1096106TEL-AMU29100129无融合基因B-ALL44110154超二倍体>50未分9999样本总数100535635用基于递归支持向量机的递归特征筛选法(§VM-RFE)(Guyon,I.，J.Weston,etal.(2002)."GeneSelectionforCancerClassificationusihgSupportVectorMachines."MachineLearning46:389-422)对国外数据库535例样本进行临床亚型分析，筛选出62个与临床亚型密切相关的特征基因。并在此基础上构建了用于ALL分类的数学模型。用我们构建的分类模型对535例国外ALL样本进行10-fold交叉验证，分类结果与国外实验室基于实验的分类结果符合率达97.6%，535例样本中只有13例的计算分型结果与实验分型结果不符。这62个特征基因的分型效果可以用无监控的层次聚类图加以展示，BCR-ABL、Hyperdiploid>50、TEL-AML1、E2A-PBX1、MLL和T-ALL都被准确而清晰地聚在一起(图l，其中未标出的为无融合基因B-ALL)。根据上述的分析结果，将儿童急性淋巴细胞白血病分成7亚型，分别为BCR-ABL、Hyperdiploid>50、TEL-AMLl、E2A-PBX1、MLL、T-ALL和无融合基因B-ALL。筛选出的62个特征基因与ALL主要亚型之间的对应关系见表5。表5儿童ALL基因分型探针(62个)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注将BCR-ABL、Hyperdiploid>50、TEL-AML1、E2A-PBX1、MLL、T-ALL分型后，剩下的即为无融合基因B-ALL型。ALL分类的数学模型对100例ALL基因芯片数据的验证基于62个特征基因在535例国外样本中的表达谱构建分类模型，并用该模型对北京儿童医院100例样本数据进行分型，亚型分类准确率达97%(表6)。表6用62个特征基因对北京儿童医院ioo例样本分类的准确率临床亚型正确率敏感性特异性BCR-ABL99.0%83.30/o100o/oE2A-PBX1100%100%100%MLL酵/o100%100%NofusionB-ALL97.0%95,5%94.6%T-ALL100%100%100%TEL-AMLl98.0%100%97.2%总体正确率=97.0%敏感性=真阳性样本个数/(真阳性样本个数+假阴性样本个数)特异性=真阴性样本个数/(真阴性样本个数+假阳性样本个数)*44例nofusionB患者中，有24例被预测为Hyperdiploid〉50亚型。实施例l、儿童急性淋巴细胞白血病基因分型诊断芯片1)制备儿童急性淋巴细胞白血病基因分型诊断芯片首先进行62个目标基因的序列与数据库分析；然后设计探针，包括上述62个基因探针和36个对照探针，探针长60个碱基；进行玻片和寡核苷酸的质量检测；以专利的"高密度官能化载片及其制备方法"进行芯片涂布生产；以专利的"多流道非接触式基因探针喷液头"进行喷液，每次可以同时高速布放200个基因探针；最后是成品芯片的质量控制，进行喷液品质、芯片固化与芯片一致性的质量检测、撰写COA文件，芯片出货。2)用儿童急性淋巴细胞白血病基因分型诊断芯片进行分型用本发明的儿童急性淋巴细胞白血病基因分型诊断芯片对北京儿童医院100例ALL进行基因学分型，能准确地将儿童ALL分为BCR-ABL、Hyperdiploid>50、TEL-AML1、E2A-PBX1、MLL、T-ALL和无融合基因B-ALL等七个亚型，只有3例病人的芯片基因学分型与常规MICM分型结果不一致，符合率达97%(表7)。9表7IOO例儿童ALL的MICM分型结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>序列表<110〉首都医科大学附属北京儿童医院中国科学院遗传与发育生物学研究所<120〉儿童急性淋巴细胞白血病基因分型诊断芯片<160>62<210>1<211>414<212>DNA<213>人工序列<220〉<230><220〉<221〉misc_feature<222>(157「(157)<223>nisa,c，g,ort<400>1gtatcaaaatcttccaattatcatgctcacctgaaagaggtatgctctcttaggaataca60gtttctagcattaaacaaataaacaaggggagaaaataaaactcaaggagtgaaaatcag120gaggtgtaataaaatgttcctcgcattcccccccgcntttttttttttttttgactttgc180cttggagagccagagcttccgcattttctttactattctttttaaaaaaagtttcactgt240gtagagaacatatatgcataaacataggtcaattatatgtctccattagaaaaataataa300Uggaaaacatgttctagaactagttacaaaaataatttaaggtgaaatctctaatattt360ataaaagtagcaaaataaatgcataattaaaatatatttggacataacagactt414<210>2<211>492<212>DNA<213>人工序列<220><230><400>2acaggcacatcaggctgcagaatgcgctttagaaagcattgttttagtccaggcacagtg60gctcacgcctgtaatcccagcactttgggaggccgaggtgggtggatcacaaggttggga120gattgagaccatcctggctaacacagtgaaaccctgtctctactaaaaaaatacaaaaaa180ttagcttggcgtggtggtgggcgcctgtagtcccagcagcttgggaggctgaggctggag240aatggtgtgaacccaggaggcggagcttgcagtgagccaagatcgcgccactgcactcca300gcccgggtgacagagcaagactccgtctcaaaaaaaagaaaagaaaaaagaaagcattgt360tttaattgagaggggcagggctggagaaggagcaagttgtggggagccaggcttccctca420cgcagcctgtggtggatgtgggaaggagatcaacttctcctcactctgggacagacgatg480tatggaaactaa492<210>3<211>284<212〉DNA<213>人工序列<220><230><400>3actcatttggatgattctgtgactcatagaacatgatgttaaatgagaccagactcaact60gccaccagtccccagctgcagaccttcatccccttcatctcccactaggggctcgtggtc120tggaagaaacatgtatcaagcaacacagccccttatcccagatagaaaagtgtctcaaat180gcattctactgcgggacagtcagtaggatcattttcataaagcaaggacatcatatgttt240ctagaaattacaagcatataactttagcctacaatctcttatta284<210>4<211>468<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc—feature<222>(399「(399)<223>nisa,c,g，ort<400>4aacaacgacaaaaagctccaagctgcagtggatttaattatgaggctaaaactacctcat60actttccttggaagaactaattagctatggtttattgtagggttttgtttgUtgtUtt120taaagcaaatgatttccatattcctgattgatcttttttgtcatctttgcttcaaaatta180cataaaaggtgctcctttcccccttcUttatacaagtttcttgttcatattgtgaatag240aaaagtttctgaacaacttttttggaacattttctatctatattccaaagcatgtaatat300atacataaaaacgatttgttaaactggtccttagtcatttgtataattagaaatgaagt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