赭曲霉11α-羟化酶和氧化还原酶的制作方法

专利名称：赭曲霉11α-羟化酶和氧化还原酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型细胞色素P450样酶(赭曲霉(Aspergillusochraceus)11α-羟化酶)和氧化还原酶(赭曲霉氧化还原酶)，所述两种酶分离自从赭曲霉孢子mRNA产生的cDNA文库。当编码所述11α-羟化酶的cDNA与编码作为电子供体的人氧化还原酶的cDNA在秋粘虫(Spodoptera frugiperda)(Sf-9)昆虫细胞中共表达时，根据HPLC分析测定，它成功催化类固醇底物4-雄甾烯-3，17-二酮(AD)转化成11α-羟基-AD。本发明还涉及与这些cDNA分子有关的核酸分子或由这些cDNA分子衍生得到的核酸分子，其中包括它们的互补物、同源物和片段，本发明还涉及使用这些核酸分子产生例如它们的多肽和片段的方法。本发明还涉及产生识别所述赭曲霉11α-羟化酶和氧化还原酶的抗体，以及使用这些抗体分别在未改变的宿主细胞和转化的宿主细胞内检测这些天然和重组多肽存在的方法。本发明还提供下面方法在异源宿主细胞中只表达所述曲霉11α-羟化酶基因、或在异源宿主细胞内共同表达所述曲霉11α-羟化酶基因以及人或曲霉氧化还原酶，以便将类固醇底物生物转化为它们对应的11α-羟化物。
背景技术：
长久以来，人们已经使用微生物转化或生物转化来化学合成各种药用产物。与产生不需要的副产物的对应化学方法相比，在温和酶促条件下进行的立体特异性反应常常更好。微生物也具有对底物分子进行同时的独立反应或顺序反应的能力，这最小化在合成中不同步骤数量，并降低所需中间体或终产物的总成本。
已经综述用作生物催化剂转化有机化合物的微生物系统的一般特征(见，如，Goodhue，Charles T.，Microb.Transform.Bioact.Compd.，19-44，1982)。例如，可以在连续培养物或分批培养物中进行生物转化。从所述微生物分泌的酶与底物反应，然后可以从培养基中回收产物。如果底物能够通过主动或被动扩散过程进入细胞，那么细胞内的酶也可以与所述底物反应。在微生物转化中也已经使用固定化、干燥、透化处理和静息细胞和孢子。应用溶液形式的细胞提取物和纯化的酶、或应用固定化在载体上的细胞提取物和纯化的酶与传统发酵方法相比，可能最终提供显著的成本或控制优势。
在类固醇领域已经广泛使用生物转化反应(Kieslich，K.；Sebek，O.K.Annu.Rep.Ferment.Processes 3275-304，1979；Kieslich，Klaus.Econ.Microbiol.，5(Microb.Enzymes Bioconvers.)369-465，1980)。已经表征多种反应，包括羟化作用、环氧化作用、氧化作用、脱氢作用、环和侧链降解作用、还原作用、水解作用和异构化反应。也已经使用多种类型微生物，其中包括多种物种，例如，枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、镰孢霉属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)、链霉菌属(Streptomyces)、放线菌属(Actinomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)和芽孢杆菌属(Bacillus)。
已经使用多种方法，以便利于羟化在合成重要商业化类固醇化合物时使用的中间体。例如，美国专利4,588,683描述制备11β，17α，20，21四羟基类固醇的方法在包含能够产生11β羟基化作用的弯孢霉属(Curvularia)的真菌培养物的培养基中，温育底物化合物。也已经使用赭曲霉和菌丝体制备物将孕酮和其它类固醇转化成它们对应的11α-羟基化形式(Tan，L.和Falardeau，P.，1970；Tan L.和FalardeauP.，J.Steroid Biochem.1221-227，1970；Samanta，T.B.等，Biochem.J.176，593-594，1978；Jayanthi，C.R.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1061262-1268，1982)。
使用类固醇治疗多种疾病的新型和扩展临床应用的出现已经需要以工业化规模生产类固醇化合物和它们的中间体的改良方法。例如，美国专利4,559,332描述制备20-spiroxane系列类固醇化合物的多种方法，包括制备依普利酮甲基氢9，11α-环氧-17α-羟基-3-氧代孕-4-烯-7α，21-二羧酸酯，γ-内酯(也称为依普利酮或表氧孕甲酯丙酸酮(epoxymexrenone))和相关化合物的多种方法。WO 98/25948和美国申请09/319,673描述制备9，11-环氧类固醇化合物的新方法，尤其是制备20-spiroxane系列和它们的类似物的新方法，并且描述在制备类固醇化合物中使用的新型中间体，以及制备所述新型中间体的方法。美国专利6,046,023公开通过微生物转化坎利酮或雌-4-烯-3，17-二酮成为其11α-羟基化类似物的改良方法，该方法使用曲霉属、根霉属和Pestelotia属的微生物，并且使用浓度超过10g/L的纯度低于97％、高于90％的类固醇底物。
优化特定类固醇中间体生物转化所需的许多现代和系统化的方法常常由于对涉及所述合成和降解的酶的生物化学知识不足而受到限制。真核细胞的细胞色素P450看起来与内质网(ER)或线粒体膜有关。结合ER的细胞色素P450酶的电子供体常常是依赖于FAD/FMN的NADPH细胞色素P450氧化还原酶。线粒体细胞色素P450中的电子传递通常由NADPH-铁氧还蛋白氧化酶和铁氧还蛋白介导。已知涉及哺乳动物类固醇发生作用的特定电子供体也分别称为肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶和肾上腺皮质铁氧还蛋白。
虽然已知细胞色素P450酶介导真菌的生物转化，但非常难纯化这些酶的酶促活性形式(van den Brink等，Fungal Genetics and Biologiy23，1-17，1998)。许多真菌的P450酶看起来与内质网结合(van denBrink等，Fungal Genetics and Biologiy 23，1-17，1998)。酵母有一种肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶类似物，该类似物在体外与哺乳动物11β羟化酶偶联(Laeour等，Journal of Biological Chemistry 273，23984-23992，1998)。与此不同，与赭曲霉11α羟化酶偶联的电子供体预期是NADPH-细胞色素P450氧化还原酶(Samanta和Ghosh，J SteroidBiochem 28，327-32，1987)。Rhizopus nigricans内的类固醇11α羟化作用复合物看起来也需要NADPH-细胞色素p450氧化还原酶(Makovec和Breskvar，Arch Biochem Biophys.357，310-6，1998)。在孕酮诱导的真菌菌丝体制备物中增强细胞色素R.nigricans P450和NADPH-细胞色素P450还原酶活性可能有利于表征所述两种酶的生物化学特征(Makovec和Breskvar，Pflugers Arch-Eur J.Physiol 439(增刊)R111-R112，2000)。
已经显示赭曲霉的孢子催化类固醇底物如孕酮的11α羟化作用(Dutta TK，Datta J，Samanta TB，Biochem.Biophys.Res.Commun.192119-123，1993)。也已知烟曲霉(A.fumigatus)表现类固醇11α羟化酶活性(Smith等，J Steroid Biochem Mol Biol 4993-100，1994)。所述烟曲霉的酶与所述赭曲霉酶不同，因为所述烟曲霉的酶看起来是对11α和15β羟化作用具有双位点特异性的细胞色素P450，并且与所述赭曲霉酶不同，所述烟曲霉的酶看起来是非诱导性的。
尽管测序技术最近快速发展，但关于从核苷酸序列数据收集的真菌细胞色素P450的结构关系的详细知识仍是初级的。Breskvar等(Biochem.Biophys.Res.Commun 1991；178，1078-1083，1991)已经描述从Rhizopus nigricans获得的编码推定的P-450的基因组DNA序列，所述DNA序列编码孕酮11α-羟化酶。然而，该序列可能不是完整的，因为预测的氨基酸序列缺少规范的血红素结合基序FxxGxxxCxG，该基序在几乎所有已知细胞色素P-450酶中是常见的(Nelson等，Pharmacogenetics 61-42，1996)。
已经描述对黑曲霉(Aspergillus niger)的NADPH细胞色素P450氧化还原酶(cprA)基因的克隆和表征化(van den Brink，J.等，Genebank登记号Z26938，CAA81550，1993，未出版)。已经从啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NADPH-细胞色素P450还原酶的克隆基因的核苷酸序列推导出该酶的一级结构(Yabusaki等，J.Biochem.103(6)1004-1010，1998)。
已经使用几种其它方法来克隆和分析类固醇酶。例如，美国专利5,422,262、美国专利5,679,521和欧洲专利EP 0 528 906 B1描述表达克隆2型类固醇5α还原酶。例如，美国专利5,869,283描述包含异源DNA的表达盒，所述异源DNA编码两种或多种酶，每种酶催化涉及转化胆固醇成为皮质甾醇的一个氧化步骤，包括转化胆固醇成为孕烯醇酮、转化孕烯醇酮成为孕酮、转化孕酮成为17α-羟基孕酮、转化17α-羟基孕酮成为11-脱氧皮甾醇和转化11-脱氧皮甾醇成为皮质甾醇。
还未曾报道赭曲霉11α羟化酶和赭曲霉氧化还原酶的序列。关于它们序列的知识能够极大地促进发展表达载体和重组宿主菌株，在工业化规模上更有效地生物转化类固醇中间体和合成终产物，而不带来与部分鉴定的宿主菌株或对涉及类固醇发生作用的酶的不完全了解有关的问题。本发明通过鉴定能够进行类固醇11α羟化的酶，克服许多上文讨论的限制。本方法不仅极大促进11α羟化作用的应用，而且允许发展从其它真菌鉴定相似酶的新策略、从赭曲霉和其它微生物克隆涉及类固醇产生的其它酶、以及发展在生物转化中应用游离细胞或固定化细胞或酶的改良宿主菌株或方法。也可以发展相似方法，帮助构建表达载体和重组宿主菌株，所述表达载体和重组宿主菌株比目前在大规模生物反应器中普遍用于生物转化的野生型微生物更易增殖和控制。
发明简述在本发明最大范围内，提供克隆涉及类固醇代谢的酶的方法以及使用这些酶生产新型类固醇中间体和终产物的应用。本发明的一方面提供新型11α羟化酶和氧化还原酶以及它们的核酸、蛋白、肽、片段和类似物。本发明还涉及鉴定和克隆涉及类固醇代谢的其它酶的方法。本发明还包括新型载体和宿主细胞、使用上述载体制造异源蛋白的新方法、以及鉴定所克隆的酶的底物特异性的方法。
本发明提供确定所克隆的11α羟化酶、其等位基因变异体、突变蛋白和融合蛋白的底物特异性的方法，该方法允许评估广泛的类固醇底物，包括3酮δ4，5类固醇(3酮δ4类固醇)、3酮δ4，5δ6，7类固醇(3酮δ4δ6类固醇)、3酮δ6，7类固醇(3酮δ6类固醇)或3酮δ1，2δ4，5类固醇(3酮δ1δ4类固醇)。用于测试的优选底物包括(a)坎利酮、(b)雄甾烯二酮、(c)aldona、(4)ADD(1，4雄二烯二酮)(e)孕甲酯丙酸酮(mexrenone)、(f)6β孕甲酯丙酸酮、(g)9α孕甲酯丙酸酮、(h)12β孕甲酯丙酸酮、(i)δ12孕甲酯丙酸酮、(j)睾酮、(k)孕酮、(l)孕甲酯丙酸酮6，7-二-内酯、和(m)孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯。优选所克隆的11α羟化酶、其等位基因变异体、突变蛋白和融合蛋白不催化选自以下的第二种羟化反应对底物3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇或3酮δ6，7类固醇的15α或β羟化、6α或β羟化、7α或β羟化、9α或β羟化、12α或β羟化和17α或β羟化。最优选所克隆的11α羟化酶、其等位基因变异体、突变蛋白和融合蛋白不催化底物3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇或3酮δ6，7类固醇的15β羟化。
本发明提供编码赭曲霉11α羟化酶的分离纯化核酸。本发明还提供编码赭曲霉11α羟化酶的基因的分离的DNA、cDNA、基因和等位基因。最好所述分离纯化的核酸如SEQ ID NO01所述。最好所述基因的分离的DNA、cDNA、基因和等位基因如SEQ ID NO01所述。
本发明提供具有赭曲霉11α羟化酶的氨基酸序列的分离蛋白。本发明还提供赭曲霉11α羟化酶的分离变异体、包含所述羟化酶的融合蛋白。最好所述蛋白如SEQ D NO2所述。本发明还提供SEQ IDNO2所述蛋白的变异体；包含SEQ ID NO2并具有至少一个保守氨基酸取代的多肽；具有与SEQ ID NO2至少99％、95％、90％、75％和50％相同的氨基酸序列的多肽。
