专利名称：取代苯甲(磺)酸酯类作为雌激素受体选择性配体的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物学领域，特别涉及雌激素受体介导的相关疾病治疗药物领域，具体涉及取代苯甲(磺)酸酯类化合物作为雌激素受体的选择性配体的用途。
背景技术：
随着社会的不断进步，人们生活方式的改变，因内分泌系统紊乱而导致的疾病已经成为人民健康的重大威胁之一。以乳腺癌为例，中国人口协会于2010年2月I日发布的《中国乳腺疾病调查报告》显示我国城 市中乳腺癌的死亡率增长了 38. 91%，乳腺癌已成为对妇女健康威胁最大的疾病，乳腺癌发病率位居大城市女性肿瘤的第一位。目前，已经有很多实验和流行病学研究表明，乳腺癌的诱发和发展与雌激素(estrogen)的滥用是密切相关的(Yue, ff. , et al. , Effects of estrogenon breast cancer development Roleof estrogen receptor independent mechanisms. International Journal of Cancer,2010. 127(8) 1748-1757. ；Bai, Z. and R. Gust, Breastcancer, estrogen receptor andligands. Arch Pharm(Weinheim),2009. 342(3) : 133-149. ；Yager,J. D. and N. E. Davidson,Estrogen Carcinogenesis in Breast Cancer. New England Journal of Medicine,2006. 354(3) 270-282.)。经典的“受体学说”认为雌激素通过与雌激素受体(estrogen receptor, ER)结合，激活雌激素受体，进而影响细胞核中或者核糖体中的基因转录，或者影响其他激酶信号转导通路，最终导致细胞增殖的加快和细胞凋亡的减少(Yager，J. D. and N. E. Davidson,Estrogen Carcinogenesis in Breast Cancer. New England Journalof Medicine,2006. 354(3) :270_282.)。研究发现，雌激素受体在乳腺癌疾病通路中起到了非常关键的作用。目前临床使用的治疗乳腺癌药物他莫昔芬(tamoxifen)就是选择性雌激素受体的调节剂(Selective ER Modular, SERM) (Osborne, C. K. , Tamoxifen in the treatment ofbreast cancer. New England Journal of Medicine,1998. 339(22) 1609-18.) 雌激素受体是属于核受体超家族的甾类受体，主要由三部分组成AF-1功能区、DNA结合区和配体结合区。雌激素受体在人体保持生理功能的过程中起到十分关键的作用。在正常情况下，内源性雌激素如雌二醇等结合到雌激素受体的配体结合区域，激活雌激素受体功能，进而激活下游的信号转到或者基因表达。对于这样的靶标，药物研发和临床用药都是十分困难的。妇女进入更年期之后，由于雌激素水平的降低，会产生各种各样的疾病症状，如更年期综合征，骨质疏松等，一般通过荷尔蒙替代疗法或者雌激素替代疗法补充雌激素。但是正如前面提到的，雌激素摄入过多，会导致包括乳腺癌在内的一些其他疾病，如中风、肺栓塞、冠心病等。幸运的是，选择性雌激素受体调节剂的发现在一定程度上缓解了这种两难境地。不同组织中的雌激素受体对于选择性雌激素受体调节剂具有不同的响应，这样就会大大减少副作用的发生。然而对于这种现象并没有一种很好的解释。直到1996年，雌激素的第二个亚型(ERi3)被发现，使得人们尝试着开始从配体选择性的角度来解释组织选择性。
