专利名称：呋喃丹半抗原、抗原和抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及杂环化合物及其制备方法，尤其涉及一种呋喃丹半抗原、抗原和抗体及其制备方法。
农药及其代谢产物传统的残留分析方法主要是依靠气相色谱(GC)，液相色谱(HPLC)或质谱等物化分析手段，但由于农药使用规模不断扩大，农药残留造成环境影响和对人类健康的慢性和长期效应日益受到人们关注和担忧，对农药残留的限制也因此越来越严格，对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面都提出了新的要求和更高的标准，但传统的理化分析方法通常繁琐复杂，样品前处理过程复杂、工作量大、仪器昂贵、要求有熟练的技术人员及较长的分析周期。因此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及价廉的检测技术能在野外和实验室内进行大批量的筛选试验。免疫分析法正具备这些优点，所以尽管免疫分析应用于农药残留分析的时间很短，但已很快用于环境样品和食品中农药残留的分析。
1958年Berson S.A和Yallow创立了放射免疫分析法(RIA)，并首先在生物医学和临床药物定量测定得到广泛应用。由于农药残留分析对象的复杂性，直到八十年代免疫分析才被逐渐应用于这一领域，免疫分析技术可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度，并且，快速、简便，适于检测生物大分子，也可以检测复杂样本中小分子如农药等痕量组分。
第一个农药免疫分析的报道是1967年Centen等人制备的农药马拉硫磷的抗血清，通过抗原抗体沉淀反应，证明了抗血清与马拉硫磷的可反应性。从1967年到70年代末的10余年间，由于技术上的局限，尽管已开发出了几个农药的免疫分析方法，但仍未受到普遍重视，发展相当缓慢。进入80年代以来，由于人们对分析方法的选择性和灵敏度的要求越来越高，同时对分析对象的种类和环境样品的数量要求也在不断增加，具有高度特异性、灵敏性、快速性的免疫检测技术在农药分析领域得到了较快的发展。进入90年代以来，农药的免疫检测技术发展迅速，到目前为止，已有60多种农药开发了免疫检测技术，其中除草剂和杀虫剂较多，杀菌剂较少。国内这方面的研究也渐渐起步，已有关于对硫磷、三唑酮、禾大壮、甲胺磷、莠去津均三氮苯类等农药的半抗原合成的报道。
呋喃丹(Carbofuran，2，3，-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯)自1969年由FMC公司和Mobay化学公司开发生产后即作为一种高效、广谱的杀虫、杀线虫剂，在世界范围内广泛应用于粮食、蔬菜、水果及经济作物等害虫的防治。但是由于呋喃丹的毒性大，在酸性土壤中不易降解，极易污染土壤和地下水源。近年来，由于呋喃丹造成的环境生物毒害，屡见不鲜。尤其是在作物和蔬菜上的大量使用，形成农药残留，对人体健康造成极大的危害，这已引起人们的关注。因此开发一种简单、快速，适于农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。
检测呋喃丹残留量常规方法有气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。由于呋喃丹在通常气相色谱条件下易分解成酚类，用GC分析易产生较大误差，当然这个问题可通过改变操作条件或将农药衍生化来解决。目前指定的检测N-甲基氨基甲酸酯类农药的较灵敏的方法是用带荧光检测器的HPLC柱后衍生化法。然而这些方法的灵敏度受样品的净化，浓缩，衍生化等步骤的影响很大；再者这些方法需要大多数实验室所不具备的复杂的仪器，且过程繁琐，不适合大批量样品的检测与分析。免疫分析为呋喃丹残留研究提供了一个新的分析检测途径。
本发明的目的是提供一种特异性、灵敏度、准确度高，精确度好、操作方法简单快速的呋喃丹半抗原、抗原和抗体及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明采取下列措施呋喃丹半抗原的分子结构为 n为从1至20的任意自然数呋喃丹抗原的分子结构为 呋喃丹抗体是能与呋喃丹发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
一种呋喃丹半抗原的制备方法的步骤为1)呋喃酚1份溶解在1～4份甲苯中，通入光气1～2份，加氢氧化钠至溶液呈碱性，反应温度为-10～10℃，反应得到一混合物；2)将上述混合物进行液-液分配，然后经减压浓缩得呋喃酚和产物的油状混合物，此油状混合物待冷却后析出一无色结晶，即为2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯；3)将1份2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯与1～2份氨基丁酸或氨基己酸在碱性二噁烷溶液中反应可得4-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸(BFNB)或6-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸(BFNH)。
另一种呋喃丹半抗原的制备方法的步骤为1)呋喃酚1份溶解在4～9份甲苯中，恒量通入光气，加入催化剂，反应温度为80～150℃，反应得到一混合物；2)将上述混合物进行液-液分配，然后经减压浓缩得呋喃酚和产物的油状混合物，此油状混合物待冷却后析出一无色结晶，即为2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯；3)将1份2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯与1～2份氨基丁酸或氨基己酸在碱性二噁烷溶液中反应可得4-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基](BFNB)或丁酸6-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸(BFNH)。
