改善疾病治疗的特异性的制作方法

专利名称：改善疾病治疗的特异性的制作方法
技术领域：
本发明涉及改善疾病治疗的特异性。
背景技术：
虽然已经开发出许多治疗方法，但是肝脏疾病特别是病毒性肝炎B和C仍然是严重的威胁。根据所采用的药物，可将治疗分类为直接的抗病毒治疗和间接的抗病毒治疗、或者直接与间接抗病毒治疗的组合。
直接的抗病毒治疗能干扰病毒复制和/或病毒装配。例如，可采用核苷类似物通过抑制病毒逆转录酶来减少病毒复制。然而，核苷类似物通常伴有副作用，这包括贫血和/或中性白细胞减少。然而，延长与核苷类似物的接触会使一些病毒株产生耐药。为了避开与耐药性有关的一些问题，可进行核苷类似物的鸡尾酒疗法。令人遗憾的是，核苷类似物的鸡尾酒疗法典型地仅能延迟耐药性的发作。另外，核苷类似物通常对快速分裂宿主细胞中的病毒复制和复制机体不具有选择性，因此对宿主表现出显著的细胞毒性。
另外，蛋白酶抑制剂可用来阻断病毒蛋白的正确装配。蛋白酶抑制剂对病毒蛋白酶类具有较高的特异性，因此典型地避免了与在快速分裂的宿主细胞中病毒复制与复制之间的有限选择性相关的问题。然而，即使在相对较低的剂量时，也易于发生包括恶心、腹泻、糖尿病和肾结石等的副作用。另外，一些蛋白酶抑制剂仅微溶于水性溶液中，因此降低了能够传递给患者的可能数量。此外，在延长治疗后，病毒会对一些蛋白酶抑制剂产生抵抗力。
间接抗病毒治疗可用于刺激免疫系统识别病毒抗原，或者将免疫系统的细胞因子平衡转化成I型细胞因子应答，这被认为是有助于建立抗病毒感染细胞的细胞免疫。例如，干扰素-α可用于治疗慢性肝炎C。但是，许多以IFN-α治疗的病人在停止治疗后复发，且一些病人在治疗中会发生病毒突破。此外，IFN-α在低剂量下趋于引起发烧、头痛、嗜睡、食欲不振、焦虑和抑郁，在高剂量下引起骨髓功能减退和血细胞计数。
病毒唑与干扰素-α联用可进行直接和间接抗病毒治疗的一种或两种，该方法可明显减少许多病人的炎症和血清ALT水平。尽管病毒唑表现出相对较好的治疗效力，但是仍然存在许多问题。例如，尤其是在较高的剂量时，病毒唑在红细胞中的胞内磷酸化可引起溶血性贫血。此外，磷酸化的病毒唑易于在红细胞中积蓄，从而显著地减少了有效剂量。因此，需要施用相对较高的剂量，才能使病毒唑在肝细胞中达到适当的剂量。
尽管本领域存在许多用于治疗肝脏疾病的组合物和方法，但是它们全部或几乎所有均存在着一种或多种缺点。因此，仍然需要提供用于治疗疾病的改良组合物和方法。
发明概述本发明涉及用于提高药物选择性的方法和组合物。通常，可用保护基团对药物进行共价修饰。
具体地说，在本发明主题的一个方面中，保护基团经由保护基团上的氮原子与药物结合。经修饰药物中的保护基团减少了药物在非靶细胞中的代谢转化和螯合(即积聚)，并且所述保护基团可在靶细胞中经酶促除去。
在本发明主题的另一方面中，认识到药物的代谢转化可导致对靶细胞的损害，而经由保护基团中氮原子与药物连接的保护基团可阻止代谢转化，并且保护基团可在靶细胞中与药物分离。因此，可考虑采用保护基团修饰药物，并将所述药物施用到包括靶细胞和非靶细胞的系统中以减少细胞毒性。
在本发明主题的另一方面中，认识到药物在非靶细胞中的代谢转化可减少药物的有效浓度，而且进一步认识到经由保护基团中氮原子与药物连接的保护基团可阻止代谢转化，并且保护基团在靶细胞中与药物分离。因此，可采用保护基团修饰药物来降低剂量。也可将药物施用到包括靶细胞和非靶细胞的系统中。
可采用的药物包括甲酰胺基团(carboxamide)，尤其是1-β-D-呋喃核糖基(ribofuranosyl)-1，2，4-三唑-3-甲酰胺和2-β-D-呋喃核糖基-4-噻唑甲酰胺，也可采用它们的各自的L-同质异构形式。保护基团不限于特定化学性质的基团，优选保护基团包括氮原子。尤其优选的保护基团是＝NH。所述靶细胞不限于特定的细胞类型，可以是被感染或未被感染的、或者是过增殖性细胞。然而，尤其优选是病毒感染的或过增殖性的肝细胞和神经元，和非靶细胞包括红细胞。
结合附图，参考以下对本发明优选实施方案的详细说明，将容易地领会本发明的许多目的、特征、方面和优点。
附图简述附

图1A和1B是本发明示例性药物的摄取和保留图示。
附图2是合成病毒唑的示例性合成路线。
附图3是合成修饰的病毒唑的示例性合成路线。
详细说明在本文所用的术语“药理学作用”是指包含细胞的系统中的细胞在代谢、复制、结构、或寿命方面的任何变化，所述变化可由加到该系统的分子所引起。例如，对酶催化的合成代谢、分解代谢或聚合酶型反应的抑制，均可被认为是药理学作用。同样地，KinI驱动蛋白引起的微管蛋白解聚也被认为是该定义范围内的药理学作用。相反，对系统中细胞内产生的代谢物所引起的酶变构抑制则不认为是药理学作用，因为这种变构抑制剂并未被加到该系统中。
在本文所用的术语“靶细胞”是指药物将对其发挥药理学作用的细胞。例如，病毒感染的肝细胞即被认为是药物病毒唑适用的靶细胞。相反，术语“非靶细胞”包括含细胞的系统中的全部细胞，也就是说是非靶细胞。
众所周知，在某些药物旨在对特定细胞(即靶细胞)展现药理学效力时，非靶细胞能以相当大的速率代谢那些药物，这往往导致不想要的非特异性副作用。本发明人发现，通过用保护基团修饰药物可以阻止在非靶细胞(即其中或表面上)的这种不想要的代谢转化，所述保护基团可在靶细胞中有选择地除去，从而提高了药物的药理学作用的选择性，相应地降低了细胞毒性和药物的剂量。
