近红外二区荧光功能合金纳米点、制备方法及其在生物荧光成像方面的应用与流程

本发明属于近红外荧光纳米材料技术领域，具体涉及一种一步法水相制备近红外二区荧光功能合金纳米点、制备方法及其在生物荧光成像方面的应用。

技术背景

近红外二区荧光纳米材料是指发射区域介于1000至1400nm之间的一种新型荧光材料。与其他波段荧光材料相比，近红外二区荧光材料的荧光具有更高的组织穿透力、更低的组织内光子吸收与散射和可忽略不计的机体自发荧光，因此在无创活体原位荧光成像领域具有更好的应用前景。目前已报到的近红外二区荧光材料主要为ag2se(j.am.chem.soc.,2011,134,79-82.)、pbs(chem.commun.,2013,49,7584-7586)、pbse(acsnano,2011,5,1958-1966)、cdhgte(chem.mater.,2008,20,6764-6769)等。这些纳米材料大多是基于pb、cd、hg、se和te等含有急性或者慢性的毒性材料，且合成操作过程相对繁琐，反应条件严苛，大大限制了其在生物领域的应用。

荧光合金纳米点是一种新型的荧光纳米材料，当在单一组分的金属纳米点中掺杂其他金属，形成新的金属合金纳米点时，合金纳米点不仅保持了原有金属纳米点的荧光性质、水溶性和生物相容性等优点，通过另一种金属的掺杂，还可以调节主体金属纳米点的光学性质，并引入新的功能。合金纳米点的荧光可以依据合金纳米点内掺杂金属的含量，在近红外一区至近红外二区内可控调节。但目前已报道具有近红外二区荧光功能的合金纳米点(j.am.chem.soc.,2013,135,5266-5269；adv.funct.mater.,2014,24,6532-6539)其较低的荧光效率，和较差的稳定性限制了在生物成像方面的应该用。因其，急需找到一种简单有效的方法合成稳定性好、荧光量子效率高、生物毒性低的水相近红外二区荧光性质的合金纳米点，使其应用于生物荧光成像。

技术实现要素：

本发明提供了一种简单有效的一步法制备荧光效率高、生物毒性低、可用于生物荧光成像的近红外二区荧光功能合金纳米点。其是在水溶性多官能团大分子作为稳定剂的水溶液中，加入一定浓度的两种金属离子，混合均匀后，向溶液中加入还原剂，在加热条件下反应一段时间，一步制备出近红外二区荧光功能合金纳米点；然后用异丙醇沉淀、离心、分散多次，最终分散在水溶液中，得到荧光合金纳米点。此种近红外二区荧光功能合金纳米点可以实现生物荧光成像等生物影像学方面的应用。

本发明所述的用于生物荧光成像的近红外二区荧光功能合金纳米点的制备方法，其步骤如下：

(1)在浓度为1×10^-4～0.5mmol/l(优选为1×10^-4～0.1mmol/l)的水溶性多官能团大分子(可以是牛血清白蛋白、聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、聚丙烯胺盐酸盐等)做为稳定剂的水溶液中，加入浓度为0.01～50mmol/l(优选为0.01～10mmol/l，进一步优选为0.1～10mmol/l)的au³⁺(可以是haucl4等的水溶液)或ag⁺离子溶液(可以是agno3、ch3cooag、agf、ag2so4、agclo4等的水溶液)，ag⁺或au³⁺与稳定剂水溶性多官能团大分子的摩尔比为1～100：1(优选为50～100：1)；

(2)向步骤(1)得到的溶液中加入浓度为0.01～50mmol/l(优选为0.01～10mmol/l，进一步优选为0.1～10mmol/l)的过渡金属盐的水溶液(可以是cucl2、cuso4、co(no3)2、nicl2、mncl2等的水溶液)，过渡金属离子与ag⁺或au³⁺的摩尔比为0.01～1：1(优选为0.01～0.1：1)；

(3)向步骤(2)得到的溶液中加入还原剂(可以是硼氢化钠、水合肼、柠檬酸钠、抗坏血酸等)，还原剂与ag⁺或au³⁺的摩尔比为1～100：1(优选为1～20：1)，然后在60～100℃下搅拌30min～480min(优选为30min～360min，进一步优选为60min～300min)，反应结束后离心，向清液中加入异丙醇(其体积为溶液体积的2～10倍)作为沉淀剂，以离心的方式收集沉淀，并将沉淀分散在水中；重复以离心的方式收集沉淀，并将沉淀分散在水中的操作步骤3～5次；最后再以离心的方式收集沉淀，得到的固体产物即为本发明所述的近红外二区荧光功能合金纳米点。

