专利名称：检测铜绿假单胞菌重要耐药基因的基因芯片及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因芯片及包含该芯片的检测用试剂盒，尤其是涉及一种检测铜 绿假单胞菌重要耐药基因的基因芯片及检测用试剂盒。
背景技术：
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是革兰氏阴性非发酵机会致病菌，其易 于在外界生长繁殖，分布广泛、耐药性强、传播途径多样，成为当今医院感染最常见的病原 菌之一。重症监护区的感染10%与铜绿假单胞菌有关，铜绿假单胞菌引起的肺炎、败血症显 示很高的发病率与死亡率。近年来，铜绿假单胞菌对抗生素的耐药率逐年增高，多重耐药铜 绿假单胞菌的检出率也越来越高。铜绿假单胞菌可通过获得性抗性或内在抗性对抗生素产生耐药性。其中获得性抗 性可通过质粒、整合子、转座子等移动元件在在同种或不同种属之间进行基因的水平转移， 从而导致细菌耐药性的传播。因此对获得性耐药菌株的监控对于控制耐药基因传播及预防 传染病大爆发有积极意义。铜绿假单胞菌可获得多种抗性基因，如β -内酰胺酶类基因(tem，shv, oxa, veb, imp，vim)，氨基糖苷修饰酶基因(aac，aad，aph)。前者可导致细菌对β -内酰胺类抗生素抗 性，后者可导致细菌对氨基糖苷类抗生素抗性，而此二类抗生素都是目前临床治疗铜绿假 单胞菌感染的主要药物。据我国临床检测数据，铜绿假单胞菌常见的重要耐药基因有tem， carb, oxa group I, oxa groupll, imp, aac (3，) -I, aac (3，) -II, aac (6，) -lb, aac (6，) -II, aadB 等.对各类抗生素耐药基因进行检测鉴定，能更准确地对细菌耐药性进行监测并有助 于合理选用抗菌药物，提高耐药菌感染的治愈率。一般检测耐药性的方法有药敏试验、Southern blot, PCR，RT-PCR，基因芯片等 方法。传统的药敏试验耗时长(3天)，只能判断出耐药表型，无法检测具体耐药原理；普通 PCR及RT-PCR特异性高，但检测通量极其有限；Southern blot操作步骤繁琐；基因芯片基 于PCR技术，但比PCR更特异灵敏，且具有快速、高通量的优点，十分适用于对多重耐药菌进 行相关耐药基因的检测。德 国 的 Weile Jan 等(DNA microarray for genotyping multidrug-resistantPseudomonas aeruginosa clinical isolates,2007, Diagnostic Microbiology andlnfectious Disease)利用基因芯片对97株多重耐药铜绿假单胞菌临床 分离株进行了基因分型，结果表明该基因芯片速度快(5h)，准确率高达87. 8%)0但该芯片 造价较高，每个样品检测成本约50美元，每个靶基因只设计了一个探针，容易产生假阳性。目前，国内尚未有针对铜绿假单胞菌耐药基因的检测芯片的文献报道或发明专 利。
发明内容
为了提高检测速度与精确性，降低成本，更加适于实际应用，本发明提供了一种针 对铜绿假单胞菌中常见的重要耐药基因的检测芯片及其试剂盒。本发明所述的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探 针，该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种1)从 carb、tem、imp、oxa group I > oxa groupll、aac(3，) -I > aac(3，)-II、 aac(6，)_Ib、aac(6，) _II、aadB基因和细菌16S rRNA基因中所选取的至少一种DNA片段;2)从上述1)中选取的至少一种DNA片段的互补DNA片段。本发明的优选实施例中，所述寡核苷酸探针具有SEQ ID NO =I-SEQ IDNO 29所示 的核苷酸序列，或不同于SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :29所示的核苷酸序列但编码的氨基酸序 列与SEQ ID NO=I-SEQ ID NO :29所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列相同的序列，具体的 优选序列及功能见表1。本发明所述的基因芯片用于铜绿假单胞菌耐药基因carb、tem、，imp、oxa groupl、 oxa groupll、aadB、aac (3，)_I、aac(3，)_II、aac(6，)_Ib、aac(6，)_II 中至少一种的检测。本发明还提供使用上述的基因芯片检测耐药基因的方法，其主要包含步骤1)根据铜绿假单胞菌的耐药基因设计并制备出用于PCR扩增的引物；2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤1)中的引物，按一定浓度混合，对待测样 品基因组DNA进行PCR扩增并纯化PCR产物，制得靶序列；3)标记步骤2)中得到的靶序列；4)将步骤3)标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。