在本发明主题的一个方面中，采用下述方法可增加药物药理学作用的选择性，该方法中所述药物在一步中对靶细胞具备所需的药理学作用。在另一步骤中，用保护基团修饰药物，其中保护基团通过保护基团上的氮原子与药物共价结合。保护基团还可降低药物在非靶细胞的蓄积，并且可在靶细胞中经酶促从药物上除掉。在此所用的与药物的药理学作用有关的术语“选择性”是指药物优先对靶细胞发挥药理学作用以达到治疗目的，而不是对非靶细胞发挥药理学作用而产生不想要的非靶细胞中药物的副作用。
例如，病毒唑通过与＝NH基团共价结合形成甲脒(carboxamidine)基团，可增加1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺(病毒唑，结构1)的药理学作用的选择性。已知病毒唑在肝炎病毒感染的肝细胞中表现出抗病毒特性(例如参见Marcellin，P.和Benhamou J.慢性病毒性肝炎的治疗，Baillieres Clin Gastroenterol 1994年6月，8(2)233-53)。也已知病毒唑在红细胞中很容易以明显的速度被磷酸化成药理学活性形式病毒唑磷酸盐，这降低了选择性药理学作用(例如Homma，M.等，高效液相色谱测定全血中的病毒唑以评价红细胞中的配置；Antimicrob Agents Chemother 1999年11月；43(11)2716-9)。本发明人惊奇地发现，经＝NH基团修饰的病毒唑(1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲脒，结构2)不在或者仅在红细胞中进行极少量的磷酸化，而且1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-β-3-甲脒中的＝NH基团也可在肝细胞中特异性和酶促性地除去，以形成1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺。 结构1结构2经修饰病毒唑的选择性蓄积的降低如附图1A和1B所示。在附图1A中，红细胞(非靶细胞)100中出现病毒唑(R)。病毒唑进入红细胞中，并磷酸化成仍保留在红细胞中的药理学活性的病毒唑-磷酸盐(R-P)。同样地，肝细胞(靶细胞)110中也出现病毒唑(R)。病毒唑进入肝细胞中，并磷酸化成仍保留在肝细胞中的药理学活性的病毒唑-磷酸盐(R-P)。在附图1B中，红细胞(非靶细胞)101中出现经修饰的病毒唑(R*，1β-D-1，2，4-三唑-3-甲脒)。经修饰的病毒唑进入红细胞中，然而并不进行磷酸化，因此可从红细胞中出来。同样地，肝细胞(靶细胞)111中出现经修饰的病毒唑(R*)。修饰后的病毒唑进入肝细胞中，并经酶促脱去氨基成病毒唑，接着磷酸化成仍保留在肝细胞中的具有药理学活性的磷酸化病毒唑-磷酸盐(R-P)。
在本发明主题的另一个方面中，除了病毒唑，还有许多药物适于本发明在此提出的概念。通常，适当的药物包括除了在靶细胞之外还可在细胞中代谢、活化和/或失活的药物，特别适宜的药物包括核苷、核苷酸、核苷类似物和核苷酸类似物。例如，噻唑呋林(Tiazofurin，2-β-D-呋喃核糖基-4-噻唑甲酰胺)是具有甲酰胺基团的核苷类似物，其中甲酰胺基团可容易被＝NH基团修饰成相应的甲脒。在另一个实施例中，其他药物包括核苷尿嘧啶、或核苷类似物5’-氟代尿嘧啶(5’-FU)。
在本发明主题的其他方面中，保护基团不限于＝NH基团，而且也可包括各种伯胺和仲胺，只要保护基团可以通过氮原子与药物共价结合即可。在此所用的术语“保护基团”是指可与药物共价结合的化学基团，当其与药物结合时，至少能阻滞药物的一种代谢转化。在此使用术语“药物的代谢转化”是指药物的任何胞内和/或胞外的化学变化，也就是说由细胞或细胞系统代谢所造成的，尤其包括酶催降解(例如，氧化、水解分裂)和酶促修饰(例如，糖基化作用、磷酸化作用)。
适当的保护基团通常具有N(R1)(R2)或＝NR1结构，其中R1和R2独立地为氢、线性或支链烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基链烯基、或芳基炔基、芳基，所有这些还可包含杂原子(包括氮、氧、硫或卤素)。然而，尤其优选那些可经酶促从药物上除去的保护基团，特别适宜的酶包括肝脏特异性的氨基水解酶，包括脱氨基酶(例如，腺苷或胞嘧啶脱氨酶)，肝脏脱氨酶(例如，烟酰胺脱酰胺酶)和肝脏转氨酶(谷氨酸-丙酮酸盐转氨酶)。
所考虑的保护基团可在药物分子的许多位置共价结合，通常优选的药物是在甲酰胺部分修饰的药物，除了甲酰胺基团还可采用其他位置，尤其是羰基(例如羧酸和酮型羰基)。例如，尿嘧啶及其类似物5′-FU环部分中的每一羰基均可被保护基团修饰。
尽管不希望对本文所述的本发明概念加以限制，但预期药物一旦与非靶细胞接触，保护基团可能使药物失活或阻止其随后的活化。例如，如果保护基团与药物结合的位置是药物与靶分子间特异作用所不可缺少的位置(受体或酶作用物结合部位)，保护基团会使药物失活。另一方面，保护基团也可在能阻止其代谢活化的位置上与药物结合。
