专利名称：人源性重组抗人TNF－α基因工程抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用分子生物学手段制备的用于中和肿瘤坏死因子α毒性的人源性重组抗人TNF-α基因工程抗体(human anti-tumornecrosis facter-α genetic engineering antibody)。
现已申请的《重组抗人TNFα基因工程抗体及其制备方法》(申请号为00113874.X)发明专利中所获得的抗人TNF-α单链抗体为小型化的鼠源性抗体，它虽然免疫原性非常弱，但仍自然存在着免疫原性，长期重复注射使用仍会导致免疫反应，降低其治疗作用，甚至使其彻底失效，而这类抗体在临床上是需要反复使用的。所以最好是使用不存在任何免疫原性的人源抗体。
为克服上述缺陷本发明的目的在于提供一种用于中和TNF-α毒性的人源性重组抗人TNF-α基因工程抗体。它对机体受到过量TNF-α毒性的保护具有明确的预防作用，优于鼠源性抗体。
本发明所获得的用于中和TNF-α毒性的人源性重组抗人TNF-α基因工程抗体的基因序列为ATGGCACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACATGGGTGGGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGTTCGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA。
上述人源性抗TNF-α单链抗体的基因全序列及部分序列，包括突变体以及与其它目的基因的融合体。
该基因工程抗体的获得是利用分子生物学手段制备的，其主要步骤包括(1)从人源性噬菌体抗体库中筛选人源性抗TNF-α单链抗体基因序列；(2)利用基因工程手段获得人源性抗TNF-α可变区基因序列、改构的单链抗体基因序列及Fab基因序列，Fab基因序列是指在TNF-α单链抗体基因序列基础上构件出Fab抗体片段；(3)利用基因工程手段获得人源性抗TNF-α单链抗体和Fab抗体重组表达产物；(4)通过表达产物的纯化，或变性复性和纯化后获得具有良好生物学活性的人源性重组抗TNF-α单链抗体；(5)将适当剂量的人源性重组抗TNF-α单链抗体和Fab抗体用于刺激培养细胞可产生对TNF-α毒性的中和效应。
上述步骤所述的利用基因手段，包括利用各种原核系统，酵母系统和真核系统表达人源性抗TNF-α单链抗体和Fab抗体。
通过大量体外细胞试验证实人源性的重组抗TNF-α单链抗体和Fab抗体具有中和TNF-α毒性的作用，对组织损伤的保护和类风湿关节炎的治疗作用显著，与鼠源性抗体有相似的亲和力。它克服了鼠源性抗体存在免疫原性问题，能够保证长期疗效。具有批量生产，操作简单，生产周期短，产量高，成本低，纯度高，活性好，质量稳定，使用安全的特点。在平战时有广阔的应用前景。
以下结合具体实施方法和实验例对本发明作进一步说明。
实施方法1.人源性抗TNF-α单链抗体基因的获得从一个人源性噬菌体抗体库中用重组的人TNF-α筛选有较高结合活性的单链抗体基因序列。2.人源性抗TNF-α小分子抗体基因序列的获得用分子克隆的手段获得编码人源性抗TNF-α可变区基因、改构的单链抗体基因序列及Fab基因序列。3.人源性抗TNF-α单链抗体的重组表达将编码人源性抗TNF-α单链抗体基因序列克隆到大肠杆菌表达载体pBV220上，转化大肠杆菌，得到表达人源性抗TNF-α单链抗体的工程菌。4.人源性抗TNF-αFab抗体基因工程产物的获得将编码人源性抗TNF-αFab抗体基因序列克隆到噬菌粒pCOM3H上，转化大肠杆菌，得到表达人源性抗TNF-αFab抗体的工程菌。5.人源性抗TNF-α单链抗体和Fab抗体的纯化大肠杆菌表达产物经裂菌，层析纯化或包涵体分离、变性复性、经过合理组织的多种层析分离手段纯化，得到人源性抗TNF-α的基因工程产物。
实验例1培养小鼠成纤维细胞L929接种96孔培养板5×104个/孔，单链抗体和Fab抗体分别以系列浓度(0.1ug/ml～5ug/ml)，与rHuTNF-α(4ug/ml)等体积混合，37℃予作用1小时或立即加入培养细胞悬液中；结果显示单链抗体和Fab抗体均随其浓度的增高，抑制TNF-α对L929细胞毒性的作用也随着增强，在4ug/ml抗体浓度，细胞存活率可达90％以上。表明此人源性单链抗体和Fab抗体具有保护L929细胞免受TNF-α细胞毒的作用。
实验例2应用生物大分子相互作用分析人源性单链抗体和Fab抗体的亲和力，结果表明单链抗体和Fab抗体均具有较高的亲和力，亲和常数达到1×106M-1。
多次系统的实验都证明人源性抗TNF-α单链抗体和Fab抗体是有效的TNF-α毒性防护剂且优于鼠源性抗体。
权利要求
1.人源性重组抗人TNF-α基因工程抗体，其特征在于它是人源性抗人TNF-α单链抗体，其基因序列为ATGGCACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACATGGGTGGGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGTTCGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA。
2.根据权利要求1所述的人源性重组抗人TNF-α基因工程抗体，其特征在于所述抗体的基因全序列及部分序列包括突变体以及与其它目的基因的融合体。
全文摘要
本发明涉及一种利用分子生物学手段制备的用于中和肿瘤坏死因子α毒性的人源性重组抗人TNF－α基因工程抗体。它对机体受到过量TNF－α毒性的保护具有明确的预防作用,并克服了鼠源性抗体存在免疫原性问题,能够保证长期疗效,具有纯度高,活性好,质量稳定,使用安全的特点。
文档编号C07K16/18GK1351084SQ00113949
公开日2002年5月29日 申请日期2000年10月26日 优先权日2000年10月26日
发明者陈萍 申请人:陈萍