本发明提供编码赭曲霉11α氧化还原酶的分离纯化核酸。本发明还提供编码赭曲霉氧化还原酶的基因的分离DNA、cDNA、基因和等位基因。最好所述分离纯化核酸的核酸序列如SEQ ID NO5所述。本发明还提供SEQ ID NO5基因的分离DNA、cDNA、基因和等位基因。
本发明提供具有赭曲霉氧化还原酶氨基酸序列的分离蛋白。本发明还提供具有赭曲霉氧化还原酶氨基酸序列的蛋白的分离变异体、包含赭曲霉氧化还原酶氨基酸序列的融合蛋白。所述分离蛋白的优选具有SEQ ID NO6氨基酸序列。本发明还提供SEQ ID NO6所述蛋白的分离变异体；纯化的多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO6并具有至少一个保守氨基酸取代；具有与SEQ ID NO6至少99％、95％、90％、75％和50％相同的氨基酸序列的多肽。
本发明提供编码酶的分离纯化核酸，所述酶催化3酮δ4，5类固醇(3酮δ4类固醇)、3酮δ4，5δ6，7类固醇(3酮δ4δ6类固醇)、3酮δ6，7类固醇(3酮δ6类固醇)或3酮δ1，2δ4，5类固醇(3酮δ1δ4类固醇)的11α羟化。优选所述酶不催化3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇或3酮δ6，7类固醇的15β羟化。更优选所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD；(e)从孕甲酯丙酸酮到11α羟基孕甲酯丙酸酮；(f)从6β孕甲酯丙酸酮到11α羟基6β孕甲酯丙酸酮；(g)从9α孕甲酯丙酸酮到11α羟基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羟基12β孕甲酯丙酸酮；(i)从δ12孕甲酯丙酸酮到11α羟基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)从睾酮到11α羟基睾酮；(k)从孕酮到11α羟基孕酮；(l)从孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯和(m)从孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯。更优选所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD。最优选所述羟化反应是从坎利酮到11α羟基坎利酮。
本发明还提供表达蛋白的方法，所述蛋白能够催化3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇、3酮δ6，7类固醇或3酮δ1，2δ4，5类固醇的11α羟化，所述方法包括(a)用表达盒转化或转染宿主细胞，所述表达盒包含编码所述蛋白的核酸以及与所述核酸有效连接的启动子，然后(b)在所述宿主细胞中表达所述蛋白。本发明还提供生产所述蛋白的方法，所述方法还包括回收所述蛋白的步骤。所述蛋白优选是赭曲霉11α羟化酶。更优选所述方法还包括表达电子供体蛋白，其中所述电子供体蛋白能够为催化3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇、3酮δ6，7类固醇或3酮δ1，2δ4，5类固醇的11α羟化的所述蛋白提供电子。优选所述电子供体蛋白选自以下人氧化还原酶和赭曲霉氧化还原酶。更优选所述电子供体蛋白是赭曲霉氧化还原酶。更优选编码所述类固醇11α羟化酶和所述电子供体蛋白的核酸在不同表达盒内。更优选编码所述类固醇11α羟化酶和所述电子供体蛋白的核酸在同一表达盒内。甚至更优选所述类固醇11α羟化酶是赭曲霉11α羟化酶，所述电子供体蛋白是人氧化还原酶。甚至更优选所述类固醇11α羟化酶是赭曲霉11α羟化酶，所述电子供体蛋白是赭曲霉氧化还原酶。优选所述表达盒在表达载体上。更优选所述表达载体是杆状病毒。甚至更优选所述杆状病毒是选自以下的核型多角体病毒苜蓿银纹夜蛾(Autograapha californica)核型多角体病毒和家蛋(Bombyx mori)核型多角体病毒。最优选所述核型多角体病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。优选所述宿主细胞是昆虫细胞。更优选所述昆虫细胞选自以下秋粘虫、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、苜蓿银纹夜蛾和烟草天蛾(Manduca sexta)细胞。最优选所述昆虫细胞是秋粘虫细胞。本发明还提供表达蛋白的方法，其中所述赭曲霉11α羟化酶是SEQ ID NO2；所述人氧化还原酶是SEQ ID NO4；所述赭曲霉氧化还原酶是SEQ ID NO6。
本发明还提供分离纯化的多肽，所述多肽催化3酮δ4，5类固醇(3酮δ4类固醇)、3酮δ4，5δ6，7类固醇(3酮δ4δ6类固醇)、3酮δ6，7类固醇(3酮δ6类固醇)或3酮δ1，2δ4，5类固醇(3酮δ1δ4类固醇)的11α羟化。优选所述多肽不催化3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇或3酮δ6，7类固醇的15β羟化。更优选所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD；(e)从孕甲酯丙酸酮到11α羟基孕甲酯丙酸酮；(f)从6β孕甲酯丙酸酮到11α羟基6β孕甲酯丙酸酮；(g)从9α孕甲酯丙酸酮到11α羟基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羟基12β孕甲酯丙酸酮；(i)从δ12孕甲酯丙酸酮到11α羟基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)从睾酮到11α羟基睾酮；(k)从孕酮到11α羟基孕酮；(l)从孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯和(m)从孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯。更优选所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD。最优选所述羟化反应是从坎利酮到11α羟基坎利酮。
本发明还提供表达盒，所述表达盒包含有效连接分离纯化核酸的启动子，所述核酸编码能够催化3酮δ4，5类固醇(3酮δ4类固醇)、3酮δ4，5δ6，7类固醇(3酮δ4δ6类固醇)、3酮δ6，7类固醇(3酮δ6类固醇)或3酮δ1，2δ4，5类固醇(3酮δ1δ4类固醇)的11α羟化的多肽。更优选所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD；(e)从孕甲酯丙酸酮到11α羟基孕甲酯丙酸酮；(f)从6β孕甲酯丙酸酮到11α羟基6β孕甲酯丙酸酮；(g)从9α孕甲酯丙酸酮到11α羟基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羟基12β孕甲酯丙酸酮；(i)从δ12孕甲酯丙酸酮到11α羟基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)从睾酮到11α羟基睾酮；(k)从孕酮到11α羟基孕酮；(l)从孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯和(m)从孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯。更优选所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD。最优选所述羟化反应是从坎利酮到11α羟基坎利酮。
本发明还提供表达盒，所述表达盒包含有效连接分离纯化核酸的启动子，所述核酸编码赭曲霉氧化还原酶。优选所述核酸是SEQ IDNO6。
本发明还提供包含异源DNA的表达盒，所述异源DNA编码从谷甾醇合成依普利酮的代谢途径中的酶，其中所述酶催化选自以下的至少一种转化(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD；(e)从孕甲酯丙酸酮到11α羟基孕甲酯丙酸酮；(f)从6β孕甲酯丙酸酮到11α羟基6β孕甲酯丙酸酮；(g)从9α孕甲酯丙酸酮到11α羟基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羟基12β孕甲酯丙酸酮；(i)从δ12孕甲酯丙酸酮到11α羟基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)从睾酮到11α羟基睾酮；(k)从孕酮到11α羟基孕酮；(l)从孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯和(m)从孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯，并且其中所述异源DNA有效连接在重组宿主内表达所编码的酶所需的控制序列。优选所述表达盒中的所述异源DNA编码序列选自以下属和物种赭曲霉、赭曲霉、黑曲霉、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米根霉(Rhizopus oryzae)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、克罗斯韦假单胞菌(Pseudomonas cruciviae)、粉红单端孢(Trichothecium roseum)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、蓝色梨头霉(Absidia coerula)、灰绿梨头霉(Absidiaglauca)、雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)、黄柄曲霉(Aspergillusflavipes)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、白僵菌(Beauveria bassiana)、Botryosphaeria obtusa、Calonectria decora、螺卷毛壳(Chaetomiumcochliodes)、山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)、短刺小克银汗霉(Cunninghamella blakesleeana)、刺孢小克银汗霉(Cunninghamellaechinulata)、雅致小克银汗霉(Cunninghamella elegans)、Curvulariaclavata、弯孢(Curvularia lunata)、Cylindrocarpon radicicala、Epicoccumhumicala、卵形孢球托霉(Gongronella butleri)、金孢菌寄生(Hypomyceschrysospermus)、Monosporium olivaceum、深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)、大毛霉(Mucor mucedo)、灰蓝毛霉(Mucor griseocyanus)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、Nocardia corallina、Paecilomycescarneus、展青霉(Penicillum patulum)、Pithomyces atroolivaceus、Pithomyces cynodontis、Pycnosporium sp.、红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythrae)、黄瘤孢(Sepedonium chrysospermum)、Stachylidium bicolor、吸水链霉菌(Streptomyces hyqroscopicus)、浅绛红链霉菌(Streptomyces purpurascens)、总状共头霉(Syncephalastrumracemosum)、Thamnostylum piriforme、Thielavia terricola和可可轮枝孢(Verticillium theobromae)、Cephalosporium aphidicola、Cochlioboluslunatas、Tieghemella orchidis、Tieghemella hyalospora、Monosporiumolivaceum、焦曲霉(Aspergillus ustus)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、灰绿轮枝孢(Verticillium glaucum)和Rhizopusnigricans。更优选所述属和物种选自以下赭曲霉、赭曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、米根霉、匍枝根霉、弗氏链霉菌、巨大芽孢杆菌、克罗斯韦假单胞菌(Pseudomonas cruciviae)、粉红单端孢、尖镰孢、少根根霉和Monosporium olivaceum。最优选所述属和物种是赭曲霉。