根据药物和/或保护基团的化学性质，保护基团可取代官能团或取代基，或者保护基团与官能团或取代基连接。例如，当药物是病毒唑，而保护基团是＝NH基团时，病毒唑的甲酰胺基团上的氧原子可被＝NH基团取代。另一方面，当药物包括亲核基团(例如-O-)，和保护基团包括带有适当离去基团的仲胺时，仲胺可与亲核基团连接。
至于修饰药物的步骤，可采用包括有机合成修饰、酶修饰或全程合成的方法以产生经修饰的药物。例如，当药物包括活化的羰基功能团时，可在单一的亲核交换反应中实现对羰基原子的酰胺化。或者，尤其是当药物除了具有可与保护基团连接的基团之外还有许多活性基团，全程合成修饰的药物则更加在经济上吸引人。尤其适宜的是，也可将药物和保护基团作为酶底物，经反应将保护基团引入药物中，从而对适当的药物进行酶促修饰。如果可行，用于这种修饰的酶优选来源于靶细胞(例如，来源于外源或异种、或来源于表达酶基因编码的重组体)。
应当理解的是，根据非靶细胞的类型以及药物和/或保护基团的化学性质，可采用不同的机制中的至少一种机制来阻止药物在非靶细胞中的蓄积，所述机制包括降低通过药物特异性转运体(transporter)的摄取，减少代谢转化成可保留形式(例如，由于附加或新的电荷，疏水性的改变或exporter识别的改变)，或者由于增强了从非靶细胞中的排出(例如由于保护基团中的分泌信号)。例如，当药物是核苷类似物，而非靶细胞具有核苷转运体(可选择性地转运(import)不含亲脂部分的核苷)；将亲脂部分例如保护基团加到药物上能阻止药物蓄积。在另一个例子中，通过将甲酰胺基团转化变成甲脒基团，可阻止许多核苷在红细胞中被磷酸化(和伴随的蓄积)(见上文)。
至于经酶催化消除靶细胞中的保护基团，可根据靶细胞、保护基团和药物的类型，对酶催化消除法加以变化。酶催化消除法包括不同种类的酶，包括水解酶、转移酶、裂解酶和氧化还原酶，和特别优选的作用物是腺苷和胞嘧啶脱氨基酶、精氨酸酶、转氨酶、和芳基酰胺酶。还应理解的是，用于酶催化消除保护基团的酶可仅在靶细胞中被表达，然而在本发明主题另一个方面中，适当的酶也可在除了靶细胞之外的细胞中被表达，只要酶不是在包含细胞系统细胞被普遍表达即可。还可理解的是，在正常的和/或病理学的条件下，酶在各自靶细胞中是天然地被表达的(即非重组体)。例如，已知谷氨酰胺-丙酮酸盐转氨酶在肝细胞中是以相对较高的选择性被组成型表达的，因此它可用作除去保护基团的适当酶。另外，已知胞嘧啶脱氨酶在结肠癌细胞中可被相对较高量地表达，而在正常结肠细胞中不被表达或者仅表达较低量。
在本发明的另一方面中，可采用一种方法减少药物对非靶细胞的细胞毒性，其中在一个步骤中认识到药物在非靶细胞中的代谢转化会导致对非靶细胞的损害。在本文所用的术语“细胞毒性”是指对非靶细胞的不想要的药理学作用，所述不想要的药理学作用尤其包括对复制、能量代谢的抑制，或者包括细胞死亡。在另一步骤中，采用保护基团对药物进行修饰，其中保护基团通过保护基团上的氮原子与药物共价偶合，所述保护基团能降低药物在非靶细胞中的代谢转化，并可在靶细胞中经酶促与药物分离。在另一步骤中，将药物施用到系统中，该系统包括靶细胞和非靶细胞，其中保护基团共价偶合到药物上。
在一个优选的降低药物对非靶细胞细胞毒性的方面，所述代谢转化包括在红细胞中将药物磷酸化成相应的药物磷酸盐。例如本领域熟知，在许多细胞中可将抗病毒药物病毒唑的磷酸化产生药理学活性的病毒唑5′-单磷酸盐(例如，Homma，M.等，高效液相色谱法测定全血中的病毒唑以评价其在红细胞中的配置；Antimicrob AgentsChemother 1999年11月；43(11)2716-9)，它是能抑制肌苷酸脱氢酶(IMPDH)的化合物。令人遗憾是，病毒唑-5’-单磷酸盐对红细胞有明显的细胞毒素作用(De Franceschi等；病毒唑在治疗慢性肝炎病毒感染病人中所致的溶血性贫血膜氧化性损伤的作用，Hepatology，2000年4月；31(4)997-1004)，由此可以认为，预防或者减少在红细胞中形成病毒唑-5’-单磷酸盐将会显著地减少病毒唑的细胞毒性。
然而，可以理解的是，除了磷酸化作用以外，还可利用药物在非靶细胞的其他代谢转化作用，这包括氧化、还原、药物内部共价键的水解裂解、加成或者除去侧基以及开环反应。例如，当非靶细胞是肝细胞时，代谢转化包括已知发生在肝脏中的多种酶促解毒作用或者增溶反应(例如，糖基化作用、细胞色素P450介导的氧化等)。在另一实例中，代谢转化包括磷酸酶或酯酶活性。
根据代谢转化类型的不同，转化可限于单一类型的非靶细胞中，但是也可在不止一种细胞类型中发生。例如，在具有相对较高的核酸合成速率非靶细胞中，代谢转化是由涉及该核酸合成的酶所介导的，不同类型的生长迅速细胞会表现出代谢转化。另一方面，代谢转化也可因药物能否进入特定的细胞或者器官而受限制。
可以理解的是，通过采用许多已知的实验方法，可识别和/或证实共价偶合到药物上的保护基团降低了药物在非靶细胞中的代谢转化。例如，在体外培养非靶细胞时，可考虑将非靶细胞与相应的放射性标记的药物一起培养，采用多种分析方法(包括免疫测定、薄层色谱法或气-质谱联用法)，可确定放射性标记药物的代谢产物。另外，对于哺乳动物中的非靶细胞，组织活检可提供充足的样品供分离和确定所施用药物的代谢产物。