人们先前认识的雌激素受体亚型(ERa)和第二个亚型(ERP)在DNA结合区域的序列等同性为98 %,在配体结合区域的序列等同性为56 % (Veeneman, G. H.,Non-steroidal subtype selective estrogens. Curr Med Chem,2005. 12(9) :1077-136.)。这也说明了雌激素受体的两个亚型可以响应不同的配体，但产生相似的功能。进ー步的研究也发现，ER a和ERP在体内的分布也有所区別，ER a主要在生殖系统中表达，而ER @广泛地存在于很多组织中，包括中枢神经系统、心血管系统、消化系统和免疫系统等(Kuiper，u u，et al ，しomparison 01 tne ligandbinding specificity and transcript tissuedistribution of estrogen receptors alpha andbeta. Endocrinology,1997. 138(3)863-70. ;Korach，K. S.，et al.，Update on animalmodels developed for analyses ofestrogen receptor biological activity. J SteroidBiochem Mol Biol,2003. 86 (3-5) 387-91.)。因此，目前的研究重点已经转移到亚型选择性配体的发现和优化。现已发现的亚型选择性雌激素配体调节剂包括苯并呋喃、苯并噻唑、联苯类似物以及ー些植物雌激素。这些研究一方面可以发现潜在的可以成药的选择性雌激素受体调节剂，另一方面也可以进ー步研究雌激素受体相关的调控通路。除了乳腺癌之外，越来越多的研究发现，雌激素受体在很多其他疾病中也起到了十分关键的作用，包括肺癌(Siegfried，J. M.，P. A. Hershberger，and L P. Stabile，Estrogen receptor signaling in lung cancer. Seminars in Oncology,2009. 36 (6)524—31.)、 血管疾病(Luksha, L. and K. Kublickiene, The role of estrogenreceptorsubtypes for vascular maintenance. Gynecologica丄 Endocrinology，2009.25(2) :82-95.)、老年痴呆等(Tang，M. X.，et al.，Effect of oestrogenduring menopause onrisk and age at onset of Alzheimer ! s disease. Lancet，1996. 348 (9025) :429-32)。因此发现具有特定功能的雌激素受体调节剂已经成为各大制药公司的重要项目之一(Blizzard, T. A. , Selective estrogen receptor modulatormedicinal chemistry at Merck. A review. Curr Top Med Chem,2008. 8 (9) :792-812.)。
发明内容
本发明的目的是提供ー类取代苯甲(磺)酸酯类化合物作为选择性雌激素受体的用途。该类取代苯甲(磺)酸酯类化合物能有效激动/拮抗雌激素受体，从而可以作为药物先导化合物，用于制备治疗乳腺癌等雌激素相关疾病的药物。为了实现上述目的，本发明筛选出了如下取代苯甲(磺)酸酯类化合物(aromaticbenzoate)，其结构通式如下
R
I
O、ノ〇