优选所述重组宿主细胞和其后代包含至少一个表达盒。更优选所述宿主是微生物。最优选所述宿主是细菌。本发明还提供制造来自转化谷甾醇成为依普利酮的代谢途径中一种或多种酶的方法，所述方法包括在表达和积累由所述异源DNA编码的一种或多种酶的条件下，在营养培养基中培养所述重组宿主细胞。更优选所述方法包括下列步骤(a)在羟化所述需要氧化的化合物并且积累所述羟化产物的条件下，在所述重组细胞存在下温育所述化合物，然后(b)回收所述羟化产物。最优选所述方法包括下列步骤(a)在羟化所述需要氧化的化合物并且积累所述羟化产物的条件下，在所产生的酶存在下温育所述化合物，然后(b)回收所述羟化产物。本发明还提供带有表达盒的宿主细胞。更优选所述表达盒整合入所述宿主细胞的染色体。更优选所述表达盒整合进表达载体。
本发明还提供确定克隆的11α羟化酶的比活的方法，所述方法包括下面步骤(a)用包含编码所述11α羟化酶的核酸的表达载体转化宿主细胞，(b)在所述宿主细胞中表达所述11α羟化酶；(c)从所述细胞制备亚细胞膜部分，(d)用类固醇底物温育所述亚细胞膜部分，然后(e)监测所述类固醇底物转化成其11α羟基类固醇对应物。优选所述方法还包括下面步骤用包含编码氧化还原酶的核酸的表达载体转化宿主细胞，然后在所述宿主细胞中表达所述氧化还原酶。更优选所述氧化还原酶是人氧化还原酶或赭曲霉氧化还原酶。最优选所述氧化还原酶是人氧化还原酶。最优选所述氧化还原酶是赭曲霉氧化还原酶。
本发明还提供具有SEQ ID NO2的蛋白，或者与SEQ ID NO2至少95％相同并且催化3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇、3酮δ6，7类固醇或3酮δ1，2δ4，5类固醇的11α羟化的变异体，其中所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD；(e)从孕甲酯丙酸酮到11α羟基孕甲酯丙酸酮；(f)从6β孕甲酯丙酸酮到11α羟基6β孕甲酯丙酸酮；(g)从9α孕甲酯丙酸酮到11α羟基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羟基12β孕甲酯丙酸酮；(i)从δ12孕甲酯丙酸酮到11α羟基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)从睾酮到11α羟基睾酮；(k)从孕酮到11α羟基孕酮。所述酶最好不催化3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇或3酮δ6，7类固醇的15β羟化。
本发明提供分离纯化的核酸，所述核酸编码催化3酮δ4，5类固醇(3酮δ4类固醇)、3酮δ4，5δ6，7类固醇(3酮δ4δ6类固醇)、3酮δ6，7类固醇(3酮δ6类固醇)或3酮δ1，2δ4，5类固醇(3酮δ1δ4类固醇)的11α羟化的酶，其中所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD；(e)从孕甲酯丙酸酮到11α羟基孕甲酯丙酸酮；(f)从6β孕甲酯丙酸酮到11α羟基6β孕甲酯丙酸酮；(g)从9α孕甲酯丙酸酮到11α羟基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羟基12β孕甲酯丙酸酮；(i)从δ12孕甲酯丙酸酮到11α羟基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)从睾酮到11α羟基睾酮；(k)从孕酮到11α羟基孕酮。所述酶最好不催化3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇或3酮δ6，7类固醇的15β羟化。
本发明还提供纯化的多肽，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ IDNO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25。
本发明提供纯化的免疫原性多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO2的至少十个连续残基。
本发明提供分离纯化的抗体，所述抗体对具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的11α羟化酶具有结合特异性。最好所述抗体结合选自以下的蛋白区(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO2的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQID NO24；和(e)氨基酸SEQ ID NO25。最好所述抗体在肽柱上纯化，其中所述肽选自以下(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQID NO2的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQ ID NO24；和(e)氨基酸SEQ ID NO25。
本发明还提供纯化的多肽，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ IDNO26。
本发明还提供纯化的免疫原性多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO6的至少十个连续残基。
本发明还提供分离纯化的抗体，所述抗体对具有SEQ ID NO6的氨基酸序列的11α羟化酶具有结合特异性。优选所述抗体结合选自以下的蛋白区(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。更优选所述抗体在肽柱上纯化，其中所述肽选自以下(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。
本发明还提供组合物，所述组合物包含在有效载体、媒介物或辅助剂中的上文所述抗体。本发明还提供包含所述抗体和溶液的组合物。所述抗体可以是多克隆抗体。所述抗体也可以是单克隆抗体。所述抗体可以偶联免疫亲和基质。本发明还提供使用免疫亲和基质从生物液体或细胞裂解物中纯化多肽的方法。优选所述免疫亲和基质是SEPHAROSE 4B。更优选所述使用免疫基质从生物液体或细胞裂解物纯化多肽的方法使用SEPHAROSE 4B作为免疫基质。更优选所述使用免疫基质从生物液体或细胞裂解物纯化多肽的方法使用SEPHAROSE 4B作为免疫基质。
本发明还提供使用肽柱纯化抗体的方法，其中所述肽选自以下(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO2的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQ ID NO24；和(e)氨基酸SEQ ID NO25。
本发明还提供使用肽柱纯化抗体的方法，其中所述肽选自以下(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。
本发明还提供检测生物体液中第一种多肽的方法，其中所述第一种多肽选自11α羟化酶和氧化还原酶，所述方法包括以下步骤(a)使所述液体与第二种多肽接触，所述第二种多肽具有对所述第一种多肽的结合特异性，然后(b)测定所述第二种多肽的存在以确定所述第一种多肽的水平。优选所述第二种多肽是抗体。更优选所述第二种多肽受到放射标记。
本发明还提供生产分离核酸的方法，所述方法包括在6XSSC中和65℃下使SEQ ID NO1与基因组DNA杂交，然后分离SEQ ID NO1所检测到的核酸。本发明还提供依照所述方法制备的分离DNA核酸。
本发明还提供在高度严格条件下与SEQ ID NO1序列的互补物特异性杂交的分离核酸。
本发明还提供生产分离核酸的方法，所述方法包括在6XSSC中和65℃下使SEQ ID NO5与基因组DNA杂交，然后分离SEQ ID NO5所检测到的核酸。本发明还提供依照所述方法制备的分离DNA核酸。
本发明还提供在高度严格条件下与SEQ ID NO5所述序列的互补物特异性杂交的分离核酸。
本发明还提供DNA构建物，当将所述DNA构建物插入细胞的染色体DNA时，所述DNA构建物改变在所述细胞中通常不表达的11α羟化酶基因的表达，所述DNA构建物包含(a)靶序列；(b)调节序列；和(c)编码类固醇11α羟化酶的结构基因。本发明还提供携带所述DNA构建物的宿主细胞。
本发明还提供DNA构建物，当将所述DNA构建物插入细胞的染色体DNA时，所述DNA构建物改变在所述细胞中通常不表达的11α羟化酶基因的表达，所述DNA构建物包含(a)靶序列；(b)调节序列；和(c)编码类固醇氧化还原酶的结构基因。本发明还提供携带所述DNA构建物的宿主细胞。
本发明还提供使用携带克隆的11α羟化酶的宿主细胞生产药物的应用，所述药物用于治疗心脏病、炎症、关节炎或癌症。
本发明还提供组合物，所述组合物包含从约0.5到约500g/L糖蜜，0.5-50g/L玉米浆，0.5-50g/L KH2PO4，2.5-250g/L NaCl，2.5-250g/L葡萄糖和0.04-4g/L孕酮，pH3.5-7。优选所述组合物包含从约10到约250g/L糖蜜，1-25g/L玉米浆，1-25g/L KH2PO4，5-125g/L NaCl，5-125g/L葡萄糖和0.08-2g/L孕酮，pH4.5-6.5。更优选所述组合物包含约25-100g/L糖蜜，2.5-10g/L玉米浆，2.5-10g/L KH2PO4，12.5-50g/L NaCl，12.5-50g/L葡萄糖和0.2-0.8g/L孕酮，pH5.5-6.0。最优选所述组合物包含约50g/L糖蜜，5g/玉米浆，5g/L KH2PO4，25g/LNaCl，25g/L葡萄糖，20g/L琼脂和0.4g/L孕酮，pH5.8。
本发明还提供上文所述任何一种组合物的半固体制剂，所述制剂还包含从约4-100g/L琼脂。优选所述琼脂浓度从约10-40g/L琼脂。更优选所述琼脂是约20g/L琼脂。
本发明还提供使用上文所述任何一种组合物的应用，所述组合物用于生产选自以下的微生物的孢子赭曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、米根霉、匍枝根霉和粉红单端孢、尖镰孢、少根根霉、Monosporiumolivaceum、产黄青霉(Penicillum chrysogenum)和蓝色梨头霉。所述组合物最好用于生产赭曲霉的孢子。
定义下面列表是本文中可互换使用的缩写和对应意义11α羟基坎利酮＝11α羟基-4-雄烯-3，17-二酮(C22H28O4，MW356.46)AcNPV＝苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，昆虫病毒中杆状病毒科家族成员AD＝雄甾烯二酮或4-雄烯-3，17-二酮(C22H28O3，MW 340.46)烯睾丙酸＝坎利酮Amp＝氨苄青霉素attTn7＝Tn7的附着位点(Tn7插入细菌染色体的优选位点)bacmid＝从大肠杆菌(E.coli)分离的重组杆状病毒穿梭载体Bluo-gal＝卤化吲哚基-β-D-半乳糖苷bp＝碱基对Cam＝氯霉素cDNA＝互补DNADMF＝N，N-二甲基甲酰胺ds＝双链依普利酮或环氧孕甲酯丙酸酮＝甲基氢9，11α-环氧-17α-羟基-3-氧代孕-4-烯-7α，21-二羧酸酯，γ-内酯(MW 414.5)g＝克Gen＝庆大霉素hoxr＝人氧化还原酶HPLC＝高效液相色谱羟基坎利酮＝11α-或11β-羟基坎利酮IPTG＝异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Kan＝卡那霉素kb＝千碱基，1000bp(s)mb＝兆碱基Me＝甲基mg＝毫克ml或mL＝毫升
mm＝毫米mM＝毫摩尔NMR＝核磁共振oxr＝氧化还原酶PCR＝聚合酶链反应r＝抵抗的或抗性RP-HPLC＝反相高效液相色谱RT＝室温RT-PCR＝反转录酶聚合酶链反应s＝敏感SDS-PAGE＝十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳Spc/Str＝壮观霉素/链霉素Tet＝四环素Tn＝转座子ts＝对温度敏感U＝单位ug或μg＝微克ul或μl＝微升X-gal＝5-溴-3-氯-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷X-gluc＝5-溴-3-氯-吲哚基-β-D-吡喃葡萄糖苷下面列表是本文使用的各种术语的定义物种“赭曲霉NRRL 405”指丝状真菌赭曲霉NRRL 405，保藏号18500，从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。赭曲霉NRRL405和赭曲霉ATCC 18500是同一菌株，目录号不同。
术语“氨基酸”指所有天然L-氨基酸，包括正亮氨酸、正缬氨酸、高半胱氨酸和鸟氨酸。
术语“简并”指两种核酸分子编码同样氨基酸序列，但包含不同核苷酸序列。
术语“片段”指这样的核酸分子所述核酸分子的序列比靶核酸分子或已鉴定的核酸分子短，并且所述核酸分子具有靶核酸分子或已鉴定的核酸分子的至少10个连续核苷酸相同、或其实质性互补物或实质性同源物。
术语“融合蛋白”指蛋白或其片段，所述蛋白包含不来自所述蛋白的一种或多种其它肽区。
术语“探针”指用于确定分子、细胞、组织或生物的性质或特征(如存在或不存在、位置、相关性等)的试剂。
术语“启动子”广义指控制mRNA生产的调节序列。所述序列包括RNA聚合酶结合位点、增强子等。