进一步考虑到对非靶细胞的损害类型基本上是可以变化的，包括减缓非靶细胞中的细胞代谢直至细胞死亡。例如，当代谢转化形成了糖酵解途径中酶的抑制剂时，则需至少部分地通过补救途径向非靶细胞供给能量。同样地，当药物以相对较慢的速率代谢转化成酶抑制剂时，抑制剂对酶表达的上调节几乎完全弥补了活性部位数量的减少。另一方面，当代谢转化产生了自由基(radical species)时，脂质过氧化作用会导致严重的膜损害以及随后的细胞死亡。
药物代谢转化所导致的损害可以是直接或者间接的。例如，当代谢转化生成阻滞酶的酶抑制剂时，则可认为该损害是直接的。另一方面，当代谢转化生成中间体(可随后经胞内或者胞外修饰成酶抑制剂)时，则认为该损害是间接的。
至于将药物施用到系统的步骤，考虑可采用任何适当的药物制剂和以任何适当方案施用适当药物。这样，可采用包含药物的可接受的常规非毒性载体、助剂和赋形剂的剂量单位制剂，经口、非肠道(包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或者输注技术)、吸入喷雾、直肠给药、局部给药等等途径施用。例如，适当的药物可以其药理学可接受的盐形式经口施用，和以在生理盐溶液的形式静脉内施用(例如缓冲至pH值约7.2-7.5)。可采用常规缓冲剂例如磷酸盐、碳酸氢盐或者柠檬酸盐。此外，为了使本发明化合物的药物动力学对病人发挥最大的有益效力，本领域普通技术人员可以对特定药物的给药途径和给药方案加以调整。
在某些药物给药形式中，可采用药物的前药形式。本领域普通技术人员熟知如何容易地将药物修饰成其前药形式，以促进活性化合物传递到宿主机体或者病人的目标位点。本领域普通技术人员也可利用前药形式的有利的药物动力学参数，如果适宜，可将本发明化合物传递到宿主机体或者病人的目标位点，从而使化合物的预期效果最佳化。
还可理解的是，所述药物可单独施用或者与其他的药理学活性物质联用，可以单独或者共同施用，其中分别施用时可同时或者以任何顺序分开施用。适宜的药理学活性剂包括抗病毒剂(例如干扰素α和γ)；抗真菌剂例如发癣退、两性霉素B去氧胆酸钠(FungizoneTM)、LotriminTM、MycelexMTM、制霉菌素和Amphoteracin；抗寄生物剂例如噻苯咪唑(MintezolTM)、NiclocidewTM、甲苯咪唑(VermoxTM)和甲硝哒唑(FlagylTM)；肠用药例如ImmodiuniTM、LomotilTM和PhazymeTM；抗肿瘤剂例如干扰素α和γ、AdriamycinTM、CytoxanTM、ImuranTM、氨甲喋呤、MithracinTM、TiazofurinTM、TaxolTM；皮肤病用药例如AclovateTM、CyclocortTM、DenorexTM、FloroneTM、OxsoralenTM、煤焦油和水杨酸；偏头痛制剂例如麦角胺化合物；甾体和上述未列出的免疫抑制剂，包括环孢子菌素、DiprosoneTM、氢化可的松；FloronTM、LidexTM、去羟米松和Valisone；和代谢剂例如胰岛素，以及不适于分入上述分类的其他药物，包括细胞因子例如IL2、IL4、IL6、IL8、IL10和IL12。
至于所述药物以及药理学活性剂的剂量，可根据所治疗疾病、严重性、所用的疗法方案、所用药物的药动学以及所治疗的患者(动物或人)，对其治疗有效量加以调节。适宜的剂量包括0.5mg/kg-0.1mg/kg和更低，但也包括0.5-1.0mg/kg和更高的剂量。通常，优选包括靶细胞和非靶细胞的所述系统是哺乳动物(最优选为人)，也可采用其他适当的系统，和尤其包括细胞和组织的体外培养物。
至于用来降低药物对非靶细胞的细胞毒性的所述方法中所采用药物、保护基团、药物的修饰步骤、靶细胞和非靶细胞，也需进行上述考虑。
在本发明主题的另一方面中，提供了减少系统中药物剂量的方法，其中药物在非靶细胞的代谢转化降低了药物在包括非靶细胞和靶细胞的系统中的浓度。在另一步骤中，采用保护基团对药物进行修饰，其中保护基团通过保护基团上的氮原子与药物共价偶合，所述保护基团能降低药物在非靶细胞中的代谢转化。在随后的步骤中，将药物施用到系统中，其中保护基团与药物共价偶合，并且保护基团在靶细胞中经酶促从药物中除去。
在降低药物在系统中剂量的一个优选方面中，药物是病毒唑，靶细胞是感染了病毒的肝细胞，和非靶细胞是红细胞。本领域已知(见上文)，病毒唑可经代谢转化成病毒唑-磷酸盐磷酸盐，而且病毒唑-磷酸盐仍保留在红细胞中，因而显著地降低了病毒唑的浓度。甲酰胺对病毒唑的修饰是将＝NH保护基团共价偶合到甲酰胺碳上，取代了甲酰胺中羰基氧。业已发现(见下文)，经＝NH保护基团修饰的病毒唑在红细胞中的代谢转化显著降低。修饰的病毒唑对人的施用剂量优选为单剂量口服50mg-300mg。
作为抗病毒药物，病毒唑已知可经口给人施用至少一个单剂量(约600-1200mg)。系统(例如人)中病毒唑的起始浓度约为1μM至几百μM之间，然而，系统中的病毒唑会由于在红细胞中的磷酸化作用而螯合到红细胞中，病毒唑的浓度会在24小时之内降低到起始浓度的约85-50％。本发明人发现，将病毒唑修饰成1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲脒，可显著地降低病毒唑磷酸化的数量(见下文)。因此，全部或者几乎所有起始浓度的病毒唑均可在靶细胞中发挥所需的药理学效力。因此，经保护基团修饰的病毒唑可使病毒唑的剂量减少约5wt％、优选约10wt％、更优选25wt％和最优选50wt％。
