专利名称：咔唑类生物碱衍生物及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的咔唑生物碱类衍生物或其盐，其制备方法及该类化合物在制备细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂中的应用。
背景技术：
咔唑生物碱类化合物已有一些报道，如文献Tian-Shung Wu，et al，Carbazole alkaloidsfrom Clausena excavata and their biological activityPhytochemistry，Vol.43.No.1.pp133-140，1996及文献A.Chakraborty，et al，Carbazole alkaloid with antimicrobial activityfrom Clausena heptaphyllaPhytochemistry，Vol.38 No.3.pp787-789，1995。天然咔唑类生物碱多来源于芸香科(Rutaceae)黄皮属(Clausena)植物。该属植物主要化学成分为咔唑类生物碱和香豆素类化合物。同属植物黑果黄皮Clausena dunniana Levl在我国局部地区民间用于治疗癌症，但其化学成分特别是有关该植物抗癌活性成分的研究至今未见报道。
发明内容
本发明从黑果黄皮中分离出三种结构类型的新咔唑生物碱类衍生物，它们具有细胞周期抑制和细胞凋亡诱导作用，这些咔唑类生物碱衍生物或它们的盐可用于制备细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂。
本发明的新咔唑类生物碱衍生物包括式(I)简单取代咔唑和式(II)、(III)咔唑二量体，其化学结构如下 其中， R1是氢、烷氧基或羟基；R2是烷氧基、烷氧烷基或酰基；R3是氢或烷氧基；R4是氢或烃基；优选的式(I)中，R1是氢、甲氧基或羟基；R2是甲氧甲基或甲酰基；R3是氢或甲氧基；R4是氢或二甲基烯丙基。
上述化合物的制备方法是用乙醇或含水乙醇溶液提取黑果黄皮干燥的茎皮或枝叶，得粗浸膏，用有机溶剂萃取所得粗浸膏，得到提取物。将上述有机溶剂提取物经反复的硅胶和Sephadex LH-20柱层析、反复的制备硅胶薄层层析、反相制备HPLC和重结晶等分离纯化操作，分离出浸膏中的各个活性成分，得到新的咔唑生物碱类活性单体。
本发明采用流式细胞术并配以细胞显微形态特征观察和荧光显微细胞核形态特征观察等方法，以对tsFT210小鼠乳腺癌细胞的细胞周期抑制、细胞凋亡诱导以及对该癌细胞的直接杀伤作用为主要指标进行了抗癌活性的筛选和测试工作。
本发明的新咔唑生物碱类的生物学作用特征是或者抑制癌细胞的细胞周期周转，或者诱导癌细胞发生凋亡，或者直接杀伤癌细胞，并由此发挥抗癌作用。
本发明的咔唑类生物碱中加入药物可接受的酸可制成盐。在本发明的咔唑类生物碱衍生物或其盐中加入药物可接受的辅料可制成抗癌药物、细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂。
图1是化合物1在甲醇中的紫外光谱，图2是化合物1的红外光谱(KBr)，图3是化合物1在氘代丙酮中的1H核磁共振谱，图4是化合物1在氘代丙酮中的13C核磁共振谱；图5是化合物2在甲醇中的紫外光谱，图6是化合物2的红外光谱(KBr)，图7是化合物2在氘代丙酮中的1H核磁共振谱，图8是化合物2在氘代丙酮中的13C核磁共振谱；图9是化合物3在甲醇中的紫外光谱，图10是化合物3的红外光谱(KBr)，图11是化合物3在氘代丙酮中的1H核磁共振谱，图12是化合物3在氘代丙酮中的13C核磁共振谱；图13是化合物4在甲醇中的紫外光谱，图14是化合物4的红外光谱(KBr)，图15是化合物4在氘代丙酮中的1H核磁共振谱，图16是化合物4在氘代丙酮中的13C核磁共振谱；图17是化合物5在甲醇中的紫外光谱，图18是化合物5的红外光谱(KBr)，图19是化合物5在氘代丙酮中的1H核磁共振谱，图20是化合物5在氘代丙酮中的13C核磁共振谱；图21是化合物6在甲醇中的紫外光谱，图22是化合物6的红外光谱(KBr)，图23是化合物6在氘代二甲基亚砜中的1H核磁共振谱，图24是化合物6在氘代二甲基亚砜中的13C核磁共振谱。
具体实施例方式
实施例1 黑果黄皮茎皮中咔唑生物碱的分离制备1.粗提浸膏及氯仿萃取物的制备黑果黄皮茎皮的干燥碎块5公斤用70％的乙醇回流提取，每次15L回流4小时，共提取三次。合并提取液、减压浓缩、真空干燥得粗提浸膏300克。
取该浸膏280克分散于2L蒸馏水中，依次用等体积的石油醚和氯仿分别萃取三次。萃取液分别浓缩干燥，得到有活性的氯仿萃取物30克。