术语“蛋白片段”指肽分子或多肽分子，其氨基酸序列包含所述蛋白氨基酸序列的一部分。
术语“重组”指直接来源于或间接来源于对核酸分子的人工操作的任何试剂(如DNA、肽等)。
术语“可选择或可筛选的标记基因”指其表达可以通过用探针鉴定或筛选转化细胞的方式检测的基因。
术语“特异性结合”指抗体或肽的结合不受到不相关分子的竞争性抑制。
术语“特异性杂交”指能够形成反平行、双链核酸结构的两个核酸分子。
术语“实质性互补物”指与互补物共有至少80％序列同一性的核酸序列。
术语“实质性片段”指包含至少100个核苷酸的核酸片段。
术语“实质性同源物”指相互之间共有至少80％序列同一性的核酸分子。
术语“实质杂交”指在一定条件(如盐和温度)下可以形成反平行双链核酸结构的两个核酸分子，所述条件允许相互之间表现90％或更高序列同一性并且在所述核酸分子的至少约50个连续核苷酸上表现所述同一性的序列进行杂交。
术语“基本纯化”指在包含靶分子的天然制备物中存在或可能存在的一种或多种分子已经被除去或降低浓度。
下面是类固醇、对应术语和它们的结构的列表，在本文中它们之间可以互换使用#名称CA索引名别名化学式 结构1依普利酮孕-4-烯-7，21- 螺[9，11-环氧-9H- C24H30O6二羧酸，9，11- 环戊二烯并[a]菲-环氧-17-羟基- 17(2H)，2′(3′H)-呋3-氧代-，γ-内 喃]，孕-4-烯-7，21-酯，甲 二羧酸衍生物；酯，(7α，11α，17 CGP 30083；依普α)-(9CI) 利酮；SC 66110 2烯睾丙酸； 孕-4，6-二烯- 17α-孕-4，6-二烯- C22H28O3坎利酮 21-羧酸，17-羟 21-羧酸，17-羟基-3-基-3-氧代-，γ- 氧代-，γ-内内酯，(17α)- 酯，(6CI，7CI，8CI)；(9CI) 螺[17H-环戊二烯并[a]菲-17，2′(5′H)-呋喃]，孕-4，6-二烯-21-羧酸衍生物；11614R.P.；17β-羟基-3-氧代孕-4，6-二烯-21-羧酸；20-Spiroxa-4，6-二烯-3，21-二酮；烯睾丙酸；坎利酮；Phanurane；SC9376；螺甾内酯SC14266 311α-羟基 孕-4，6-二烯- 11α-羟基坎利酮 C22H28O4坎利酮 21-羧酸，11，17-二羟基-3-氧代，γ-内酯，(11α，17α)-(9CI)
5Aldona乙孕-4，6-二烯- 螺[17H-环戊二烯 C24H34O3烯醇醚 21-羧酸，3-乙 并[a]菲-17，2′(5′H)-氧基-17-羟 呋喃]，孕-4，6-二烯-基，γ-内酯21-羧酸衍生物；(9CI) Aldona乙烯醇醚 6雄甾烯二雄-4-烯-3，17- Δ4-雄烯-3，17-二 C19H26O2酮 二酮(8CI，9CI) 酮；17-酮睾酮；3，17-二氧代雄-4-烯；雄甾烯二酮；Fecundin；SKF2170 711α-羟基 雄-4-烯-3，17- 雄-4-烯-3，17-二 C19H26O3雄甾烯二二酮，11-羟基- 酮，11α-羟基酮 (11α)-(9CI) (8CI)；11α-羟基雄甾烯二酮；11α-羟基雄甾烯二酮 8孕甲酯丙孕-4-烯-7，21- 螺[17H-环戊二烯 C24H32O5酸酮二羧酸，17-羟 并[α]菲-17，2′(5′H)-基-3-氧代-，γ-呋喃]，孕-4-烯-内酯，甲 7，21-二羧酸衍生酯，(7α，17α)- 物；孕甲酯丙酸酮；(9CI) SC 25152；ZK32055 911β-羟基 孕-4-烯-7，21- 11β-羟基孕甲酯丙 C24H32O6孕甲酯丙二羧酸，11，17-酸酮酸酮二羟基-3-氧代-，γ-内酯，甲酯，(7α，11β，17α)-(9CI)
10 12β-羟基 孕-4-烯-7，21- 12β-羟基孕甲酯丙 C24H32O6孕甲酯丙二羧酸，12，17- 酸酮酸酮二羟基-3-氧代-，γ-内酯，甲酯，(7α，12β，17α)-(9CI) 11 9α-羟基孕 孕-4-烯-7，21- 9α-羟基孕甲酯丙 C24H32O6甲酯丙酸二羧酸，9，17- 酸酮酮 二羟基-3-氧代-，21，17-内酯，7-甲酯，(7α，17α)-(9CI) 12 6β-羟基孕 孕-4-烯-7，21- 螺[17H-环戊二烯 C24H32O6甲酯丙酸二羧酸，6，17- 并[a]菲-17，2′(3′H)-酮 二羟基-3-氧 呋喃]，孕-4-烯-代-，γ-内酯，甲7，21-二羧酸衍生酯，(6β，7α，17α 物；6β-羟基孕甲酯)-(9CI) 丙酸酮 13 孕酮孕-4-烯-3，20- 孕酮(8CI)；Δ4-孕 C21H30O2二酮(9CI) 烯-3，20-二酮；和多于70种别名 14 雌-4-烯-雌-4-烯-3，17- (+)-19-降雄-4-烯- C18H24O23，17-二酮 二酮3，17-二酮；Δ4-雌烯(6CI，8CI，9CI) -3，17-二酮；19-降雄-4-烯-3，17-二酮
15 δ1，4-雄二雄-1，4-二烯-Δ1，4-雄二烯-3，17- C19H24O2烯-3，17-二3，17-二酮 二酮；1-脱氢雄甾酮(ADD)(7CI，8CI，9CI) 烯二酮；雄二烯二酮；雄烷-1，4-二烯-3，17-二酮 16 11α-羟基 雄-1，4-二烯-雄-1，4-二烯-3，17- C19H24O3雄-1，4-二3，17-二酮，11- 二酮，11α-羟基-烯-3，17-二 羟基-，(11α)- (6CI，7CI，8CI)；酮(11α羟 (9CI)11α-羟基雄-1，4-二基ADD) 烯-3，17-二酮；Kurchinin 17 aldona 化合物5(Aldona乙烯醇醚，在位置用O＝取代EtO-)18 孕甲酯丙 在位置6和7的碳之间形成环二酸酮6，7- 内酯环(-O-C＝O-)的化合物12(见二内酯 美国专利5,981,744关于类似内酯环的论述)19 11α羟基孕 化合物18的11α羟基形式甲酯丙酸酮6，7-二内酯20 孕甲酯丙 在位置7和9的碳之间形成环二酸酮7，9- 内酯环(-O-C＝O-)的化合物12(见二内酯 美国专利5,981,744关于类似内酯环的论述)21 11α羟基孕 化合物20的11α羟基形式甲酯丙酸酮7，9-二内酯

图1-赭曲霉11α羟化酶的核苷酸序列和蛋白序列展示赭曲霉11α羟化酶的核苷酸序列和蛋白质序列(分别是SEQID NO1和SEQ ID NO2)。
图2-人氧化还原酶的核苷酸序列和蛋白质序列展示人氧化还原酶的核苷酸序列和蛋白质序列(分别是SEQ IDNO3和SEQ ID NO4)。本说明书公开的从cDNA文库独立克隆的人氧化还原酶的预测氨基酸序列与三个不同实验室以前所报道的序列相符合，所述cDNA文库使用来自人HepG2细胞的RNA作为模板通过RT-PCR制备。这些基因座的GenBank登记号包括A60557(NADPH-高铁血红素蛋白还原酶(EC 1.6.2.4)-人)、AAG09798(NADPH-细胞色素P450还原酶[智人(Homo sapiens)]和P16435(NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)(P450R))。
AAB21814(细胞色素P450还原酶{EC 1.6.2.4}[人，胎盘，肽部分，676aa])与人氧化还原酶A60557和P16435在4个残基上不同在500是A→V，在518是F→L，在537是V→W，在538是A→H。AAB21814还缺失起始的甲硫氨酸。编码AAB21814的相关核酸(S90469细胞色素P450还原酶[人，胎盘，mRNA部分，2403nt])缺失编码起始甲硫氨酸的ATG密码子、在1496包括C→T的变化、在1551包括C→A的变化，并且在1605由于缺失G而出现移码，但该移码可以通过在1616加入T解决。
这些基因座的参考文献如下A60557(Yamano，S.，Aoyama T.，McBride，O.W.，Hardwick，J.P.，Gelboin，H.V.和Gonzalez，F.J.人NADPH-P450氧化还原酶互补DNA克隆、序列和痘苗病毒介导的表达以及将CYPOR定位到7号染色体Mol.Pharmacol.36(1)，83-88(1989)]、AAG09798[Czerwinski，M.，SAHNI，M.，Madan，A.和Parkinson，A.人CYPOR的多态性新等位基因的表达.待发表，直接递交]和P16435[Haniu，M.，McManus，M.E.，Birkett，D.J.，Lee，T.D.和Shively，J.E.对来自人肝的NADPH细胞色素P-450还原酶的结构和功能分析人类酶和NADPH结合位点的完整序列Biochemistry 28(21)，8639-8645(1989)]、AAB21814[Shephard，E.A.，Palmer，C.N.，Segall，H.J.和Philips，I.R.定量人组织内的细胞色素P450还原酶基因表达.Arch.Biochem.Biophys.294(1)，168-172(1992)]、S90469[Shephard，E.A.，Palmer，C.N.，Segall，H.J.和Philips，I.R.定量人组织内的细胞色素P450还原酶基因表达.Arch.Biochem.Biophys.294(1)，168-172(1992)]。
图3-赭曲霉氧化还原酶的核苷酸序列和蛋白质序列展示赭曲霉11氧化还原酶的核苷酸序列和蛋白质序列(分别是SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)。
图4-赭曲霉11α羟化酶与GenBank头10位BLAST搜索结果的氨基酸同一性排列对比将克隆进质粒pMON45624(SEQ ID NO01)的赭曲霉类固醇11α羟化酶(SEQ ID NO02)与用BLASTP程序在GenBank中发现的相关酶进行排列对比，其中BLASTP程序应用探试匹配算法(Altschul等，JMol Biol Oct 5；215(3)403-10，1990)。头10位匹配的GenBank登记号(其可能的功能，[属和种])如下CAA75565(细胞色素P450单加氧酶[藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)]、CAB91316(可能的细胞色素P450单加氧酶(lovA)[粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)]、CAB56503(细胞色素P450[Catharanthus roseus])、AAB94588(CYP71D10P[Glycinemax])、CAA75566(细胞色素P450单加氧酶[藤仓赤霉])、AAD34552(细胞色素P450单加氧酶[土曲霉(Aspergillus Terreus)]、CAA75567(细胞色素P450单加氧酶[藤仓赤霉])、CAA76703(细胞色素P450[藤仓赤霉])、CAA57874(未命名的蛋白产物[尖镰孢])、CAA91268(类似于细胞色素P450-cDNA EST yk423b11.3，来自该基因[Caenorhabditiselegans])。
这些基因座的参考文献如下CAA75565[Tudzynski，B.和Holter，K.藤仓赤霉内的赤霉素生物合成途径基因簇的证据.Fungal Genet.Biol.25(3)，157-170(1998)]、CAB913 16[Schulte，U.，Aign，V.，Hoheisel，J.，Brandt，P.，Fartmann，B.，Holland，R.，Nyakatura，G.，Mewes，H.W.和Mannhaupt，G.，未发表]、CAB56503[Schroeder，G.，Unterbusch，E.，Kaltenbach，M.，Schmidt，J.，Strack，D.和Schroeder，J.吲哚生物碱生物合成中的依赖于光诱导细胞色素P450的酶水甘草碱16羟化酶FEBSLett.458，97-102(1999)]、AAB94588[Siminszky，B.，Corbin，F.T.，Ward，E.R.，Fleischmann，T.J.和DEWEY，R.E.在酵母和烟草中表达大豆细胞色素P450单加氧酶cDNA增强苯基脲类除草剂的代谢.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(4)，1750-1755(1999)]、CAA75566[Tudzynski，B.和Holter，K.藤仓赤霉内的赤霉素生物合成途径基因簇的证据.Fungal Genet.Biol.25(3)，157-170(1998)]、AAD34552[Kennedy，J.，Auclair，K.，Kendrew，S.G.，Park，C.，Vederas，J.C.和Hutchinson，C.R.Lovastatin生物合成期间辅助蛋白调节多聚乙酰合酶活性.Science(1999)In press]、CAA75567[Tudzynski，B.和Holter，K.藤仓赤霉内的赤霉素生物合成途径基因簇的证据.Fungal Genet.Biol.25(3)，157-170(1998)]、CAA76703[Tudzynski，B.和Hoelter，K.表征来自藤仓赤霉的P450单加氧酶.未发表]、CAA57874[Mouyna，I.和Brygoo，Y.通过重复序列破坏Fusarium oxysporum f.sp.elaeidis细胞色素P450基因.未发表]和CAA91268[无作者.线虫C.Elegans的基因组研究生物学的平台.C.Elegans测序论坛.Science 282(5396)，2012-2018(1998)[堪误表发表于Science 1999年1月1日；283(5398)35和1999年5月26日；283(5410)2103和1999年9月3日；285(5433)1493]]]。