然而，可以理解的是，也可采用除600mg-1200mg以外的多种剂量(包括200mg-600mg、20mg-200mg和更低剂量)。例如，当病毒唑用作免疫调节药物时，约100mg-300mg的较低剂量即是足够的。另一个方面中，当需要相对较高浓度的药物时，可采用600mg-1800mg和更高的剂量。可以理解的是，根据特定的代谢转化，剂量的减少也可有较大的变化。例如，当代谢转化相对较快并且在多数非靶细胞中发生时，剂量可减少25wt％-80wt％和更高。另一方面，当代谢转化相对较慢时，剂量可减少25wt％-5wt％和更低。
至于在降低药物剂量的方法中所涉及的药物、保护基团、代谢转化、药物修饰的步骤、系统、施用药物步骤、靶细胞和非靶细胞，也需进行上述考虑。
实施例(a)如附图2所示病毒唑的示例性合成，方法如下所示。
甲基1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-3-羧酸酯(3)和甲基1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-5-羧酸酯(4)将甲基-1，2，4-三唑-3-羧酸盐(25.4g，200mmol)(1)、1，2，3，5-四-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖(63.66g，200mmol)(2)和双(对硝基苯基)磷酸酯(1g)的混合物置于RB烧瓶(500mL)中。将烧瓶置于165-175℃的预热油浴中，在水抽真空下搅拌25分钟。在置于抽吸器与RB烧瓶间的冰冷收集器收集置换出的乙酸。从油浴中取下烧瓶并冷却。当烧瓶温度约为60-70℃时，引入EtOAc(300mL)和饱和NaHCO3(150mL)，并用EtOAc提取。水层再用EtOAc(200mL)提取。合并的EtOAc提取物用饱和NaHCO3(300mL)、水(200mL)和盐水(150mL)洗涤。有机提取物用无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发滤液至干燥。残渣溶于乙醇(100mL)，并用0℃冷却12小时的甲醇(60mL)稀释，得到无色晶体。过滤固体，并用最小量的冷乙醇(20mL)洗涤，在高真空下用固体NaOH干燥得到60g(78％)。滤液蒸发至干燥，在二氧化硅柱上纯化，以CHCl3→EtOAc(9∶1)为洗脱液。从滤液中分离出两种产物约8.5g(11％)的快速移动产物和约5g(6.5％)的缓慢移动产物。缓慢移动产物为结晶产物。快速移动产物为4，为泡沫物。
3的合并收率65g(84％)；mp 108-110℃；3的1H NMR(CDCl3)δ2.11(s，3H，COCH3)，2.12(s，3H，COCH3)，2.13(s，3H，OCH3)，3.99(s，3H，COCH3)，4.22(dd，1H)，4.46(m，2H)，5.55(t，1H，J＝6.0Hz)，5.75(m，1H)，6.05(d，1H，C1，H J＝3.6Hz)和8.41(s，1H，C5H)。分析(C15H19N3O9)C，H，N。4的1H NMR(CDCl3)δ2.02(s，3H，COCH3)，2.10(s，3H，COCH3)，2.12(s，3H，OCH3)，4.00(s，3H，COCH3)，4.14(m，1H)，4.42(m，2H)，5.76(t，1H)，5.81(m，1H)，6.94(d，1H，C1′，H J＝2.1Hz)，8.03(s，1H，C5H)。分析(C15H19N3O9)C，H，N。
1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺(5)将甲基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-3-羧酸盐(62g，161mmol)(3)置于钢制反应釜中，并于0℃用新鲜制备好的甲醇氨(350mL，干燥氨气于0℃通过干燥甲醇直至饱和制得)处理。闭合钢制反应釜并在室温下搅拌18小时。将钢制反应釜冷却0℃，打开并将内容物蒸发至干燥。残渣用干燥乙醇(100mL)处理并蒸发至干燥。获得的残渣用丙酮研磨得到固体，过滤并用丙酮洗涤。固体在室温下干燥过夜，并溶于热乙醇(600mL)与水(10mL)的混合物中。在加热板上加热并搅拌，将乙醇溶液的体积降至150mL。冷却热的乙醇溶液，得到无色晶体，然后过滤并用丙酮洗涤，真空下干燥。对滤液进一步浓缩得到另外的物质。总收率35g(89％)；mp 177-179℃；[α]20D-35.3(c，10，H2O)；1H NMR(Me2SO-d6)δ3.46(m，1H，C5′H)，3.60(m，1H，C5′H)，3.94(m，1H，C4′H)，4.12(m，1H)，4.34(m，1H)，4.95(t，1H，C5′OH)，5.22(d，1H)，5.60(d，1H)，5.80(d，1H，J＝3.9Hz，C1′H)，7.64(bs，1H，NH2)，7.84(bs，1H，NH2)，8.87(s，1H，C5H).13C NMR(Me2SO-d6)δ61.8，70.2，74.4，86.0，91.6，144.9，157.4，160.6.Anal.(C8H12N4O5)C，H，N.