2.氯仿萃取物中活性成分的分离氯仿萃取物30克经35克硅胶G拌样后，用300克硅胶60H干法上减压柱，以石油醚/乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱分段，得到24个流份。以终浓度为50μg/ml测试各流份活性，结合薄层检查结果，合并为B(5.0g)、C(4.0g)、D(0.65g)和E(1.35g)四个活性组份及A(1.0g)、F(17g)两个无活性组份。D、E部位分别上Sephadex LH-20柱层析分离，各流份根据活性测试和薄层检查结果合并为11个组份，Fr.1(80mg)，Fr.2(90mg)，Fr.3(170mg)，Fr.4(160mg)，Fr.5(140mg)，Fr.6(70mg)，Fr.7(170mg)，Fr.8(120mg)，Fr.9(130mg)，Fr.10(160mg)，Fr.11(500mg).
Fr.1(80mg)溶于甲醇中上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱得到化合物1(1.5mg)；Fr.2(90mg)经制备硅胶TLC分离[正己烷-丙酮(97∶3)展开]，得化合物2(3.2mg)；Fr.5(140mg)经Sephadex LH-20柱层析(甲醇洗脱)分离，纯化得化合物3(2.7mg)；Fr.6(70mg)经ODS制备HPLC[甲醇-水(7∶3)洗脱]分离纯化得化合物4(2.2mg)；Fr.8(120mg)经ODS制备HPLC[甲醇-水(7∶3)洗脱]分离纯化，得化合物5(9.0mg)。
黑果黄皮茎皮中分离制备的咔唑类生物碱衍生物的化学结构如下所示。
1R1＝R3＝R4＝H，R2＝CH2OCH32R1＝OCH3，R2＝CH2OCH3，R3＝R4＝H3R1＝OH，R2＝CHO，R3＝OCH3，R4＝H4R1＝OH，R2＝CHO，R3＝OCH3，R4＝CH2CH＝C(CH3)2黑果黄皮茎皮中分离制备的咔唑类生物碱衍生物的化学结构化合物1为淡红色棱晶，熔点182～183℃，与Dragendorff试剂反应呈阳性，分子式为C14H13NO，ESI-MS m/z212[M＋H]+，HR-EI-MS m/z(M+)实测值211.0990(计算值211.0992)。UV λmaxnm(logε)in MeOH338(3.71)，324(3.80)，295(4.45)，259(4.64)，236(4.92).IR νmaxcm-1(KBr)3289(NH)，2924，2853(CH3)，1609，1498(苯环)，1454，1245，1092，812。1H NMRδin CD3COCD310.32 brs(NH)，8.11d(J＝7.0Hz，5-H)，8.06 d (J＝1.0Hz，4-H)，7.49d(J＝7.0Hz，8-H)，7.47d(J＝7.0Hz，1-H)，7.37d(7.0Hz，2-H)，7.35 dd(J＝7.0，7.0Hz，7-H)，7.16dd(J＝7.0，7.0Hz，6-H)，4.56s(2H，CH2OCH3)，3.33s(3H，CH2OCH3)。13CNMRδin CD3COCD3139.9(C-8a)，137.8(C-9a)，128.8(C-3)，127.2(C-7)，125.7(C-4a)，123.6(C-4a)，123.3(C-4b)，120.2(C-5)，120.2(C-4)，119.3(C-6)，110.6(C-8)，110.2(C-1)，75.6(CH2OCH3)，57.5(CH2OCH3)。
化合物2棕色油状物，与Dragendorff试剂反应呈阳性，分子式为C15H15NO2，ESI-MSm/z242[M＋H]+，HR-EI-MS m/z(M+)实测值241.1102(计算值241.1103)。UV λmaxnm(logε)in MeOH324(3.82)，290(4.22)，259(4.61)，252(4.61)，241(4.90)，226(4.76).IR νmaxcm-1(KBr)3415，3285(NH)，2934，2849(CH3)，1588，1503(苯环)，1453，1231，847.1H NMRδinCD3COCD310.21 brs(NH)，7.94d(J＝7.0Hz，5-H)，7.53d(J＝1.0Hz，4-H)，7.43d(＝7.0Hz，8-H)，7.24 dd(J＝7.0，7.0Hz，7-H)，7.03dd(J＝7.0，7.0Hz，6-H)，6.84d(J＝1.0Hz，2-H)，4.43s(2H，CH2OCH3)，3.87s(3H，OCH3)，3.21s(3H，CH2OCH3)。13CNMRδin CD3COCD3145.9(C-1)，140.2(C-8a)，130.1(C-3)，129.6(C-9a)，125.3(C-7)，123.7(C-4a)，123.4(C-4b)，120.1(C-5)，118.8(C-6)，112.1(C-4)，111.4(C-8)，106.2(C-2)，75.1(CH2OCH3)，56.8(CH2OCH3)，55.0(OCH3).