本发明的优选实施例中，上述步骤1)中使用的PCR引物为SEQ IDNO :30_SEQ ID NO 51所示核苷酸序列中的至少一种，具体如表2，共22条。本发明还提供一种检测铜绿假单胞菌耐药基因的试剂盒，其包含上述的基因芯 片。本发明的优选实施例中，上述的试剂盒包含SEQ ID NO =I-SEQ IDNO 29所示核苷 酸序列或其互补核苷酸序列的探针序列中的至少一种。本发明的优选实施例中，上述的试剂盒还包含SEQ ID NO :30_SEQ IDNO :51所示核 苷酸序列的PCR引物。本发明的优选实施例中，上述的试剂盒还包含杂交盒、杂交液。本发明上述的试剂盒用于铜绿假单胞菌耐药基因carb，tem, imp, oxagroupl, oxa groupll, aac(6，)_Ib，aac(6，)_II，aac(3，)_I，aac(3，)_II，aadB 中至少一种的检测。与现有技术相比，本发明采用上述技术方案的有益效果在于针对中国境内铜绿 假单胞菌的常见重要获得性耐药基因，精简了探针的数量，成本大大降低；所用引物和探针 均来自特异基因序列，与其他基因亲缘性关系远，不易产生交叉，加上严格的筛选，最终每 个靶基因优选出2到4条探针，优选出的引物及探针均非常特异；经灵敏度试验确定了本芯 片的检出限为Ing DNA ；通过对本试验室收集的50株铜绿假单胞菌临床分离耐药株进行了 160余次杂交试验，每株重复杂交2到3次，杂交结果十分稳定，与耐药表型符合率高；检测 时间为5小时；在一张片基上可同时检测8个样品。综上所述，本发明的特点是针对性强，
4特异性强，灵敏度高，稳定性好，检测速度快，通量高，成本较低，非常适合医院，疾病预防控 制机构及其他临床实验室进行耐药基因检测及耐药性监控。为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施 例，并配合附图，作详细说明如下。
图1为本发明的基因芯片结构外形示意图；图2为本发明芯片的单一点阵探针布局示意图；图3为利用本发明的多重PCR I对铜绿假单胞菌临床分离株基因组及其混合物的 扩增产物电泳图，其中1.模板为P. aeruginosa C1595 ；2.模板为P. aeruginosa C2177 ； 3. &为 P. aeruginosa C6049 ；4. &为 P. aeruginosa C7633 ；5. &为 P. aeruginosa C6393 ；6.模板为 P. aeruginosaC1595, C2177, C6049, C7633 等比例混合；M, marker ；图4为利用本发明的多重PCR II对铜绿假单胞菌临床分离株基因组及其混合物 的扩增产物电泳图，其中:1.模板为P. aeruginosa C2589 ；2.模板为P. aeruginosa C6049 ； 3.模板为 P. aeruginosa C7633 ；4.模板为 P. aeruginosa C2589, C6049, C7633 等比例混 合；M, marker ；图5为利用本发明的基因芯片检测carb基因的一个实施例杂交结果示意图；图6为利用本发明的基因芯片检测tem基因的一个实施例杂交结果示意图；图7为利用本发明的基因芯片检测imp基因的一个实施例杂交结果示意图；图8为利用本发明的基因芯片检测oxa groupl基因的一个实施例杂交结果示意 图；图9为利用本发明的基因芯片检测oxa groupll基因的一个实施例杂交结果示意 图；图10图为利用本发明的基因芯片检测aac(6' )_Ib基因的一个实施例杂交结果 示意图；图11为利用本发明的基因芯片检测aac(6' )-II基因的一个实施例的杂交结果 示意图；图12为利用本发明的基因芯片检测aac (3' ) -I基因的一个实施例杂交结果示意 图；图13为利用本发明的基因芯片检测aac(3' )-II基因的一个实施例杂交结果示 意图；图14为利用本发明的基因芯片检测aadB基因的一个实施例杂交结果示意图；图15为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C1595的一个实施 例杂交结果示意图；图16为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C2177的一个实施 例杂交结果示意图；图17为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C4935的一个实施 例杂交结果示意图；图18为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C6049的一个实施例杂交结果示意图；图19为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C6393的一个实施 例杂交结果示意图；图20为利用本发明的基因芯片检测铜绿假单胞菌临床分离株C6933的一个实施 例杂交结果示意图。