图5-系统树显示赭曲霉11α羟化酶与GenBank头10位BLAST搜索结果的相似性将展示克隆进质粒pMON45624的赭曲霉类固醇11α羟化酶的遗传相关性的系统树与在GenBank中发现的相关酶进行排列对比。使用BLAST寻找GenBank内相关的酶，使用ClustalW产生多序列排列对比和本图描述的系统树。在本图中作为用作标志的GenBank登记号的描述与图4的图例相同。
图6-赭曲霉11α羟化酶与GenBank头10位BLAST搜索结果之间的同一性百分率使用CLUSTAL计算赭曲霉11α羟化酶与使用BLAST在GenBank中发现的头10位BLAST搜索结果之间的同一性百分率(Thompson等，Comput.Appl.Biosci.1019-29，1994)。图7-赭曲霉和人氧化还原酶与黑曲霉、小鼠和啤酒酵母NADPH细胞色素P450还原酶的氨基酸同源性排列对比将克隆进质粒pMON45632(SEQ ID NO05)的赭曲霉类固醇氧化还原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO06)以及克隆进质粒pMON45605(SEQ ID NO04)的人氧化还原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO03)与来自黑曲霉、小鼠和啤酒酵母的相关酶如上所述进行排列对比。GenBank登记号(可能的功能，[属和种])如下BAA02936(NADPH-细胞色素P450还原酶前体[啤酒酵母])、CAA81550 NADPH-细胞色素P450还原酶[黑曲霉])、P16435(NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)(P450R)[人])、BAA04496(NADPH-细胞色素P450还原酶[小家鼠(Mus musculus)])。
这些基因座的参考文献如下BAA02936[Yabusaki，Y.，Murakami，H.和Ohkawa，H.根据啤酒酵母NADPH细胞色素P450还原酶克隆基因的核苷酸序列推导的该酶的一级结构.J.Biochem.103(6)，1004-1010(1988)]、CAA81550[van den Brink，J.，van Zeijl，C.，van denHondel，C.和van Gorcom，R.克隆和表征黑曲霉的NADPH细胞色素P450氧化还原酶(cprA)基因.未发表]、P16435[Haniu，M.，McManus，M.E.，Birkett，D.J.，Lee，T.D.和Shively，J.E.对来自人肝的NADPH细胞色素P-450还原酶的结构和功能分析人类酶和NADPH结合位点的完整序列Biochemistry 28(21)，8639-8645(1989)]、BAA04496[Ohgiya，S.，Shinriki，N.，Kamataki，T.和Ishizaki，K.小鼠NADPH细胞色素P-450氧化还原酶在酵母中的分子克隆和功能表达.Biochim.Biophys.Acta 1186(1-2)，137-141(1994)]。
图8-赭曲霉氧化还原酶与黑曲霉、小鼠和啤酒酵母NADPH细胞色素P450还原酶的氨基酸同源性排列对比将克隆进质粒pMON45632(SEQ ID NO05)的赭曲霉类固醇氧化还原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO06)与来自黑曲霉、小鼠和啤酒酵母的相关酶如上所述进行排列对比。在本图中作为用作标志的GenBank登记号的描述与上面图7的图例的描述相同。
图9-系统树显示赭曲霉和人氧化还原酶与来自黑曲霉、酵母和小鼠的还原酶的相关性将展示克隆进质粒pMON45632(SEQ ID NO05)的赭曲霉氧化还原酶(SEQ ID NO06)的遗传相关性的系统树与在GenBank中发现的相关酶进行排列对比。使用BLAST寻找GenBank内相关的酶，使用ClustalW产生多序列排列对比和本图描述的系统树。在本图中作为用作标志的GenBank登记号的描述与上面图7的图例的描述相同。
图10-赭曲霉氧化还原酶与来自黑曲霉、酵母和小鼠的还原酶的同一性百分率使用Clustal W和Boxshade计算赭曲霉氧化还原酶与来自黑曲霉、小鼠和啤酒酵母的氧化还原酶之间的同一性百分率。
图11-人氧化还原酶与SwissProt头4位搜索结果的排列对比将克隆进质粒pMON45605(SEQ ID NO03)的人类固醇氧化还原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO04)与SWISSPORT蛋白质数据库的头4位搜索结果如上文所述进行排列对比，所述人的类固醇氧化还原酶的氨基酸序列对应于下面关于P16435所报道的校正序列的氨基酸序列。SWISSPORT登记号{基因座}[俗名]种物种](可能的功能)如下P16435{NCPR_HUMAN}[人]NADPH-细胞色素P450还原酶、P00389{NCPR_RABIT}[兔]NADPH-细胞色素P450还原酶、P00388{NCPR_RAT}[大鼠]NADPH-细胞色素P450还原酶、P37040{NCPR_MOUSE}[小鼠]NADPH-细胞色素P450还原酶、P04175{NCPR_PIG}[猪]NADPH-细胞色素P450还原酶。
这些基因座的参考文献如下P16435[Haniu，M.，McManus，M.E.，Birkett，D.J.，Lee，T.D.和Shively，J.E.对来自人肝的NADPH细胞色素P-450还原酶的结构和功能分析人类酶和NADPH结合位点的完整序列Biochemistry 28(21)，8639-8645(1989)]、P00389[Katagiri，M.，Murakami，H.，Yabusaki，Y.，Sugiyama，T.，Okamoto，M.，Yamano，T.和Ohkawa，H.兔肝NADPH细胞色素P-450还原酶mRNA的全长cDNA的分子克隆和序列分析J.Biochem.100(4)，945-954( 986)]、P00388[Porter，T.D.和Kasper，C.B.大鼠NADPH细胞色素P-450氧化还原酶cDNA的编码核苷酸序列以及鉴定黄素结合结构域.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82(4)，973-977(1985)]、P37040[Ohgiya，S.，Shinriki，N.，Kamataki，T.和Ishizaki，K.小鼠NADPH细胞色素P-450氧化还原酶在酵母中的分子克隆和功能表达.Biochim.Biophys.Acta 1186(1-2)，137-141(1994)]、P04175[Haniu，M.，Iyanagi，T.，Miller，P.，Lee，T.D.和Shively，J.E.来自猪肝微粒体的NADPH细胞色素P-450还原酶的完整氨基酸序列.Biochemistry 25(24)，7906-7911(1986)]。
图12-系统树显示人氧化还原酶与SwissPort头4位搜索结果的相关性将展示克隆进质粒pMON45604(SEQ ID NO03)的人氧化还原酶(SEQ ID NO04)的遗传相关性的系统树与在SWISSPORT中发现的相关酶进行排列对比。使用BLAST寻找SWISSPORT内相关的酶，使用ClustalW产生多序列排列对比和本图描述的系统树。在本图中作为用作标志的SWISSPORT登记号的描述与上面图11的图例的描述相同。
图13-人氧化还原酶与SwissPort头4位搜索结果之间的同一性百分率使用Clustal W和Boxshade计算人氧化还原酶与SWISSPORT中发现的头4位搜索结果的同一性百分率。
图14在转染的Sf9昆虫细胞中表达赭曲霉11α羟化酶用杆状病毒感染昆虫细胞，感染后25小时和48小时收获表达赭曲霉11α羟化酶的感染细胞，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳制备和分离微粒体膜部分。将凝胶中的蛋白通过电泳转移到0.2um硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell Grimsehlstrasse 23 37574 EinbeckGermany)，用从肽11aOH肽2 CRQILTPYIHKRKSLKGTTD(SEQ IDNO24)制备的抗体GN-1187和GN-1188进行探测。
图15在转染的Sf9昆虫细胞中表达赭曲霉P450氧化还原酶用杆状病毒感染昆虫细胞，感染后25小时和48小时收获表达赭曲霉11氧化还原酶的感染细胞，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳制备和分离微粒体膜部分。将凝胶中的蛋白通过电泳转移到0.2um硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell Grimsehlstrasse 23 37574 EinbeckGermany)，用从oxr肽1 CTYWAVAKDPYASAGPAMNG(SEQ IDNO26)制备的抗体GN-2023和GN-12024进行探测。
图16-通过HPLC监测从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮的转化从用重组杆状病毒共感染的昆虫细胞制备微粒体和线粒体亚细胞部分，所述重组杆状病毒表达重组赭曲霉11α羟化酶和从HepG2细胞RNA克隆的人氧化还原酶。在NADPH生产系统的存在下用250μM雄甾烯二酮(AD)温育所述亚细胞部分120分钟，所得产物用HPLC分离，在247nm处进行紫外检测。羟化酶活性如预料中的一样出现在微粒体部分，但该活性也出现在线粒体部分。这些结果提示所述11α羟化酶可能有附着到破碎细胞的膜的趋势，或者该试验中亚细胞部分的分离不足够。图A展示用从线粒体部分制备的酶进行的反应。图A中在AD后洗脱出的峰看起来是睾酮。当使用微粒体部分时，几乎同样数量的AD转化为11α羟基AD，但同时产生相对更多的睾酮。图B展示在无酶来源的情况下进行120分钟的同样反应。图C展示在温育缓冲液中加入11α-羟基雄甾烯二酮标准后的HPLC描图。
发明详述本发明包括促进类固醇分子生物合成的酶，具体是具有细胞色素P450或氧化还原酶活性的酶。本发明部分涉及分离编码赭曲霉11α羟化酶的核酸，所述羟化酶与对应于细胞色素P450酶的高度保守残基显示序列同源性。本发明还涉及分离编码人和赭曲霉氧化还原酶的核酸。本发明所克隆的羟化酶和氧化还原酶的生物活性可以通过多种测定方法测量，包括在从重组杆状病毒感染的昆虫细胞制备的微粒体存在下，温育类固醇底物，然后通过高效液相色谱(HPLC)监测所述底物到它们的11α羟化物的转化。本发明包括新型11α羟化酶和氧化还原酶核酸、蛋白质、肽、同源物以及任何一者的片段，提供转化类固醇中间体到它们的11α羟化物的新型有效方法。
本发明还包括编码11α羟化酶和氧化还原酶的DNA序列、基本类似或行使基本相同功能的DNA序列、以及仅仅由于密码子简并性而与编码本发明羟化酶和氧化还原酶的DNA不同的DNA序列。本发明还包括用于构建这些DNA的突变形式的寡核苷酸中间体和所述寡核苷酸和突变DNA编码的多肽。
本发明还包括特异性结合赭曲霉11α羟化酶或赭曲霉氧化还原酶的抗体(包括抗肽抗体)、使用这些抗肽抗体纯化这些和其它相关多肽的方法、使用所述纯化多肽产生针对全长多肽的多克隆抗体或单克隆抗体的方法、以及使用针对所述全长多肽的抗体评价重组和非重组宿主细胞中所述多肽存在的方法。对于具有与这些多肽相关生物活性的多种宿主生物，可以使用所述抗体鉴定任何一种所述宿主生物中相关多肽的存在。
可以在该羟化步骤中使用的优选生物有赭曲霉NRRL 405、赭曲霉ATCC 18500、黑曲霉ATCC 16888和ATCC 26693、构巢曲霉ATCC 11267、米根霉ATCC 11145、匍枝根霉ATCC 6227b、弗氏链霉菌ATCC 10745、巨大芽孢杆菌ATCC 14945、克罗斯韦假单胞菌ATCC 13262和粉红单端孢ATCC 12543。其它优选生物包括Fusarium oxysporum f sp.cepae ATCC 11171和少根根霉ATCC11145。
对该反应表现活性的其它生物包括蓝色梨头霉ATCC 6647、灰绿梨头霉ATCC 22752、雅致放射毛霉ATCC 6476、黄柄曲霉ATCC1030、烟曲霉ATCC 26934、白僵菌ATCC 7159和ATCC 13144、Botryosphaeria obtusa IMI 038560、Calonectria decora ATCC 14767、螺卷毛壳ATCC 10195、山扁豆生棒孢ATCC 16718、短刺小克银汗霉ATCC 8688a、刺孢小克银汗霉ATCC 3655、雅致小克银汗霉ATCC9245、Curvularia clavata ATCC 22921、弯孢ACTT 12071、Cylindrocarpon radicicola ATCC 1011、Epicoccum humicola ATCC12722、卵形孢球托霉ATCC 22822、金孢菌寄生、深黄被孢霉ATCC42613、大毛霉ATCC 46Q5、灰蓝毛霉ATCC 1207A、疣孢漆斑菌ATCC9095、Nocardia corallina、Paecilomyces carneus ATCC 46579、展青霉ATCC 24550、Pithomyces atroolivaceus IFO 6651、Pithomycescynodontis ATCC 26150、Pycnosporium sp.ATCC 12231、红色糖多孢菌ATCC 11635、黄瘤孢ATCC 13378、Stachylidium bicolor ATCC12672、吸水链霉菌ATCC 27438、浅绛红链霉菌ATCC 25489、总状共头霉ATCC 18192、Thamnostylum piriforme ATCC 8992、Thielaviaterricola ATCC 13807和可可轮枝孢ATCC 12474。