化合物3淡黄色无定型粉末，与Dmgendorff试剂反应呈阳性，分子式为C14H11NO3，ESI-MS m/z242[M＋H]+，HR-EI-MS(M+)实测值241.0735(计算值241.0733)。UV λmaxnm(logε)in MeOH340(4.44)，285(4.84)，242(4.85)，203(4.64).IR νmaxcm-1(KBr)3409(NH & OH)，2927，2841(CH3)，1671，1655(C＝O)，1618，1581(苯环)，1491，1347，1158.1HNMR δin CD3COCD310.65 brs(NH)，9.97s(CHO)，8.13d(J＝1.5Hz，4-H)，8.04d(J＝7.5Hz，5-H)，7.35d(J＝1.5Hz，2-H)，7.14d(J＝2.0Hz，8-H)，6.88dd(J＝7.5，2.0Hz，6-H)，3.88s(3H，OCH3).13CNMR δin CD3COCD3191.9(CHO)，160.6(C-7)，144.1(C-1)，142.8(C-8a)，134.6(C-9a)，131.3(C-3)，125.4(C-4a)，122.0(C-5)，118.2(C-4b)，118.1(C-4)，110.1(C-6)，107.8(C-2)，96.1(C-8)，55.8(OCH3).
化合物4淡黄色棱晶，熔点197-198℃，与Dragendorff试剂反应呈阳性，分子式为C19H19NO3，ESI-MS m/z310[M＋H]+，HR-EI-MS(M+)实测值309.1365(计算值309.1365)。UV λmaxBn(logε)in MeOH343(4.41)，288(4.78)，254(4.63)，243(4.79).IR νmaxcm-1(KBr)3433，3318 (NH & OH)，2929，2837(CH3)，1667(C＝O)，1618，1578(苯环)，1486，1241，791.1H NMR δin CD3COCD310.05 brs(NH)，9.85s(CHO)，8.01d(J＝1.5Hz 4-H)，7.86d(J＝7.0Hz，5-H)，7.22d(J＝1.5Hz，2-H)，6.89d(J＝7.0Hz，6-H)，5.21d(J＝5.5Hz，11-H)，3.61d(J＝5.5Hz，2H，10-H2)，3.81s(3H，OCH3)，1.71s(3H，13-H3)，1.54s(3H，14-H3).13CNMR δinCD3COCD3191.8(CHO)，157.3(C-7)，144.1(C-1)，141.5(C-8a)，135.0(C-9a)，132.2(C-12)，131.2(C-3)，126.0(C-4a)，123.5(C-11)，119.4(C-5)，119.0(C-4b)，118.0(C-4)，113.4(C-8)，108.3(C-2)，106.5(C-6)，56.8(OCH3)，25.8(C-14)，24.4(C-10)，18.0(C-13).