Y其中R选自苯基或ニ苯基取代的烷基和芳香基Ar，Ar为可被1-2个选自羟基、烷基、烷氧基和烷酰基取代基取代的苯基或萘基；X为C或S = 0 ;Y为1-2个卤原子、0H、烷基或烷氧基。上述化合物的发现,源于一种称作虚拟筛选(Virtual Screening)的计算机模拟药物设计的技术。使用这项技术可缩短发现的时间和流程。虚拟筛选所用的化合物库，包括本发明中的化合物都来源于SPECS数据库(http://www. specs, net/)。 本发明采用的化合物筛选方法包括以下步骤(I)受体模型的准备利用分子动力学模拟的方法对雌激素受体进行动力学采样，提取平衡阶段的平均结构作为虚拟筛选的受体模型；(2)虚拟筛选用Glide5. O对SPECS化合物库进行筛选，并且以已知活性的选择性雌激素受体新配体作为阳性化合物对照，获得能量打分相当于阳性化合物的分子，具体分三步，第一步采取高通量模式(HTVS)去除明显不能与雌激素受体结合的分子，第二步采用标准模式(SP)缩小命中分子的范围，第三步采用精确模式(XP)去除可能的假阳性。最后利用Lipinski规则对所得分子进行分子类药性评价；(3)自由能计算采用MM-GBSA方法对步骤(2)所得分子进行自由能计算，根据结合自由能高低，选出结合自由能与阳性化合物相当的分子；(4)视觉分析对接筛选，得到基于结合自由能的打分，并结合步骤(I)中打分情况筛选出打分高，作用模式好的化合物；(5)生物测试对最终挑选出的化合物进行酵母水平雌激素受体激动/拮抗活性测试。本发明的有益效果在于本发明采用计算机辅助药物设计技术和生物活性测试相结合的方法有效地筛选出具有选择性雌激素受体激动或拮抗作用的配体，它们可作为药物先导化合物，用于制备雌激素受体介导的相关疾病治疗药物，尤其是乳腺癌和骨质疏松等疾病的治疗药物，为广大患者带来福音。
图I是显示具有雌激素受体活性的小分子筛选的流程示意图。图2是表I中激动剂代表性化合物11的对数剂量-α -半乳糖苷酶比活性曲线图。图3是表I中拮抗剂代表性化合物16的对数剂量-抑制率曲线图。
具体实施例方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。I.针对雌激素受体复合物的虚拟筛选参见图I所示，通过分子动力学模拟优化β亚型雌激素受体结构，对SPECS化合物库的197116个化合物分子进行了筛选，最终得到可用作雌激素受体的选择性配体的化合物，具体步骤如下首先从PDB 库(Protein Data Bank)中提取了 PDB 库号(PDB code)为 1X78 的ERβ-Way-244 复合物晶体结构(Manas, E. S. et. al. Structure-based design ofestrogenreceptor- β selective ligands. J. Am. Chem. Soc. 2004,126,15106-15119.)作为初始结构，采用分子动力学模拟的方法，对初始模型进行优化。用分子模拟软件Sybyl7. O将缺失的残基补全。晶体结构中其中一个结晶水与ERP中的Glu305、Arg346和配体共同形成一个氢键网，将这个结晶水分子保留，其他水分子全部删除。所有优化和分子动力学模拟过程都在Amber 10中的Sander模块中进行。用LeaP模块处理WAY-244与ERP复合物的初始结构。雌激素受体力场采用AMBERff99カ场參数，WAY-244的键长、键角和ニ面角參数采用GAFF (General AMBERForce Field)カ场，GAFF和传统的AMBER力场參数不同，可以绘出大部分的有机小分子的カ场參数。此过程后，体系中添加进了氢原子。所有带电残基采用在中性PH条件下的默认质子化状态。为了保持整个体系的电中性，加入了一定数量的抗衡离子。随后，将2个模型分别置于填满TIP3P水分子模型的盒子中，盒子各边与蛋白质残基的距离为10.0 A。用SHAKE算法限制所有和氢原子相连的键。长程静电相互作用计算采用PME (Particle-Mesh Ewald)算法，静电和范德华作用的阈值为10.0 A。采用周期性边界条件(Periodic Boundary Conditio n)来避免边缘效应。溶剂化模型通过两步进行优化。首先，保持蛋白质分子固定，只优化水和抗衡离子，加在整个系统上的谐函数位置限制カ參数为500 kcal/(mol*A2)。然后，放开限制，所有原子都能自由运动。在上述的每ー步，先用最陡下降法(Steepest Descent)优化500步,接着用共轭梯度法再优化4500步。随后对体系进行升温，逐步从OK升温到300K，总时间为20ps，在16ps达到平衡，在平衡之前蛋白质和配体的位置被限制。接下来，在300K的温度下对整个体系进行40ps的动力学平衡。最后，采用NPT系综在300K和I个大气压下，进行5ns的分子动力学模拟。接着取平衡阶段的动力学轨迹平均结构作为虚拟筛选受体模型，利用薛定谔软件包中Protein Preparation Wizard模块对该平均结构进行准备，以复合物中配体为中心，