具体实施例方式实施例一探针的设计和制备1.序列获得从GenBank公共数据库下载得到铜绿假单胞菌上述耐药基因的全部基因序列及 细菌16S rRNA基因典型序列。2.探针设计用Clustal X软件分别比对各个基因的不同序列，根据比对结果，选取一条代表序 列，将该序列导入Primer Premier 5软件中。运行程序设计探针，选择长度(25士5)bp，Tm 60V 70°C，GC含量40% 60%，将设计好的探针输入NCBI中作blastn比对，保证该序 列基因内保守性和基因间特异性。每个基因设计至少4条不同探针，以备后续筛选。3.探针合成将设计好的探针序列经5'端polyT加至总长40个核苷酸(正对照 探针加长至49个核苷酸)，5'端氨基化修饰，委托探针合成公司合成，备用。4.探针筛选将合成好的探针溶解于50% DMS0，稀释至1 μ g/μ 1后用基因芯片 点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片。通过杂交实验对所设计的探针进行筛选，最终得到 用于制备本发明基因芯片的优选探针29条，包括28条耐药基因探针及1条16S rRNA基因 (16S rDNA)正对照探针，如表1。表1 本发明基因芯片所选用的寡核苷酸探针序列及可检测的基因
权利要求
一种用于检测铜绿假单胞菌重要耐药基因的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于该寡聚核苷酸探针包含下述DNA片段中的至少一种1)从carb、tem、imp、oxa groupI、oxa groupII、aac(3’) I、aac(3’) II、aac(6’) Ib、aac(6’) II、aadB基因和细菌16S rRNA基因中所选取的至少一种DNA片段；2)从上述1)中选取的至少一种DNA片段的互补DNA片段。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述寡核苷酸探针具有SEQID NO I-SEQ ID NO :29所示的核苷酸序列，或不同于SEQ IDNO =I-SEQ ID NO :29所示的核苷酸序 列但编码的氨基酸序列与SEQ IDNO=I-SEQ ID NO :29所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列 相同的序列。
3.权利要求1或2所述的基因芯片用于铜绿假单胞菌耐药基因carb、tem、，imp、oxa groupI> oxa group 11 > aadB > aac (3' ) -I> aac (3' ) -II> aac (6' ) -Ib> aac (6' ) -II ΦΜ^一 种的检测。
4.使用权利要求1所述的基因芯片检测耐药基因的方法，其特征在于包含步骤1)根据铜绿假单胞菌的耐药基因设计并制备出用于PCR扩增的引物；2)制备待测样品的基因组DNA，使用步骤1)中的引物，按一定浓度混合，对待测样品基 因组DNA进行PCR扩增并纯化PCR产物，制得靶序列；3)标记步骤2)中得到的靶序列；4)将步骤3)标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析杂交结果。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤1)中使用的PCR引物为SEQID NO :30-SEQ ID NO :51所示核苷酸序列中的至少一种。
6.一种检测铜绿假单胞菌耐药基因的试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的基因-H-· I I心片。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于还包含SEQIDNO=I-SEQ ID N0:29所示 核苷酸序列或其互补核苷酸序列的探针序列中的至少一种。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于还包含SEQIDNO :30-SEQ ID NO 51 所示核苷酸序列的PCR引物。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于还包含杂交盒、杂交液。
10.权利要求6所述的试剂盒用于铜绿假单胞菌耐药基因carb，tem,imp, oxa group I, oxa groupll, aac (6' )_Ib，aac (6' )_II，aac(3' )_I，aac(3' )_II，aadBftW^ 测。
全文摘要
本发明提供一种检测铜绿假单胞菌重要耐药基因的基因芯片及其试剂盒。该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，该探针包含从carb，tem，imp，oxa groupI，oxa group II，aac(6’)-Ib，aac(6’)-II，aac(3’)-I，aac(3’)-II，aadB及细菌16S rRNA基因中选取的DNA片段或其互补DNA片段。利用上述基因芯片及检测试剂盒可以达到同时检测铜绿假单胞菌上述10种耐药基因的目的，具有针对性强，特异性强，灵敏度高，检测速度快，重复性好等特点，适于医院、疾病预防控制机构及其他临床实验室对铜绿假单胞菌进行耐药基因检测和耐药性监控。
文档编号C40B40/06GK101967508SQ20091015207
公开日2011年2月9日 申请日期2009年7月28日 优先权日2009年7月28日
发明者冯露, 康海蔚, 曹勃阳, 王磊 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司