本发明所述制备的近红外二区荧光功能合金纳米点粒径均匀，尺寸小于4nm(图1)，具有良好的近红外二区荧光发射(图2)。通过控制两种金属离子(ag⁺或au³⁺与过渡金属离子)在合金纳米点中的含量，可以得到发射峰位从近红外一区至近红外二区(810nm到1130nm)荧光可调的合金纳米点(图3)。制备过程使用水溶性多官能团大分子作为稳定剂，因此环境污染小，产物纯度高，表现出良好的光学性质和水溶性。另外，此种近红外荧光材料制备方法简单，条件温和，容易操作，重复性好，适合大量生产，并可成功应用于大鼠的活体近红外荧光成像(图4)

附图说明

图1：实施例1所制备近红外二区荧光ag/cu合金纳米点透射图，合金纳米点平均粒径尺寸为3nm左右，图1中插图为合金纳米点的高分辨透射电镜照片，显示合金纳米点的晶格间距为

图2：实施例2所制备近红外二区荧光au/co合金纳米点荧光光谱，光谱表明合金纳米点的激发峰位为562nm，发射峰位为近红外二区的1080nm；

图3：实施例3所制备近红外二区荧光au/cu合金纳米点荧光光谱，其光谱表明随着增加合金纳米点中cu元素的含量(0％～50％)，合金纳米点的荧光发射峰位会从近红外一区的811nm移动至近红外二区的1130nm；

图4：实施例3所制备近红外二区荧光au/cu合金纳米点静脉注射入大鼠后，大鼠的近红外二区荧光成像照片，可以看出合金纳米点能够很好地实现对大鼠的荧光成像，显著降低了大鼠自发荧光的干扰，并能呈现大鼠的细微结构，可以轻易区分大鼠的脏器、血管等组织器官。

具体实施方式

实施例1

在10ml浓度为0.025mmol/l的牛血清蛋白(bsa)的水溶液中，依次加0.5ml浓度为50mmol/l的agno3溶液，0.01ml浓度为25mmol/l的cuso4溶液，0.0735g柠檬酸钠，在70℃下加热5h后，将反应后的溶液离心，向清液中加入50ml异丙醇作为沉淀剂，以离心的方式收集沉淀，并将沉淀分散在5ml水中；重复以离心的方式收集沉淀，并将沉淀分散在5ml水中的操作步骤3次，最后再以离心的方式收集沉淀，所得棕褐色沉淀即为ag/cu合金纳米点，透射电镜下，合金纳米点尺寸为3nm左右，粒径均匀，分散性好(图1)。

实施例2

称取0.15g聚乙二醇作为稳定剂溶解在5ml水中，向溶液中分别加入0.25ml浓度为40mmol/l的haucl4溶液，0.25ml浓度为20mmol/l的cocl2溶液，0.038g硼氢化钠，在80℃下加热4h后，将反应后的溶液离心，向清液中加入50ml异丙醇作为沉淀剂，以离心的方式收集沉淀，并将沉淀分散在5ml水中，重复以离心的方式收集沉淀，并将沉淀分散在5ml水中的操作步骤3次，最后再以离心的方式收集沉淀，所得深黄色沉淀即为au/co合金纳米点。所制得的au/co合金纳米点具有良好的近红外二区荧光性质，激发峰为562nm，荧光发射峰为1080nm(图2)。

实施例3

不同荧光发射的au/cu合金纳米点的制备。称取0.3g聚乙烯亚胺溶解于10ml水中。向溶液中加入1ml浓度为50mmol/l的haucl4溶液，或总体积为1ml、浓度为50mmol/l的haucl4和cucl2溶液，使两者摩尔比分别9.5：0.5、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5。再向溶液中加入0.3ml水合肼作为还原剂，100℃下反应4h后，将反应后的溶液离心，向清液中加入50ml异丙醇作为沉淀剂，以离心的方式收集沉淀，并将沉淀分散在5ml水中，重复以离心的方式收集沉淀，并将沉淀分散在5ml水中的操作步骤3次，最后再以离心的方式收集沉淀，即可得到荧光可调的au/cu合金纳米点。随着纳米点中铜含量的增加，其荧光峰位会从近红外一区811nm红移至近红外二区1130nm(图3)。将这种近红外二区荧光au/cu合金纳米点注射入大鼠体内后，能够很好地实现对大鼠的活体近红外荧光成像(图4)。