预期显示11α羟化活性的其它生物包括Cephalosporiumaphidicola(Phytochemistry(1996)，42(2)，411-415)、Cochlioboluslunatas(J.Biotechnol.(1995)，42(2)，145-150)、Tieghemella orchidis(Khim.-Farm.Zh.(1986)，20(7)，871-876)、Tieghemella hyalospora(Khim.-Farm.Zh.(1986)，20(7)，871-876)、Monosporium olivaceum(Acta Microbiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)、焦曲霉(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)、禾本科镰孢(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)、灰绿轮枝孢(ActaMicrobiol.Pol.，Ser.B.(1973)，5(2)，103-110)和Rhizopus nigricans(J.Steroid Biochem.(1987)，28(2)，197-201)。
图1图示赭曲霉11α羟化酶的核苷酸序列和蛋白质序列(分别是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。图2图示人氧化还原酶的核苷酸序列和蛋白质序列(分别是SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。图3图示赭曲霉氧化还原酶的核苷酸序列和蛋白质序列(分别是SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)。
图4图示克隆在pMON45624中并与用BLAST在GenBank中发现的相关酶进行排列对比的赭曲霉11α羟化酶的氨基酸同一性排列对比。图5是图解显示该关系的系统树。图6显示赭曲霉类固醇11α羟化酶和使用BLAST在GenBank中发现的头10种酶之间用ClustalW和Boxshade计算得到的同一性百分率。
图7图示赭曲霉和人氧化还原酶与来自黑曲霉、小鼠和啤酒酵母(酵母)的NADPH细胞色素P450还原酶之间的氨基酸同一性。图8图示赭曲霉、黑曲霉和啤酒酵母氧化还原酶之间的氨基酸排列对比。图9是显示赭曲霉和人氧化还原酶与黑曲霉、酵母和小鼠的还原酶之间相关性的系统树。图10显示赭曲霉类固醇11α羟化酶与来自黑曲霉、酵母和小鼠的氧化还原酶之间用ClustalW和Boxshade计算得到的同一性百分率。
图11-人氧化还原酶与SwissPort头4位搜索结果的排列对比。图12图示展示人氧化还原酶与这些搜索结果的遗传相关性的系统树。图13显示人氧化还原酶与SwissPort头4位搜索结果之间的同一性百分率。
图14图示赭曲霉P450 11α羟化酶在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的免疫印迹，所述杆状病毒感染的昆虫细胞在感染后25小时和48小时收获。用缀合合成肽11aOH肽2(SEQ ID NO 24)免疫两只兔，然后用从所述两只兔制备的1∶1抗体混合物探测所述硝酸纤维素膜。
图15图示赭曲霉P450氧化还原酶在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的免疫印迹，所述杆状病毒感染的昆虫细胞在感染后25小时和48小时收获。用缀合合成肽oxr肽1(SEQ ID NO 26)免疫两只兔，然后用从所述两只兔制备的1∶1抗体混合物探测所述硝酸纤维素膜。
图16图示HPLC描图，该描图说明用从表达赭曲霉11α羟化酶和人氧化还原酶的杆状病毒感染的昆虫细胞制备的亚细胞部分温育雄甾烯二酮(AD)后，从AD到其11α羟化物的转化。
克隆技术可以使用本领域内目前标准的遗传工程技术(美国专利4,935,233和Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual”，Cold SpringHarbor Laboratory，1989)构建本发明的DNA序列。一种所述方法是盒式诱变(Wells等，Gene 34315-323，1985)，其中用合成寡核苷酸取代质粒内的部分编码序列，所述合成寡核苷酸编码两个限制位点间基因部分内的所需氨基酸取代。
可以制造编码所需基因的成对互补合成寡核苷酸，并使它们相互退火。所述寡核苷酸的DNA序列编码所需基因的氨基酸序，除那些在所述序列中受到取代和/或缺失的氨基酸外。
可以用选定限制性内切核酸酶处理质粒DNA，然后连接到所述退火的寡核苷酸。可以使用所述连接的混合物转化感受态大肠杆菌细胞，这将赋予合适的抗生素抗性。可以挑出单克隆，通过限制分析或DNA测序检查质粒DNA，鉴定具有所需基因的质粒。
可以通过使用中间载体完成编码新型蛋白和融合蛋白的DNA序列的克隆。可以使用接头和连接物连接DNA序列以及取代缺失的序列，其中限制位点在目标区之内。将编码单个多肽或融合蛋白(包括第一种多肽、肽接头和第二种多肽)的DNA插入合适的表达载体，然后将所述表达载体转化或转染进合适的细菌、真菌、昆虫或哺乳动物宿主细胞。培养转化的生物或宿主细胞，然后通过标准技术分离重组蛋白。重组融合蛋白具有全长或部分第一种蛋白，所述第一种蛋白通过接头区连接全长或部分第二种蛋白。
杂交编码11α羟化酶或氧化还原酶的核酸分子和片段核酸分子可以与其它核酸分子特异性杂交。假如两种核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，则称这两种核酸分子能够特异性相互杂交。假如一种核酸分子与另一种核酸分子显示完全的互补性，则称一种核酸分子是另一种核酸分子的“互补物”。当其中一种分子的每一个核苷酸与另一种分子的核苷酸相同，则这些分子表现“完全互补性”。假如两种分子能够以允许它们在至少常规“低严格性”条件下保持相互退火的足够稳定性相互杂交，则这两种分子“最小互补”。相似地，假如所述分子能够以允许它们在常规“高严格性”条件下保持相互退火的足够稳定性相互杂交，则所述分子“互补”。常规严格条件的描述见Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)和Haymes等，Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRLPress，Washington，DC，(1985)。因此，只要从完全互补性的偏离不完全防止所述分子形成双链结构的能力，则所述偏离是允许的。
促进DNA杂交的合适严格条件是本领域内技术人员众所周知的，或者可见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，(1989)。基本条件包括，例如，在约45℃的6X柠檬酸钠盐溶液(SSC)，然后在50℃用2X SSC洗涤。严格性可以如下改变例如，将洗涤步骤中的盐浓度从50℃约2X SSC(中低严格性)变为在50℃约0.2X SSC(高严格性)。也可以通过改变洗涤步骤中的温度而改变严格性，从室温约22℃(低严格性条件)改为约65℃(高严格性条件)。可以改变温度和盐，或者保持温度或盐浓度稳定，改变另一个变量。
表达载体本发明的另一方面包括用于表达这些新型羟化酶和氧化还原酶的质粒DNA载体。这些载体包含上文所述编码本发明新型多肽的新型DNA序列。转化能够表达羟化酶和氧化还原酶的微生物或细胞系的合适载体包括表达载体，所述表达载体包含编码羟化酶和氧化还原酶的核苷酸序列，并且该核苷酸序列连接根据所用宿主细胞选定的转录和翻译调节序列。
本发明包括如上文所述加入修饰序列的载体，所述载体用于生产羟化酶和氧化还原酶。在所述方法中使用的载体也包含有效连接本发明DNA编码序列的选定调节序列，所述调节序列能够指导所述DNA编码序列在选定宿主细胞中的复制和表达。
本发明的另一方面是生产羟化酶和氧化还原酶的方法。本发明的方法涉及培养合适的细胞或系统系，所述细胞或细胞系已经用包含编码新型羟化酶和氧化还原酶的DNA序列的载体转化。合适的细胞或细胞系可以是细菌细胞。例如，大肠杆菌的各种株是生物工程领域内众所周知的宿主细胞。所述株的例子包括大肠杆菌DH5α、DH10B和MON105株(Obukowicz等，Applied EnvironmentalMicrobiology 581511-1523，1992)。本发明还包括利用基于Mu噬菌粒的针对大肠杆菌的染色体表达载体表达羟化酶和氧化还原酶(Weinberg等，Gene，12625-33，1993)。在本方法中也可以使用细菌的各种其它株，包括肠细菌(如沙门氏菌(Salmonella sp.))和枯草芽孢杆菌(B.subtillis)。
当在大肠杆菌胞质内表达编码本发明蛋白的基因时，也可以构建所述基因以便在所述基因的5′末端加入密码子，在所述蛋白的N-末端编码Met-2-Ala-1、Met-2-Ser-1、Met-2-Cys-1或Met-1。在大肠杆菌胞质内制造的所述蛋白的N末端受到甲硫氨酸氨肽酶翻译后加工的影响(Ben Bassat等，J.Bacteriol.169751-757，1987)，并且有可能受到其它肽酶翻译后加工的影响，这样表达后切除N末端的甲硫氨酸。本发明的蛋白可以包括在N末端具有Met-1、Ala-1、Ser-1、Cys-1、Met-2-Ala-1、Met-2-Ser-1或Met-2-Cys-1的多肽。也可以通过在这些突变蛋白的N末端融合分泌信号肽，使这些突变蛋白在大肠杆菌中表达。作为分泌过程的一部分，从所述多肽切除所述信号肽。
酵母也可利用本领域内技术人员已知的多种酵母细胞株作为宿主细胞，表达本发明的多肽。在另一实施方案中，在酵母细胞，最好是啤酒酵母中表达本发明的蛋白或其片段。可以将本发明的蛋白或其片段融合到URA3、CYCl或ARG3基因的N末端，在啤酒酵母中表达(Guarente和Ptashne，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)782199-2203(1981)；Rose等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)782460-2464(1981)；和Crabeel等，EMBO J.2205-212(1983))，或者本发明的蛋白或其片段可以融合进PGK基因或TRP1基因(Tuite等，EMBO J.1603-608(1982)；和Dobson等，Nucleic Acids.Res.112287-2302(1983))。更优选本发明的蛋白或其片段作为成熟蛋白表达(Hitzeman等，Nature 293717-722(1981)；Valenzuela等，Nature 298347-350(1982)；和Derynck等，Nucleic Acids Res.111819-1837(1983))。
Romanos等，Yeast 8423-488(1992)已经综述适于在本发明中使用的天然和工程化酵母启动子。更优选本发明的蛋白或其片段由酵母细胞分泌(Blobel和Dobberstein，J.Cell Biol.67835-851(1975)；Kurjan和Herskowitz，Cell 30933-943(1982)；Bostian等，Cell 36741-751(1984)；Rothman和Orci，Nature 355409-415(1992)；Julius等，Cell32839-852(1983)；和Julius等，Cell 36309-318(1984))。