10人半径定义为ロ袋。ロ袋部分的氨基酸残基包括Leu298，Thr299，Glu305, Met336，Arg346, Phe94, Ilelll, Phell5, Gly210 和 His475。对ロ袋部位进行 grid 计算，计算 ロ袋内静电作用和范德华作用能的网格文件，调整网格大小为10 X 8 X 10人,范德华半径缩放因子设为0. 8。本发明者用产生的网格文件对197116个SPECS库的小分子组成的化合物库利用薛定谔公司的Glide5. 0对接软件进行分子对接。在对接之前，利用薛定谔公司的LigPr印2. I程序对小分子进行处理，采用0PLS_2005カ场，环境PH设为7. 0±2. 0，采用Epik2. I生成离子状态。第一轮筛选采用高通量虚拟筛选模式(HTVS)，目的是去除那些有明显碰撞的分子，保留的10000个分子进入第二轮。第二轮采用标准模式(SP)，目的是获得合理的对接构象，该轮筛选结束后保留大约2000个分子。第三轮采用精确模式(XP)，目的是去除假阳性化合物，最后保留1000个化合物采用薛定谔公司提供的Prime-MMGBSA模块进行结合自由能的计算，根据能量大小排序，前200名保留。最終通过视觉分析，挑选出几类作用模式较为合理的化合物，其中包括取代苯甲(磺)酸酯类化合物。2.从荷兰 SPECS 公司(www. specs, net, Address Specs, Kluyverweg 6, 2629HTDelft, The Netherlands)购买从SPECS化合物库筛选出的取代苯甲(磺)酸酯类化合物，用来测试生物活性。3.取代苯甲(磺)酸酯类化合物作为雌激素受体的选择性配体的生物活性测试我们采用酵母双杂交系统来评价雌激素受体配体的活性。酵母双杂交是将雌激素受体(ER)和留体受体共激活因子I (Steriod Receptor Coactivator I, SRC1)的编码基因分别克隆到酵母双杂交系统中含激活结构域(Active Domain,AD)和结合结构域(BindingDomain, BD)的载体上，并将二载体转化入酵母细胞中形成融合蛋白表达系统。在酵母细胞中，ER和共激活因子SRCl的相互作用能力越强，β U)-半乳糖苷酶报告基因的活性越强。ER的配体可以改变这两个融合蛋白的相互作用，因此可以通过检测报告基因活性的方式评价待测化合物的活性。另外，我们通过噻唑蓝(MTT)实验验证化合物对乳腺癌细胞的生长抑制作用(表I)。3. I实验材料 酵母菌株ΑΗ109、酵母表达质粒pGBKT7和pGADT7购自Clontech ;乳腺癌细胞MCF7购自中科院细胞所；所有限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB ;17_β_雌二醇(Ε2)、他莫昔芬(Tamoxifen)、酵母培养用培养基成分(酵母无氨基酸氮源,D-葡萄糖,酵母提取物,蛋白胨，腺嘌呤)、PNP- a -gal (4_硝基苯a -D-半乳糖苷)、PEG 3500、DMEM/F12培养基均购于Sigma ;色氨酸和亮氨酸缺陷型培养基(_Leu/_Trp Do Supplement)购于TaKaRa ;单链DNA(ssDNA)以及引物合成与DNA测序服务来自于Invitrogen ;活性炭处理胎牛血清购自Biowest ；Synergy2 酶标仪来自 Biotech。3. 2实验方法3. 