专利名称：宏基因组文库的保存和筛选方法
宏基因组文库的保存和筛选方法所属领域本发明属于微生物工程领域，涉及一种快速有效地保存并筛选海量宏 基因组克隆的方法，也就是高效保存和筛选宏基因组文库的方法。
背景技术：
宏基因组是指环境中可培养和未可培养的全部微生物的基因组总和， 宏基因组文库技术避开了微生物纯培养的瓶颈，是研究和利用微生物、尤其是未可培养微 生物资源的有效途径。将常规的基因组文库技术用于宏基因组研究中，通过直接提取环境 样品中所有微生物的DNA并克隆到合适的载体，即可获得宏基因组文库。根据插入片段大 小，宏基因组文库可以被分成两类一是克隆于质粒载体或λ噬菌体载体中的小片段文库 (插入片段小于15000碱基对)；另一类是克隆于粘粒及BAC中的大片段文库(插入片段大 于30000碱基对)。为了最大程度地涵盖感兴趣的所有微生物，宏基因组文库的容量通常在 一百万个克隆以上，对于如此海量的宏基因组文库克隆群体，有必要发明一种快速有效的 保存和筛选方法。宏基因组文库的传统保存方法包括挑取单个克隆、每8个或更多个单克 隆合并保存，这一方法不仅费时费力，而且需要占用很大的保存空间。此外，基于序列相似 性用探针进行分子杂交常用于宏基因组文库的筛选，但是，对同一张膜 上的DNA模板用不 同探针进行多次膜杂交以提高宏基因组文库筛选效率的方法，还未见报道。
发明内容
本发明的目的是克服上述已有技术的局限，提供一种高效保存和筛选 宏基因组文库的方法。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案宏基因组文库的保存和筛选方法，所述宏基因组文库的保存是用小量的文库包装 颗料感染感受态细胞，保温后将其等分成96份或96的整倍数，振荡培养，加入甘油保存；所 述宏基因组文库的筛选是用氢氧化钠加十二烷基磺酸钠溶液漂洗杂交膜，去除探针的同时 保留膜上的DNA模板用于不同探针的多次膜杂交。更具体地，本发明宏基因组文库的保存和筛选方法中，所述宏基因组文库的保存 是取1 100微升的文库包装颗粒与1 10毫升感受态细胞混勻，25 39°C保温20 60分钟，将该细胞混合物等分成96份或96的整倍数，每份加0. 2-2毫升LB培养液，所述 LB培养液为胰蛋白胨10克/升+酵母提取物5克/升+氯化钠5克/升，pH7. 0，在28 39°C振荡培养12 24小时，加入甘油保存；所述宏基因组文库的筛选是把已进行过探针 杂交的杂交膜放入预热的0. 2M氢氧化钠加以重量/体积即克/100毫升为单位的0. 的 十二烷基磺酸钠溶液中，在37°C、55°C、68°C漂洗两次，每次10分钟、20分钟、30分钟，然后 用300mM氯化钠加30mM柠檬酸钠溶液彻底漂洗，去除探针的同时保留膜上的DNA模板用于 不同探针的多次膜杂交。上述的宏基因组文库的保存和筛选方法中，所述感受态细胞的获取是挑取前一天 划线培养的EPI300单克隆至5毫升LB培养基中，37°C下每分钟200转培养12小时；按 1 10的比例转接至15毫升新鲜添加了 IOmM硫酸镁的LB培养液中，37°C下每分钟200转 培养100分钟使细胞密度达到0D_约0. 9，由此获得感受态细胞。上述的宏基因组文库的保存和筛选方法中，已进行过探针杂交的杂交膜分两次在 68°C中处理30分钟能完全去除探针，将去除探针的杂交膜用不同探针再进行多次杂交。
本发明的方法，由于一是基于用小量的文库包装颗感染一定量的感受态细胞，等 分成96份或96的整倍数，进行文库扩增培养与保存；每个保存孔的平均克隆数在100 800个，视文库的滴度而定。因此，无需逐个挑取单克隆，快速而有效地保存了宏基因组文 库。二是基于用一定温度的碱性溶液去除杂交膜上的探针，保留在膜上的文库DNA模板可 多次用于不同探针的膜杂交，从而极大提高了宏基因组文库的筛选效率。
具体实施例方式下面结合本发明的实施例进一步来说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本 发明实施例1:本发明的宏基因组文库的高效保存和筛选方法可概括为取1 100微升的文库 包装颗粒与1 10毫升感受态细胞混勻，25 39°C保温20 60分钟，将该细胞混合物等 分成96份或96的整倍数，每份加少量培养液在28 39°C振荡培养12 24小时，加入甘 油保存。多次膜杂交筛选宏基因组文库，用含0.2M氢氧化钠加0. 十二烷基磺酸钠的碱 性溶液在37 70°C漂洗杂交膜两次，每次10 30分钟，去除探针的同时保留膜上的DNA 模板用于不同探针的多次膜杂交，从而提高宏基因组文库的筛选效率。具体地挑取前一天划线培养的EPI300单克隆至5毫升LB培养基中，37°C下每 分钟200转培养12小时；按1 10的比例转接至15毫升新鲜LB培养液，再加IOmM硫酸 镁，37°C下每分钟200转培养100分钟使细胞密度达到OD6tltl约0. 