哺乳动物细胞在哺乳动物细胞中表达外源基因的通用方法已经有综述(Kaufman，R.J.，1987，“Genetic Engineering，Principles and Methods”，第9卷，J.K.Setlow，编辑，Plenum Press，New York；Colosimo等，Biotechniques 29314-331，2000)。假如存在信号肽，那么重组蛋白一般将靶向它们在宿主细胞内的天然位置(如胞质、核或各种膜区室)，或者分泌出细胞。构建表达载体，其中能够在哺乳动物细胞中发挥功能的强启动子驱动真核细胞分泌信号肽编码序列的转录，所述信号肽在翻译后连接到所需蛋白的编码区。例如，可以使用质粒如pcDNA I/Neo、pRc/RSV和pRc/CMV(从Invitrogen Corp.，San Diego，California获得)。所述真核细胞分泌信号肽编码序列可以来自所述基因本身或来自另一分泌性哺乳动物蛋白(Bayne，M.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842638-2642，1987)。在构建包含所述基因的载体后，将所述载体DNA转染进哺乳动物细胞如COS7、HeLa、BHK、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或小鼠L系。可以在例如DMEM培养基(JRHScientific)中培养所述细胞。转染细胞后，或选择抗生素抗性并随后建立稳定细胞系后，细胞瞬时表达24-72小时，然后通过标准生物化学方法回收分泌进培养基中的多肽。合适哺乳动物宿主细胞的选择和转化、培养、扩增、筛选和产物生产和纯化的方法是本领域内已知的。见，如，Gething和Sambrook，Nature，293620-625，1981，或者Kaufman等，Mol.Cell.Biol.，5(7)1750-1759，1985)或Howley等和美国专利第4,419,446号。其它合适的哺乳动物细胞系是猴COS-1细胞系和CV-1细胞系。
也可以使用哺乳动物细胞表达本发明的核酸分子。也可以将本发明的核酸分子克隆进合适的反转录病毒载体(见，例如，Dunbar等Blood 853048-3057(1995)；Baum等，J.Hematother.5323-329(1996)；Bregni等，Blood 801418-1422(1992)；Boris-Lawrie和Temin，Curr.Opin.Genet.Dev.3102-109(1993)；Boris-Lawrie和Temin，Annal.NewYork Acad.Sci.71659-71(1994)；Miller，Current Top.Microbiol.Immunol.1581-24(1992))、腺病毒载体(Berkner，BioTechniques 6616-629(1988)；Berkner，Current Top.Microbiol.Immunol.15839-66(1992)；Brody和Crystal，Annal.New York Acad.Sci.71690-103(1994)；Baldwin等，Gene Ther.41142-1149(1997))、RSV、MuSV、SSV、MuLV(Baum等，J.Hematother.5323-329(1996))、AAV(Chen等，Gene Ther.550-58(1998)；Hallek等Cytokines Mol.Ther.269-79(1996))、AEV、AMV或CMV(Griffiths等，Biochem.J.241313-324(1987)。
转化和转染在另一方面，本发明提供具有如下核酸分子的转化细胞所述核酸分子包含在细胞中起作用导致产生mRNA分子的外源启动子区，所述启动子区连接结构核酸分子，其中所述结构核酸分子编码11α羟化酶或氧化还原酶基因或它们的片段。该核酸分子连接3′非翻译序列，所述3′非翻译序列在细胞中起作用，导致在mRNA分子的3′末端终止转录和添加聚腺苷酸化核糖核苷酸。
用于转化真核细胞、细菌和其它微生物的方法和组合物是本领域内已知的(见，例如，Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，(1989)；Colosimo等，Biotechniques 29314-331，2000)。
将DNA引入细胞的技术是本领域内技术人员众所周知的。已经描述四种传递基因进入细胞的通用方法(1)化学方法(Graham和vander Eb，Virology 54536-539(1973))；(2)物理方法如显微注射(Capecchi，Cell 22479-488(1980))、电穿孔(Wong和Neumann，Biochem.Biophys.Res.Commun.107584-587(1982)；Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)825824-5828(1985)；美国专利第5,384,253号)、和基因枪(Johnston和Tang，Methods Cell Biol.43353-365(1994)；(3)病毒载体(Clapp，Clin.Perinatol.20155-168(1993)；Lu等，J.Exp.Med.1782089-2096(1993)；Eglitis和Anderson，Biotechniques，6608-614(1988))；和(4)受体介导的机制(Curiel等，Hum.Gen.Ther.3147-154(1992)，Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)896099-6103(1992))。也可以使用其它本领域内众所周知的方法。
可以使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔以及组合这些处理的方法完成转化(见，例如，Potrykus等，Mol.Gen.Genet.205193-200(1986)；Lorz等，Mol.Gen.Genet.199178(1985)；Fromm等，Nature 319791(1986)；Uchimiya等，Mol.Gen.Genet.204204(1986)；Marcotte等，Nature 335454-457(1988))。
已经发展出基于克隆核酸构建物的瞬时表达的基因表达测定通过聚乙二醇处理、电穿孔或粒子轰击将核酸分子引入细胞(Marcotte等，Nature 335454-457(1988)；McCarty等，Cell 66895-905(1991)；Hattori等，Genes Dev.6609-618(1992)；Goff等，EMBO J.92517-2522(1990))。可以使用瞬时表达系统在功能上仔细分析包含有效连接的遗传元件的表达盒的调节和结构特征。
昆虫细胞表达可以使用昆虫细胞作为宿主细胞，表达本发明的重组蛋白(见，例如，Luckow，V.A.，Protein Eng.J.L.Cleland.，Wiley-Liss，New York，NY183-218，1996和该文中引用的参考文献)。已经描述使用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达外源基因的通用方法(O’Reilly，D.R.，L.K.Miller等Baculovirus Expression VectorsA Laboratory Manual.NewYork，W.H.Freeman and Company，1992；和King，L.A.和R.D.Possee，The Baculovirus Expression SystemA Laboratory Guide，London，Chapman & Hall)。
将能够通过同源重组整合入杆状病毒基因组的所需基因(如11α羟化酶或氧化还原酶)插入杆状病毒转移载体，构建杆状病毒表达载体。许多转移载体使用强杆状病毒启动子(如多角体蛋白启动子)驱动所需基因的转录。通过将真核细胞分泌信号肽编码区与所需基因的编码区融合，一些载体允许表达融合蛋白或指导蛋白从细胞的分泌。例如，可以使用质粒pVL1393(从Invitrogen Corp.，San Diego，California获得)指导非融合外源基因在杆状病毒感染的昆虫细胞中的转录。将包含所需基因的杆状病毒转移载体与环状或线性化基因组杆状病毒DNA一起转染进秋粘虫(Sf9)昆虫细胞，并在一次或多次噬菌斑测定后纯化和扩增重组杆状病毒。
也可以使用杆状病毒穿梭载体系统产生重组杆状病毒(Luckow，V.A.等，J.Virol.67(8)4566-4579，1993；美国专利第5,348,886号)，所述杆状病毒穿梭载体系统目前市场上有Bac-To-BacTM表达系统(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)。将所需基因插入mini-Tn7表达盒内多角体蛋白启动子的下游，所述mini-Tn7表达盒体内转座进入杆状病毒穿梭载体基因组，该基因组在大肠杆菌内增殖。从大肠杆菌分离复合病毒DNA，将所述DNA转染进Sf9细胞，然后快速制备重组杆状病毒的贮液，而不必采用依赖于同源重组的方法所普遍应用的多轮繁重的噬菌体纯化。
也可以使用Gateway重组克隆系统(Life Technologies)产生重组杆状病毒，所述重组克隆系统使用修饰遗传元件(附着位点)和涉及λ噬菌体位点特异性整合和切割的修饰蛋白(如int、IHF、xis)将基因在载体之间传送。
使用携带所述11α羟化酶或氧化还原酶基因的纯重组杆状病毒感染细胞，所述细胞在例如Excell 401无血清培养基(JRH Biosciences，Lenexa，Kansas)或Sf900-II(Life Technologies)中培养。可以使用标准方法制备定位到膜的羟化酶或氧化还原酶，所述标准方法分级分离并浓缩在线粒体或微粒体部分内的酶(Engel和White，Dev Biol.140196-208，1990)。也可以通过标准生物化学方法回收分泌或渗漏入培养基的羟化酶和氧化还原酶。
可以通过两种通用方法在杆状病毒感染的昆虫细胞中同时表达两种或多种重组蛋白。最简单的方法是用重组杆状病毒的已滴定贮液共感染昆虫细胞，所述重组杆状病毒携带在强杆状病毒启动子如多角体蛋白启动子或p10启动子控制下的单个异源基因。在感染晚期，当大多数宿主细胞蛋白合成已经中断时，这些启动子高度转录。也可以使用早期杆状病毒启动子或其它昆虫或真核细胞启动子指导其它时间的合成，这通常导致更低的表达水平。通过改变在共感染中使用的两种或多种重组病毒的比例或选择使用不同启动子驱动所述重组蛋白表达的病毒，将允许本领域内技术人员选择适于优化表达所需重组蛋白的条件。
构建双表达载体或多表达载体也将允许在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达两种或多种重组蛋白。通常这些载体允许将两个或多个基因盒引入杆状病毒基因组内的单一基因座。已经描述多种双表达载体的结构(O’Reilly，D.R.，L.K.Miller等Baculovirus ExpressionVectorsA Laboratory Manual.New York，W.H.Freeman and Company，1992；和King，L.A.和R.D.Possee，The Baculovirus Expression SystemA Laboratory Guide，London，Chapman & Hall)。
材料和方法通用方法克隆、表达和表征蛋白的通用方法可见T.Maniatis等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1982以及该文引用的参考文献，所述文献通过引用结合到本文中；和J.Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，1989以及该文引用的参考文献，所述文献通过引用结合到本文中。已经公开多种克隆和表达载体的一般特征和图谱(Gacesa，P.和Ramji，D.P.，VectorsEssential Data，John Wiley &Sons，1994)。在哺乳动物细胞中克隆和表达基因的通用方法也可见Colosimo等，Biotechniques 29314-331，2000。构建、操作和分离多克隆和单克隆抗体的通用和具体条件和方法是本领域内众所周知的(见，例如，Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，1988)。
除专门指出外，从Sigma(St.Louis，MO)获得所有专用化学品。从Life Technologies(Rockville，MD)、New England Biolabs(Beverly，MA)、Roche Molecular Biochemicals(Indianapolis，IN)或Promega(Madison，WI)获得限制性内切核酸酶和T4 DNA连接酶。除特别指出外，所有组份采用重量单位，温度以摄氏温度(℃)表示。
菌株、质粒和序列表在这些研究中使用的细菌菌株列于表1。本研究中使用或构建的质粒列于表2。相关寡核苷酸、基因或蛋白序列的简要描述列于表3。
表1菌株命名描述或基因型 参考文献/来源DH5αTMF-，phi80 dlacZdeltaM15，Life Technologies，delta(lacZYA-argF)U169，deoR，Rockville，MarylandrecA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，lambda-，thi-1，gyrA96，relA1DH10BTMF-，mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) Life Technologies，phi80 Rockville，MarylanddlacZDM15DlacX74endA1recA1 deoR D(ara，leu)7697araD139 galU galK nupG rspLDH10BacTM携带杆状病毒穿梭载体 Life Technologies，bMON14272(KanR)和辅助质粒Rockville，Maryland；pMON7124(TetR)的DH10B另见Luckow等，J.