2. I重组质粒的构建pGBKT7-ER α/β配体结合区(LBD)重组质粒利用PCR技术分别以pRST7_hER α和pCMV7-hER β为模板扩增获得ER a 301_553aa和ER β 248_510aa的DNA片断；分别将目的基因和载体PGBKT7双酶切，然后利用T4DNA连接酶连接，挑选正确的克隆后即可得到重组载体 PGBKT7-ER α / β LBD。pGADT7-SRCl核受体作用区(NRID)重组质粒利用PCR技术扩增得到SRClNRID (613-773aa)片断，然后依据标准分子克隆技术插入到pGADT7载体上，得到PGADT7-SRC1NRID 重组载体。3. 2. 2酵母细胞转化和培养以下操作如无特别说明均在无菌超净工作台下进行。酵母感受态细胞的制备用接种环从冻存的AH109酵母菌液中挑取少量在YPDA固体平板上画线，然后将YPDA平板放入30°C避光培养箱培养24小时。挑取平板上单克隆接种到5mL YPDA液体培养基中，放入摇床中30°C、250rpm过夜培养，将此5mL培养物转入50mL YPDA液体培养基中300C 250rpm培养3 4个小时至OD600 = O. 3-0. 4。将25mL菌液离心，4000rpm离心5分钟，弃上清，用30mL无菌蒸馏水完全重悬细胞沉淀，4000rpm离心5分钟；弃上清，用20mL无菌水重悬浮沉淀，再次离心5分钟。弃上清后加入300 μ L无菌水悬浮沉淀,最后分装至1.5mLEP管中，每管50yL。酵母感受态细胞制备完成。酵母细胞的转化和培养在上述制备好的50 μ L酵母细胞感受态管中分别加入构建好的AD和BD质粒各500ng,240y L 50% PEG 3350,36 μ L LiAc、ssDNA (单链 DNA) 50 μ g，然后将混合物在涡旋混匀器上振荡I分钟使其完全混合。将混合液放入30°C培养箱中静置30分钟后取出放入42°C水浴锅放置30分钟，其中每隔5分钟取出缓慢混匀完全悬浮。取其中400 μ L涂布于SD-T—L—培养基(无色氨酸和亮氨酸的合成培养基，配方每500 μ L液体含3. 35g无氨基酸的酵母氮源，0.77g色氨酸和亮氨酸缺陷型培养基，IOg D-葡萄糖)固体培养基平板，将平板放入30°C摇床中培养48小时，待长出单克隆后，接种到SD-T—じ液体培养基中摇菌。提取酵母质粒后进行PCR鉴定出阳性克隆，接种于SD-T_じ培养基中培养。3. 2. 3利用酵母双杂交系统测定化合物的激动作用或拮抗作用活性将转化有双质粒的酵母菌株在SD_T_じ培养基中培养。当0D_达到I. 0吋，将培养物用新鲜的培养基稀释至0D_为0. 05，然后每500 u L稀释液中加入0. 5 u L适当浓度的化合物溶液或者DMSO(空白对照)，混合物于30°C孵育20-24小时后，检测a -半乳糖苷酶的活性，由化合物浓度-a-半乳糖苷酶比活性曲线计算得出半数有效浓度(EC5tl)15检测拮抗活性吋，除加入适当浓度的化合物外，还加入1nM的阳性化合物17- 3 -雌ニ醇，将混合物同样于30°C孵育20-24小时后，检测a -半乳糖苷酶的活性，由化合物浓度-抑制率曲线计算得出半数抑制浓度(1C5tl)。3. 2. 4 a -半乳糖苷酶活性检测当培养液的OD6tltl到达0. 6-0. 8吋，将培养液放入4°C离心机中5000rpm离心5分钟，从上清中取16 ii L转移到96孔板中，然后加入48 u L PNP-a-Gal (4_硝基苯a-D-半乳糖苷)反应液。PNP- a -Gal反应液必须每次用前新配制，由2倍体积的NaAc缓冲液(0. 5MNaAc, pH 4. 5)和I倍体积的IOOmM PNP-a -Gal配制而成。上述反应体系静置于30°C孵育60分钟后加入136 u I终止缓冲液(1M Na2CO3)终止反应，室温放置I分钟后将96孔板放入Biotech酶标仪中测量反应体系在410nm的吸光值。其中作为酵母双杂交报告基因a-半乳糖苷酶(a-Galactosidase)的活性由下述公式计算活性=OD410XVfX1000/( e XbXtXViXOD600)活性以毫单位バ毫升X细胞数)[1^11111111^バ1111\(^11)]表示，t为孵育时间(以分钟为单位)，Vf为反应体系最后的体积(本实验中使用的是200 u I), Vi是体系中加入培养液上清的体积(16 u I)，OD600为酵母细胞培养液在600nm的吸光值，e Xb在本实验中的值为 10. 