9，由此获得感受态细胞； 取30微升文库包装颗粒与1毫升感受态细胞混勻，37°C保温30分钟；将细胞混合物按每份 约10微升分装成96小份(另取10微升用于稀释涂布平板计数克隆)，每份加入2毫升LB 培养液，再加氯霉素12. 5微克/毫升，37°C下每分钟200转培养18小时；离心收集菌体，用 200微升20%甘油(以体积/体积为单位)，悬浮，对应转移到96孔板中，液氮速冻后保存 于零下80°C。通过计数平板上的克隆，推测文库每个保存孔的平均克隆数为244个。实施例2:挑取前一天划线培养的EPI300单克隆至5毫升LB培养基中，37°C下每分钟200 转培养15小时；按1 10的比例转接至15毫升新鲜LB培养液，添加IOmM硫酸镁，37°C下 每分钟200转培养110分钟使细胞密度达到OD6tltl约1. 0，由此获得感受态细胞；取50微升 文库包装颗粒与5毫升感受态细胞混勻，30°C保温60分钟；将细胞混合物按每份约50微升 分装成96小份(另取50微升用于稀释涂布平板计数克隆)，转移到每孔含0. 2毫升LB培 养液，添加氯霉素12. 5微克/毫升的96孔培养板，37°C下每分钟230转培养21小时，加入 甘油至终浓度15% (以体积/体积为单位)，液氮速冻后保存于零下35°C。通过计数平板 上的克隆，推测文库每个保存孔的平均克隆数为526个。对于库容量为一百万个克隆的宏基因组文库，按每孔平均克隆数333个计算，大 约只需30块96孔保存板，既节省超低温冰箱的保存空间，又无需费时费力地逐个挑取单克 隆，从而达到了快速有效地保存宏基因组文库的目的。实施例3:多次膜杂交筛选宏基因组文库已进行过探针杂交的杂交膜放入预热的0. 2M氢氧化钠加0. 十二烷基磺酸钠溶液中，在37°C、55°C、68°C漂洗两次，每次10分钟、20分钟、30分钟，然后用300mM氯化钠 加30mM柠檬酸钠溶液彻底漂洗。通过检测不同处理条件下探针洗脱的效果(表1)，发现 68°C每次30分钟处理可完全去除探针。将去除探针的杂交膜用同一探针再次杂交，得到相 同的特异显色点，说明洗脱探针的同时保留了膜上的DNA模板。杂交膜上已有的探针被有 效地去除之后，可对同一张膜用不同探针进行多次杂交，从而显著提高宏基因组文库的筛 选效率。实验发现，同一张膜可进行多达七次的膜杂交筛选，视文库DNA的浓度而定。表1本发明洗脱探针的处理条件
温度 Wm (分钟)""“是否去除探IF 10; 20; 30^
权利要求
宏基因组文库的保存和筛选方法，其特征在于所述宏基因组文库的保存是用小量的文库包装颗料感染感受态细胞，保温后将其等分成96份或96的整倍数，振荡培养，加入甘油保存；所述宏基因组文库的筛选是用氢氧化钠加十二烷基磺酸钠溶液漂洗杂交膜，去除探针的同时保留膜上的DNA模板用于不同探针的多次膜杂交。
2.根据权利要求1所述的宏基因组文库的保存和筛选方法，其特征在于所述宏基因组 文库的保存是取1 100微升的文库包装颗粒与1 10毫升感受态细胞混勻，25 39°C保 温20 60分钟，将该细胞混合物等分成96份或96的整倍数，每份加0. 2~2ml LB培养液， 所述LB培养液为胰蛋白胨10克/升+酵母提取物5克/升+氯化钠5克/升，pH7. 0，在 28 39°C振荡培养12 24小时，加入甘油保存；所述宏基因组文库的筛选是把已进行过 探针杂交的杂交膜放入预热的0. 2M氢氧化钠加以重量/体积即克/IOOml为单位的0. 1% 的十二烷基磺酸钠溶液中，在37°C、55°C、68°C漂洗两次，每次10分钟、20分钟、30分钟，然 后用300mM氯化钠加30mM柠檬酸钠溶液彻底漂洗，去除探针的同时保留膜上的DNA模板用 于不同探针的多次膜杂交。
3.根据权利要求1所述的宏基因组文库的保存和筛选 方法，其特征在于感受态细胞的 获取是挑取前一天划线培养的EPI300单克隆至5毫升LB培养基中，37°C下每分钟200转培 养12小时；按1 10的比例转接至15毫升新鲜添加了 IOmM硫酸镁的LB培养液中，37°C 下每分钟200转培养100分钟使细胞密度达到OD_约0. 9，由此获得感受态细胞。
4.根据权利要求1所述的宏基因组文库的保存和筛选方法，其特征在于已进行过探针 杂交的杂交膜分两次在68°C中处理30分钟能完全去除探针，将去除探针的杂交膜用不同 探针再进行多次杂交。
全文摘要
提供一种宏基因组文库的保存和筛选方法，一是快速有效地保存海量宏基因组克隆的方法，包括用小量的文库包装颗感染一定量的感受态细胞，等分成96份或96的整倍数，进行文库扩增培养与保存；二是通过对同一张膜上的文库DNA模板用不同探针进行多次杂交以提高宏基因组文库筛选效率的方法，包括用一定温度的碱性溶液去除杂交膜上的探针，同时保留膜上的DNA模板用于不同探针的多次膜杂交，从而提高宏基因组文库的筛选效率。
文档编号C40B40/08GK101967683SQ20101029759
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者付小莉, 曾英, 王浩鑫 申请人:中国科学院昆明植物研究所