在呋喃丹残留检测技术上采用本发明能使农药残留分析在方法上获得更大的生命力。将半抗原与蛋白质偶联制备成免疫原后免疫动物，可得到呋喃丹特异性抗体，利用抗原抗体免疫反应和酶促反应或同位素标记可建立的酶联免疫分析法和放射免疫分析法。在检测样品中呋喃丹残留时具有很高的特异性和灵敏度，最低检测限可达到0.005ppm，准确度高，回收率可达96.12％，精确度好，批内变异系数CV％＝7.32％，批间系数CV％＝10.90％，同时操作方法简单快速，不需要复杂的前处理过程，一次可同时检测大批样品、成本低廉，对操作人员的要求低，通过简单的培训即可进行操作。这项技术对快速分析缺乏检测活性或样本基质过于复杂，因而用普通理化方法难以分析的农药残留，具有相当的应用价值。因此，可快速准确地分析检测呋喃丹在样本中的残留量，便于进行大量样品的检测和现场样品分析。
下面结合实施例对本发明作详细说明。
实施例1呋喃丹半抗原(n＝3)的冷法制备方法的步骤为
1)在120ml甲苯中，通入光气75克，然后加入呋喃酚63克进行反应，同时缓慢加入氢氧化钠至溶液呈微碱性，停止反应，得到一混合物，反应温度为-8℃；2)将上述混合物进行液液分配，去除光气，然后减压浓缩得呋喃酚和产物的油状混合物，此油状混合物待冷却后析出一无色结晶，这种物质为2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯；3)将5克2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯与8克氨基丁酸在含有氢氧化钠的二噁烷溶液中反应可得4-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸，1H HMR(acetone-ds)δ1.43(s，6H，CH3)，1.86(m，2H，CH2)，2.42(t，2H，CH2COOH)，3.05(s，2H，CH2)，3.26(q，2H，CH2-NH)，6.72-6.99(m，3H，aromatic)。
2)4周后用生理盐水将抗原稀释到所需浓度，再与等体积的弗式不完全佐剂与其完全乳化，用皮下多点注射法进行加强免疫免疫。
3)2周后生理盐水将抗原稀释到所需浓度，再与等体积的弗式不完全佐剂与其完全乳化，用皮下多点注射法进行再次加强免疫免疫，并在免疫后第8天测抗体效价。
4)此后每隔2周进行加强免疫，一直到抗体的效价达到要求为止，兔颈动脉采全血，分离血清，纯化后即得抗体。
权利要求
1.一种呋喃丹半抗原，其特征在于分子结构为 n为从1至20的任意自然数
2.一种呋喃丹抗原，其特征在于分子结构为
3.一种呋喃丹抗体，其特征在于它是能与呋喃丹发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
4.一种呋喃丹半抗原的制备方法，其特征在于它的步骤为1)呋喃酚1份溶解在1～4份甲苯中，通入光气1～2份，加氢氧化钠至溶液呈碱性，反应温度为-10～10℃，反应得到一混合物；2)将上述混合物进行液-液分配，然后经减压浓缩得呋喃酚和产物的油状混合物，此油状混合物待冷却后析出一无色结晶，即为2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯；3)将1份2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯与1～2份氨基丁酸或氨基己酸在碱性二噁烷溶液中反应可得4-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸或6-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸。
5.一种呋喃丹半抗原的制备方法，其特征在于它的步骤为1)呋喃酚1份溶解在4～9份甲苯中，恒量通入光气，加入催化剂，反应温度为80～150℃，反应得到一混合物；2)将上述混合物进行液-液分配，然后经减压浓缩得呋喃酚和产物的油状混合物，此油状混合物待冷却后析出一无色结晶，即为2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯；3)将1份2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氯甲酸酯与1～2份氨基丁酸或氨基己酸在碱性二噁烷溶液中反应可得4-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]或丁酸6-[[(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]己酸。
全文摘要
本发明公开了一种呋喃丹半抗原。它的分子结构如式:n为从1至20的任意自然数。方法为呋喃酚溶解在甲苯中,通入光气,反应得到中间体,将中间体与氨基丁酸或氨基己酸在碱性二噁烷溶液中反应可得半抗原BFNB或BFNH,将半抗原与蛋白质偶联得免疫原,免疫原免疫动物后可制得能与呋喃丹特异性反应的抗体。本发明具有特异性、灵敏度、准确度高,精确度好、操作简单快速等优点。
文档编号C07D307/86GK1384103SQ01117639
公开日2002年12月11日 申请日期2001年4月30日 优先权日2001年4月30日
发明者朱国念, 吴银良, 程敬丽, 胡秀卿, 杨挺 申请人:浙江大学