(b)附图3所示的经＝NH基团修饰的病毒唑的示例性合成，方法如下所示。
3-氰基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑(7)将3-氰基-1，2，4-三唑(18.8g，200mmol)(6)、1，2，3，5-四-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖(63.66g，200mmol)和双(对硝基苯基)磷酸酯(1g)的混合物置于RB烧瓶(500mL)中。将烧瓶置于165-175℃的预热油浴中，在水抽真空下搅拌25分钟。在水抽真空下搅拌25分钟。在置于抽吸器与RB烧瓶间的冰冷收集器收集置换出的乙酸。从油浴中取下烧瓶并冷却。当烧瓶温度约为60-70℃时，引入EtOAc(300mL)和饱和NaHCO3(150mL)，并用EtOAc提取。水层再用EtOAc(200mL)提取。合并的EtOAc提取物用饱和NaHCO3(300mL)、水(200mL)和盐水(150mL)洗涤。有机提取物用无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发滤液至干燥。残渣溶于0℃冷却12小时的醚(100mL)中，得到无色晶体。过滤固体并用最小量的冷乙醇(20mL)洗涤，在高真空下用固体NaOH干燥。收率56.4g(80％)。mp 96-97℃。1HMR(CDCl3)δ2.11(s，3H，COCH3)，2.13(s，3H，COCH3)，2.14(s，3H，COCH3)，4.22(dd，1H)，4.46(m，2H)，5.52(t，1H，J＝6.0Hz)，5.70(m，1H)，6.01(d，1H，C1’H J＝3.6Hz)和8.39(s，1H，C5H)。分析计算C14H16N4O7(352.30)C，47.73；H，4.58；N，15.90。实测C，47.70；H，4.63；N，16.01。
1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-盐酸甲脒(8)于85℃，将7(14.08g 40.0mmol)、NH4Cl(2.14g，40.0mmol)和无水氨(150ml)的混合物在钢制反应釜中加热18小时。冷却钢制反应釜，打开并将内容物蒸发至干燥从MeCN-乙醇中结晶残渣，得到10.6g(95％)8.Mp 177-179℃.1HMR(DMSO-d6)δ3.44-4.2(m，3H)，4.40(m，2H)，5.04(t，1H)，5.29(m，1H)，5.74(m，1H)，5.87(d，1H，C1’H)，8.96(bs，3H)and 9.17(s，1H，C5H).分析计算 C8H14ClN5O4(279.68)C，34.35；H，5.05；N，25.04；Cl，12.69.实测C，34.39；H，5.10；N，25.14；Cl，12.71.
采用如下方法从病毒唑开始的另一示例性路线2′，3′，5′-三-O-乙酰基-1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺(9)在室温下，将乙酸酐(200mL)和吡啶(50mL)中的1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺(28.4g，116.4mmol)(病毒唑)的悬浮液搅拌过夜。将所得到的透明溶液真空浓缩，得到澄清泡沫(43.1g，定量)。TLC上的泡沫是均质的，可不经纯化而直接用于下一步。取少量经快速色谱法纯化得到分析样品。1H NMR(300MHz)，DMSO-d6)δ2.01，2.08，2.09(3s，9H，COCH3)，4.10(m，1H)，3.52(m，2H)，5.58(t，1H)，5.66(m，1H)；6.33(d，1H，J.＝3.0Hz，C1H)，7.73，7.92，(2s，2H，CONH2)，8.86(s，1H，C5H三唑).分析.(C10H18N4O8)C，H，N.