化合物5棕色无定型粉末，与Dragendorff试剂反应呈阳性，分子式为C26H18N2O3，ESI-MS m/z407[M＋H]+，HR-EI-MS m/z(M+)实测值406.1304(计算值406.1311).UV λmaxnm(logε)in MeOH345(4.28)，332(4.27)，292(4.62)，245(5.1 5)，225(5.26).IR vmaxcm-1(KBr)3388(NH & OH)，2921，2858(CH3)，1638(C＝O)，1589，1536(苯环)，1469，1396，1230，747.1H NMRδin CD3COCD311.5 brs(OH)，8.16d(J＝7.0Hz，5-H)，7.28 dd(J＝7.0，6.0Hz，6-H)，7.34 dd(J＝6.0，7.0Hz，7-H)，7.56d(J＝7.0Hz，8-H)，1.74s(3H，3-CH3)，6.77s(4’-H)，7.63d(J＝7.0Hz，5’-H)，6.79dd(J＝7.0，6.5Hz，6’-H)，7.14dd(J＝6.5，7.0Hz，7’-H)，7.41d(J＝7.0 Hz，8’-H)，2.10s(3H，3’-CH3).13CNMR δin CD3COCD3184.0(C-4)，180.0(C-1)，146.4(C-3)，143.5(C-1’)，143.0(C-2)，141.3(C-8a’)，138.8(C-8a)，137.1(C-9a)，129.0(C-9a’)，128.9(C-7’)，127.6(C-3’)，127.3(C-7)，125.1(C-4b)，124.6(C-6)，123.8(C-4b’)，123.3(C-4a’)，123.2(C-5)，121.6(C-5’)，119.6(C-6’)，119.4(C-2’)，117.3(C-4a)，114.4(C-8)，113.2(C-4’)，112.2(C-8’)，19.2(3’-CH3)，13.5(3-CH3).
实施例2黑果黄皮枝叶中咔唑生物碱的分离制备(化合物6的制备)1.浸膏的提取制备取4公斤黑果黄皮的干燥枝叶，用95％的医用乙醇室温浸提，每次20 L，浸提七天，共提取三次。合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得粗浸膏280克。
取枝叶提取物250克经300克硅胶G拌样，用1000克硅胶60H干法上减压柱，以石油醚/乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱分段，得到40个流份。以终浓度为50μg/ml测试各流份的活性，并结合薄层检查结果，合并为B(15g)、C(30g)、E(15g)和F(20g)四个有活性部位及A(10g)、D(20g)和G(50g)三个无活性部位。
2.化合物6的分离制备取F部位10克，上ODS柱，用甲醇-水(8∶2)洗脱，得两个活性组份，后洗脱下来的活性组份上Sephadex LH-20柱，用甲醇洗脱，得化合物6粗品，经制备HPLC[ODS，MeOH-H2O(8∶2)为流动相]]精制，得到化合物6纯品150mg。黑果黄皮枝叶中分离制备的咔唑生物碱化合物6的化学结构如下 黑果黄皮枝叶中分离制备的咔唑生物碱化合物6的化学结构化合物6为棕色无定型粉末，与Dragendorff试剂反应呈阳性，分子式C38H36N2O6，ESI-MS m/z617[M＋H]+，HR-EI-MS(M+)实测值616.2574(计算值616.2573).UVλmaxnm(logε)in MeOH344(4.78)，300(5.10)，225(5.30).IR νmaxcm-1(KBr)3500，3465(NH &OH)，2972，2934，2854(CH3)，1642(C＝C)，1610，1459(苯环)，1284，1202，748.1H NMR δinDMSO-d69.82 brs(2H，N-H&N’-H)，7.99 brs(2H，7，7’-OH)，7.61s(2H，4，4’-H)，7.55s(2H，5，5’-H)，7.05d(2H，J＝9.5 Hz，10，10’-H)，5.56d(2H，J＝9.5 Hz，11，11’-H)，3.93s(6H，8，8’OCH3)，1.36s(6H，13，13’CH3)，1.35s(6H，14，14’-CH3)。13CNMR δin DMSO-d6147.2(C-2，2’)，143.3(C-7，7’)，142.6(C-8，8’)，134.9(C-8a，8a’)，134.7(C-9a，9a’)，127.7(C-11，11’)，119.4(C-4，4’)，119.1(C-10，10’)，117.5(C-4a，4a’)，115.4(C-3，3’)，113.6(C-4b，4b’)，104.9(C-6，6’)，104.5(C-1，1’)，101.2(C-5，5’)，74.8(C-12，12’)，56.4(8，8’-OCH3)，27.4(C-13，13’)，27.0(C-14，14’)，15.9(3，3’-CH3).