5 (mL/mol) (Yeast Protocols Handbook PT3024-1, Clontech)。实验结果见表I。3. 2. 5MTT 实验将乳腺癌细胞MCF 7培养于DMEM/F12培养基中，补加10%活性炭处理胎牛血清，并于37°C 5%ニ氧化碳培养箱中培养至细胞覆盖率为70-80%。弃掉培养皿中的培养基，用PBS溶液漂洗两次，吸除PBS后，加入适量胰酶消化细胞，用含血清培养液终止消化并将细胞悬浮，以每孔1000-10000个细胞接种至96孔板。细胞贴壁后，加入待测化合物至终浓度为IOOii M，37°C 5%ニ氧化碳条件下培养。48小时后，培养终止，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 20 uし继续孵育4小时，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加100 u L DMSO,振荡10分钟充分溶解结晶物，在酶联免疫监测仪上測定570nm波长处各孔光吸收值。MCF-7抑制率计算公式为[ (GAe2-GA处理)/(GAe2-GAdmso) ] X100%,GA表示a -半乳糖苷酶活性。GAe2为阳性化合物雌ニ醇(E2)组数据似_为受试化合物组数据；GADDMSO为空白对照组数据。3. 3实验结果酵母双杂交系统评价雌激素受体配体活性和MTT实验抑制乳腺癌细胞增殖的实验结果见表I。表I、化合物结构及对应的生物活性值
权利要求
1.式I所示取代苯甲(磺)酸酯类化合物作为雌激素受体的选择性配体的用途
2.如权利要求I所述的用途，其中所述雌激素受体的选择性配体是雌激素受体的激动剂或拮抗剂。
3.如权利要求I所述的用途，其中所述雌激素受体的选择性配体是治疗雌激素受体相关疾病及其并发症的药物。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述雌激素受体相关疾病包括乳腺癌和骨质疏松。
5.如权利要求I所述的用途，其中所述取代苯甲(磺)酸酯类化合物的筛选方法包括如下步骤 (1)受体模型的准备利用分子动力学模拟的方法对雌激素受体进行动力学采样，提取平衡阶段的平均结构作为虚拟筛选的受体模型； (2)虚拟筛选用Glide5.O对SPECS化合物库进行筛选，并且以已知活性的选择性雌激素受体新配体作为阳性化合物对照，获得能量打分相当于阳性化合物的分子，具体分三步，第一步采取高通量模式(HTVS)去除明显不能与雌激素受体结合的分子，第二步采用标准模式(SP)缩小命中分子的范围，第三步采用精确模式(XP)去除可能的假阳性。最后利用Lipinski规则对所得分子进行分子类药性评价； (3)自由能计算采用MM-GBSA方法对步骤(2)所得分子进行自由能计算，根据结合自由能高低，选出结合自由能与阳性化合物相当的分子； (4)视觉分析对接筛选，得到基于结合自由能的打分，并结合步骤(I)中打分情况筛选出打分高，作用模式好的化合物； (5)生物测试对最终挑选出的化合物进行酵母水平雌激素受体激动/拮抗活性测试。
全文摘要
本发明提供式I所示取代苯甲(磺)酸酯类化合物作为雌激素受体的选择性配体的用途式I其中R选自苯基或二苯基取代的烷基和芳香基Ar，Ar为可被1-2个选自羟基、烷基、烷氧基和烷酰基取代基取代的苯基或萘基；X为C或S＝O；Y为1-2个卤原子、OH、烷基或烷氧基。本发明采用计算机模拟药物设计技术和生物活性测试相结合的方法有效地筛选具有选择性雌激素受体激动或拮抗作用的配体，它们可作为药物先导化合物，用于制备雌激素受体介导的相关疾病治疗药物。
文档编号C40B30/02GK102614165SQ201110029160
公开日2012年8月1日 申请日期2011年1月27日 优先权日2011年1月27日
发明者唐赟, 沈杰, 谭乘方, 黄瑾 申请人:华东理工大学