3-氰基-2′，3′，5′-三-O-乙酰基-1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑(10)向氯仿(500mL)中9的溶液(43.1g，116.4mmol)中加入三乙胺(244mL)中，并将混合物在冰盐浴中冷却至0℃。搅拌下滴加氯氧化磷(30.7mL，330mmol)，溶液加温至室温。混合物于室温下搅拌1小时后，TLC(己烷/丙酮3∶1)显示起始物料完全消失。在真空下将褐色反应混合物浓缩至干燥，将残渣溶于氯仿(500mL)中。有机溶液用饱和水性碳酸氢钠(3×200mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并于真空下浓缩。残渣经硅胶色谱(快速色谱法)(采用己烷中的20％丙酮)，得到33.14g(病毒唑的81％)纯的10，为无定形固体。该固体在各方面与真实(authentic)样品完全相同mp 101-103℃；IR(溴化钾)v 2250(CN)，1750(C＝O)，cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ2.04，2.06，2.07(3s，9H，乙酰基甲基)，4.15(dd，1H)，4.40(m，1H)，5.47(t，1H)，5.63(dd，1H)，5.95(d，1H，J＝3.2Hz，C1H)，8.34(s，1H，C5H三唑)。
1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-盐酸甲脒(8)向甲醇(100mL)中的10(4.0g，11.4mmol)悬浮液中加入甲醇性甲醇钠的摩尔溶液(12mL)，混合物在室温下搅拌过夜。溶液用甲醇洗涤过的Dowex H+树脂酸化至pH4，过滤树脂并在真空下将滤液浓缩至干燥。残渣溶于最低量的甲醇(15mL)中，并转移至耐压瓶中。加入氯化铵(0.61g，11.4mmol)和用干燥氨气0℃饱和的甲醇溶液，密封瓶子，溶液于室温下搅拌过夜。于真空下将溶液浓缩至干燥，从乙腈/乙醇中结晶所得的残渣，得到结晶固体8(2.95g，93％)。该样品在各个方面与真实样品完全相同。
在另一可选路线中，采用微生物的培养物、微生物的完整细胞或者细胞提取物作为酶来源(在微生物的非增殖条件下)，经酶促反应可制得1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-盐酸甲脒(8)。在基于微生物的酶来源存在下，将3-氰基-1，2，4-三唑或者其盐与核糖供体接触，可制得3-氰基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑(7)。然后，化合物7经液氨溶液处理，可转化成(8)。或者，在酶存在下，1，4-三唑-3-盐酸甲脒可与核糖供体反应，而直接制得(8)。
(c)修饰的病毒唑在肝脏中脱氨基成病毒唑以每日300mg/kg的剂量经口给予小鼠3H-病毒唑和3H-(＝NH)修饰的病毒唑，重复8天后，病毒唑在肝脏中的值、最小、放射性浓度Cmin明显低于修饰的病毒唑。尤其应该指出的是，在经病毒唑处理的小鼠的肝脏放射性中，病毒唑约占90％，呋喃核糖基三唑羧酸(RTCA)约占10％。与之相反的是，在用修饰的病毒唑处理过的小鼠的肝脏放射性中，修饰的病毒唑约占3 0％，病毒唑约占70％(参见表1).
表1小鼠肝脏中的放射性
(d)病毒唑与经(＝NH)修饰病毒唑在红细胞(RBC)中的差示放射性分布病毒唑可在RBC中被磷酸化，并且进一步提出磷酸化的病毒唑是在长期或高剂量病毒唑治疗的人中观察到的溶血性贫血的致病因素。值得注意的是，经(＝NH)-修饰的病毒唑不是直接地转运至RBC中，这与体外试验结果不同(数据未给出)，因此修饰的病毒唑只是在肝脏中经脱氨基成病毒唑以后才蓄积于RBC中，随后磷酸化成相应的磷酸盐，如下面的表2所示。
小鼠以每日300mg/kg的剂量经口施用3H-病毒唑和3H-(＝NH)修饰的病毒唑，重复8天后，修饰病毒唑在RBC中的中值、最小、放射性浓度Cmin明显低于病毒唑。从表1和2所示的差异数据可知，经修饰病毒唑的治疗指数约是病毒唑的三倍，所述治疗指数为肝脏中病毒唑浓度与RBC中病毒唑浓度之间的比值。
在门静脉导管插入的猕猴中，给予口服单剂量为30mg/kg的3H病毒唑或者(＝NH)-修饰的3H病毒唑，24小时后在RBC中达到峰放射性浓度，并在其后保持稳定。3H病毒唑或者(＝NH)-修饰的3H病毒唑的峰放射性浓度的半衰期分别约为1998小时和577小时。与(＝NH)-修饰的3H病毒唑相比，给予30mg/kg的多剂量后，病毒唑的稳态放射性浓度显著较高(表2)。
表2.病毒唑与经(＝NH)修饰病毒唑在红细胞(RBC)中的差示放射性分布
表2所示的数据也与毒性研究结果一致。患有溶血性贫血的恒河猴接受60mg/kg病毒唑，然后每天接受30mg/kg(10天)，在RBC中显著减少。相反的是，接受相同剂量的经修饰病毒唑的猴子在RBC中没有表现出显著的变化。
门静脉插管的猴子经口服病毒唑或者修饰的病毒唑后，根据门静脉血浆与系统血浆的差异，测得口服修饰的病毒唑后肝脏中放射性浓度大约比口服病毒唑高50％。这样，对于修饰的病毒唑而言，仅需要病毒唑剂量的约66％，即可达到相同的病毒唑肝脏浓度。根据经修饰病毒唑的较低RBC放射性(约12％)和较高肝脏浓度(约50％)(与病毒唑相比)，可推算出经修饰病毒唑的治疗比值大约是病毒唑的12倍。因此，以约为病毒唑剂量65％的剂量施用经修饰的病毒唑，即可达到与病毒唑一样的效力，而基本上未出现溶血性贫血；或者以与病毒唑相同的剂量施用修饰的病毒唑，即可达到高于病毒唑的效力，而基本上未出现溶血性贫血。也可以为病毒唑剂量的约5％-50％、优选20％-50％、更优选10％-15％和最优选5-6％的剂量施用修饰的病毒唑，即可达到与病毒唑相同的效力。