实施例3细胞周期抑制及细胞凋亡诱导活性测试1.实验样品及实验方法实验样品为3-methoxymethylcarbazole(1)，Clausine-X(2)，Clausine-Y(3)，Clausine-Z(4)，Clausenamine-B(5)和Bikoenigine(6)，分别用甲醇配制成所需浓度的溶液，供用。
温敏型小鼠乳腺癌tsFT210细胞用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在32℃、通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。活性测试时，取对数生长期的tsFT210细胞，用新鲜的培养基配制成密度为2×105cells/ml的细胞悬液，分别按0.5ml/well加至24孔板中，每孔加入5μl不同浓度的样品甲醇溶液，32℃下培养17h。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，然后将细胞分别从24孔板转移至1.5ml Eppendorf离心管中，4℃下3000rpm离心3min，吸去上清液，加0.5μl磷酸缓冲溶液震荡洗涤一次，相同条件下收集细胞，加150μl碘化丙啶(PI)水溶液(5mg PI，100mg Sodium citrate and 200mg NP-40in 100mlH2O)，4℃下染色30min后，用流式细胞仪分析测定细胞中DNA的含量分布。另外，必要时取药物处理后的细胞，用Hoechst 33258荧光试剂将细胞染色，在荧光显微镜下观察细胞核染色质的形态学特征变化，判断有无细胞凋亡的形态学特征或细胞周期是被抑制在G2期还是在M期。
2.实验结果在光学显微镜下观察到用本发明的各种咔唑类生物碱衍生物处理后，tsFT210癌细胞呈各种不同的典型的形态学变化，细胞周期被抑制在G2/M期的细胞均匀变大而且形态饱满；被诱导凋亡的细胞发生皱缩、出芽或形成凋亡小体；药物有细胞毒作用时，细胞膨大、形成不透光的黑色囊泡，呈现坏死细胞的典型形态特征。结合上述形态学观察结果，用流式细胞术测定并经Wincycle软件分析得到的有关结果归纳如下表。化合物1～6对tsFT210细胞的最低有效浓度(MIC)
上述结果表明，受试化合物具有细胞周期抑制、细胞凋亡诱导及对癌细胞的直接杀伤作用。
权利要求
1.下述咔唑类生物碱衍生物 其中，R1是氢、烷氧基或羟基；R2是烷氧基、烷氧烷基或酰基；R3是氢或烷氧基；R4是氢或烃基；
2.权利要求1所述的咔唑类生物碱衍生物，R1是氢、甲氧基或羟基；R2是甲氧甲基或甲酰基；R3是氢或甲氧基；R4是氢或二甲基烯丙基。
3.权利要求1所述的咔唑类生物碱衍生物或其盐在制备细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂中的应用。
4.权利要求1所述的咔唑类生物碱衍生物的制备方法，其特征为用乙醇或60-70％的乙醇提取黑果黄皮的茎皮或枝叶，得粗浸膏；用有机溶剂萃取该浸膏，得到提取物；将该提取物经反复的硅胶和Sephadex LH20柱层析、反复的制备硅胶薄层层析、反相制备HPLC和重结晶，分离出浸膏中的活性成分。
全文摘要
本发明涉及新的咔唑生物碱类衍生物或其盐,其制备方法及该类化合物在制备细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂中的应用。本发明从黑果黄皮中分离出三种结构类型的咔唑类生物碱衍生物,这些衍生物或它们的盐可用于制备抗癌药物或制备细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂。本发明新的咔唑类生物碱衍生物包括式(Ⅰ)简单取代咔唑和式(Ⅱ)、(Ⅲ)咔唑二量体。上述咔唑类生物碱衍生物的制备方法是用乙醇或含水乙醇提取黑果黄皮的干燥茎皮或枝叶,得粗浸膏,用有机溶剂萃取,经反复的柱层析、制备硅胶薄层层析、反相制备HPLC和重结晶等操作,分离出浸膏中的活性成分。
文档编号C07D209/86GK1332157SQ0112398
公开日2002年1月23日 申请日期2001年8月10日 优先权日2001年8月10日
发明者崔承彬, 蔡兵, 闫少羽, 姚新生 申请人:崔承彬