(e)经(＝NH)修饰病毒唑体外脱氨基成病毒唑从小牛肠中分离的腺苷脱氨酶(ADA)购自Boehringer Mannheim公司。室温下(23℃)，在Dulbecco的PBS缓冲液(Na2HPO4，8mM；KH2PO4，1.5mM；KCl，2.7mM；NaCl，138mM；pH 7.2)中进行分析。测定(＝NH)修饰的病毒唑和病毒唑(0.2mM)的紫外吸收光谱，利用它们在240nm处的吸收差异，可测得经(＝NH)修饰病毒唑水解脱氨形成的病毒唑。在没有酶的情况下，经(＝NH)修饰的病毒唑在缓冲液(pH7.2)中1.5小时未观察到自发水解(数据未给出)，这表明化合物很稳定。鉴于UV测定法的局限，viramidine的自发水解小于2.5×10-5min-1。另外的实验表明，向缓冲剂加入锌离子并不能提高自发水解速率(数据未给出)。 在0.2μM的ADA存在下，加速了经(＝NH)修饰病毒唑的脱氨基作用。在现行分析条件下测定酶周转(turnover)约为2.5分钟-1。对酶反应产物的四极质谱分析表明，0.2mM的经(＝NH)修饰病毒唑与0.5μM的ADA培养过夜后，超过75％的经(＝NH)修饰病毒唑转化成病毒唑。
这样，即公开了特定实施方案及其在提高治疗疾病的特异性中的应用。然而，对本领域技术人员显而易见的是，可对在此描述的内容作出并不偏离本发明原理的改进。因此，本发明主题将体现于下述权利要求书的精神范畴内。此外，在阐述说明书和权利要求的过程中，所有术语应该以与上下文一致的尽可能宽的方式加以解释。具体地说，术语“包括”和“包含”应以非排他性方式解释为单元(element)、组成或步骤，所述单元、组成或步骤可与其他未特指的单元、组成或步骤一起存在、利用或组合。
权利要求
1.提高药物药理学作用的选择性的方法，包括确定对靶细胞具有所需药理学作用的药物；用保护基团修饰药物，其中保护基团通过保护基团上的氮原子与药物共价偶合；和其中保护基团降低了药物在非靶细胞中的蓄积，和其中保护基团经酶促在靶细胞中与药物分开。
2.如权利要求1的方法，其中药物选自核苷酸、核苷、核苷酸类似物和核苷类似物。
3.如权利要求2的方法，其中药物是1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺或者2-β-D-呋喃核糖基-4-噻唑甲酰胺。
4.如权利要求1的方法，其中保护基团包括至少一种伯胺和仲胺。
5.如权利要求1的方法，其中保护基团是＝NH。
6.如权利要求1的方法，其中靶细胞是肝细胞。
7.如权利要求1的方法，其中靶细胞感染了病毒。
8.如权利要求1的方法，其中靶细胞是过增殖性细胞。
9.如权利要求1的方法，其中药物在非靶细胞中的蓄积包括药物在非靶细胞中的磷酸化作用。
10.如权利要求1的方法，其中非靶细胞是红细胞。
11.如权利要求1的方法，其中保护基团从药物上的酶催化消除是经氨基水解酶催化的。
12.降低药物对非靶细胞的细胞毒性的方法，包括认知到药物在非靶细胞中的代谢转化对非靶细胞造成损害；用保护基团修饰药物，其中保护基团通过保护基团上的氮原子与药物共价偶合，和其中保护基团减少了药物在非靶细胞中的代谢转化，和保护基团经酶促在靶细胞中与药物分开；和将药物给予包括靶细胞和非靶细胞的系统，其中保护基团与药物共价偶合。
13.如权利要求12的方法，其中药物是1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺，其中代谢转化包括药物的磷酸化作用。
14.如权利要求12的方法，其中非靶细胞是红细胞。
15.如权利要求12的方法，其中保护基团是＝NH。
16.如权利要求12的方法，其中所述损害包括抑制肌苷-5’-单磷酸盐脱氢酶。
17.降低药物在包括靶细胞和非靶细胞的系统中剂量的方法，包括提供药物，其中所述药物在非靶细胞中的代谢转化降低了药物在包括靶细胞和非靶细胞的系统中的浓度；用保护基团修饰药物，其中保护基团通过保护基团上的氮原子与药物共价偶合，和其中保护基团减少了药物在非靶细胞中的代谢转化；和将药物给予包括靶细胞和非靶细胞的系统，其中保护基团与药物共价偶合，和保护基团经酶促在靶细胞中与药物分开。
18.如权利要求17的方法，其中所述系统包括哺乳动物。
19.如权利要求17的方法，其中所述药物是1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺和保护基团是＝NH。
全文摘要
本发明公开了经保护基团修饰的药物，其中保护基团通过保护基团上的氮原子与药物共价偶合。经修饰药物中的保护基团能阻止药物在非靶细胞中的代谢转化和螯合，所述保护基团可经酶促在靶细胞中药物分离。本发明化合物和方法的优点包括通过抑制转化成可能具有细胞毒素性的代谢产物而减少了细胞毒性，通过减少螯合到非靶细胞中而减少了药物的剂量，并提高所述药物的选择性。
文档编号C07H19/052GK1460109SQ00819838
公开日2003年12月3日 申请日期2000年12月7日 优先权日2000年8月22日
发明者J·劳, Z·洪, C·-C·林 申请人:里巴药品公司