Virol.674566-4579(1993)
表2质粒质粒 SEQ ID 标记描述 来源NO.
pFastBac1AmpR杆状病毒供体质粒，包含在 LifeGentRmini-Tn7转座因子内AcNPV Technologies多角体蛋白启动子下游的多 Inc.(Rockville，克隆位点，该转座因子能够 MD)；另见转座到杆状病毒穿梭载体 Luckow等，J.
Virol.674566-4579(1993)pBluescript II AmpR得自pUC19的多功能噬菌Stratagene，LaSK 粒克隆载体 Jolla，CApCRII-TOPO AmpR用于使用T突出端直接克隆 Invitrogen，KanR聚合酶链反应产物的多功能 Carlsbad，CA克隆载体pSport1 AmpR用于克隆和从任一条链使用 LifeSP6或T7启动子体外转录Technologies，的多功能克隆载体 Rockville，MDpGEM-T AmpRpGEM-5Zf(+)的衍生物，在 Promega，插入位点有单5′T突出端以 Madison，WI改善PCR产物连接的效率PMON45624 #1 AmpRpFastBacl EcoRI/XbaI+编 本研究GentR码赭曲霉11α羟化酶的PCR片段EcoRI/XbaIpMON45603AmpRpBluescriptII SK 本研究BamHI/HincII+人氧化还原酶的BamHI/HincII 5′区pMON45604AmpRpBluescriptII SK HincII/KpnI 本研究+人氧化还原酶的HincII/KpnI 3′区pMON45605 #3 AmpRpFastBacl BamHI/KpnI+人 本研究GentR氧化还原酶cDNA的BamHI/KpnI完整编码区
pMON45630AmpRpCRII-TOPO SalI/BamHI+ 本研究KanR赭曲霉氧化还原酶cDNA的SalI/BamHI 5′区pMON45631AmpRpCRII-TOPO BamHI/XhoI+ 本研究KanR没有内含子的赭曲霉氧化还原酶cDNA BamHI/XhoI 3′区pMON45632 #5 AmpRpFastBacl SalI/XhoI+包含本研究GentR赭曲霉氧化还原酶装配编码区表3序列表SEQ ID NO 描述 长度/序列类型(SEQ ID NO01) pMON45624的赭曲霉11αOH1776 DNA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO02) pMON45624的赭曲霉11αOH514蛋白质蛋白序列(SEQ ID NO03) pMON45605的人氧化还原酶2031 DNA基因的核苷酸序列(SEQ ID NO04) pMON45605的人氧化还原酶677蛋白质蛋白序列(SEQ ID NO05) pMON45632的赭曲霉氧化还2322 DNA原酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO06) pMON45632的赭曲霉氧化还705蛋白质原酶蛋白序列(SEQ ID NO07) 引物人氧化还原酶1A GatcggatccaatATDNAGGGAGACTCCCACGTGGACAC(SEQ ID NO08) 引物人氧化还原酶1B CAGCTGGTTGADNACGAGAGCAGAG(SEQ ID NO09) 引物人氧化还原酶2A CTCTGCTCTCGDNATCAACCAGCTG(SEQ ID NO10) 引物人氧化还原酶2B gatcggtaccttaGCT DNA
CCACACGTCCAGGGAGTAG(SEQ ID NO11) 引物曲霉氧化还原酶-for1GACGGIGCIGG DNATACAATGGA(SEQ ID NO12) 引物曲霉氧化还原酶-rev1TTAIGACCAIACDNAATCITCCTGGTAGC(SEQ ID NO13) 引物pSport-for1CAAGCTCTAAT DNAACGACTCACTATAGGGA(SEQ ID NO14) 引物曲霉氧化还原酶-rev2VAGGAACCGA DNATCGACCTCGGAA(SEQ ID NO15) 引物曲霉氧化还原酶-rev3GTCACCCTCAC DNACAGCAGAGCCAATG(SEQ ID NO16) 引物曲霉氧化还原酶-rev4CCACATTGCGA DNAACCATAGCGTTGTAGTG(SEQ ID NO17) 引物pSport-for2GCCAAGCTCTAATACGACTCACTATAGGGAAAGC(SEQ ID NO18) 引物曲霉氧化还原酶-for2gtcgacATGGCGC DNAAACTCGATACTCTC(SEQ ID NO19) 引物曲霉氧化还原酶-rev5ctcgagttaGGACC DNAAGACATCGTCCTGGTAG(SEQ ID NO20) 引物曲霉氧化还原酶-for3GGATCCCTCGC DNAGACCTGTGATCAT(SEQ ID NO21) 引物曲霉氧化还原酶-for4CGAAGATTTCT DNATGTACAAGGATGAATGGAAGACTTTTC(SEQ ID NO22) 引物曲霉氧化还原酶-rev6CTGAAAAGTCT DNA
TCCATTCATCCTTGTACAAGAAATC(SEQ ID NO23) 11αOH肽1 AAAYWLATLQ 蛋白质PSDLPELN(SEQ ID NO24) 11αOH肽2 CRQILTPYIHKR蛋白质KSLKGTTDE(SEQ ID NO25) 11αOH肽3 HMGFGHGVHA 蛋白质CPGRFFASENI(SEQ ID NO26) oxr肽1 CTYWAVAKDP 蛋白质YASAGPAMNG(SEQ ID NO27) CAA75565；细胞色素P450单 蛋白质加氧酶[藤仓赤霉](SEQ ID NO28) CAB91316；可能的细胞色素 蛋白质P450单加氧酶(lovA)[粗糙脉孢菌](SEQ ID NO29) CAB56503；细胞色素P450 蛋白质[Catharanthus roseus](SEQ ID NO30) AAB94588；CYP71D10p蛋白质[Glycine max](SEQ ID NO31) CAA75566；细胞色素P450单 蛋白质加氧酶[藤仓赤霉](SEQ ID NO32) AAD34552；细胞色素P450单 蛋白质加氧酶[土曲霉](SEQ ID NO33) CAA75567；细胞色素P450单 蛋白质加氧酶[藤仓赤霉](SEQ ID NO34) CAA76703；细胞色素P450 蛋白质[藤仓赤霉](SEQ ID NO35) CAA57874；未命名的蛋白产 蛋白质物[尖镰孢](SEQ ID NO36) CAA91268；类似于细胞色素 蛋白质P450-cDNA EST yk423b11.3，来自该基因；[Caenorhabditiselegans](SEQ ID NO37) BAA02936 NADPH细胞色素 蛋白质
P450还原酶前体[啤酒酵母](SEQ ID NO38)CAA81550 NADPH细胞色素 蛋白质P450氧化还原酶[黑曲霉](SEQ ID NO39)BAA04496 NADPH细胞色素 蛋白质P450氧化还原酶[小家鼠](SEQ ID NO40)通用噬菌体M13反向引物 CAG GAA ACA DNAGCT ATGAC(SEQ ID NO41)通用噬菌体T7启动子引物 TAA TAC GAC DNATCA CTA TAGGG(SEQ ID NO42)赭曲霉引物11αOH-forgatcgaattcATGCC DNACTTCTTCACTGGGCT(SEQ ID NO43)赭曲霉引物11αOH-revgatctctagattacacag DNAttaaactcgccaTATCGAT(SEQ ID NO44)pFastBacl引物Bacfwd CTGTTTTCGTA DNAACAGTTTTG(SEQ ID NO45)pFastBacl引物PolyA CCTCTACAAAT DNAGTGGTATG(SEQ ID NO46)赭曲霉引物45624-for1GAGATCAAGA DNATTGCCTT(SEQ ID NO47)赭曲霉引物45624-for2CTTCGACGCTC DNATCAA(SEQ ID NO48)赭曲霉引物45624-rev1GCAATCTTGAT DNACTCGTT(SEQ ID NO49)S90469人细胞色素P450还原2403 DNA酶[胎盘，部分mRNA，2403nt](SEQ ID NO50)AAB21814人细胞色素P450 676 DNA还原酶，胎盘，部分(SEQ ID NO51)A60557人NADPH-高铁血红 677 DNA素蛋白还原酶(SEQ ID NO52)P16435人NADPH-细胞色素 677 DNAP450还原酶(SEQ ID NO53)p00389兔NADPH-细胞色素 679 蛋白质
P450还原酶(SEQ ID NO54)p00388大鼠NADPH-细胞色 678 蛋白质素P450还原酶(SEQ ID NO55)p37040小鼠NADPH-细胞色 678 蛋白质素P450还原酶(SEQ ID NO56)p04175猪NADPH-细胞色素 678 蛋白质P450还原酶(SEQ ID NO57)通用噬菌体SP6引物 gatttaggtgacactata DNAg(SEQ ID NO58)NotI-poly-dT连接物 5′- DNApGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)15-3′(SEQ ID NO59)SalI连接物，上链5′- DNATCGACCCACGCGTCCG-3′(SEQ ID NO60)SalI连接物，下链5′- DNAGGGTGCGCAGGCp-3′(SEQ ID NO61)引物氧化还原酶1CGTGGACCACA DNAAGCTCGTACTG(SEQ ID NO62)引物氧化还原酶2CCATCGACCACC DNATGTGTGAGCTG(SEQ ID NO63)引物氧化还原酶2DGTACAGGTAGT DNACCTCATCCGAG(SEQ ID NO64)黑曲霉NADP CYP450氧化还 3710 DNA原酶Z26838(SEQ ID NO65)黑曲霉NADP CYP450氧化还 693 蛋白质原酶CAA81550具体方法转化大肠杆菌株大肠杆菌菌株如DH5α和DH10B(Life Technologies，Rockville，MD)常规用于转化连接反应产物，并且是制备用于转染哺乳动物细胞的质粒DNA的宿主。大肠杆菌菌株如DH10B和MON105(Obukowicz等，Appl.and Envir.Micr.，581511-1523，1992)可以用于在胞质或壁膜间隙中表达本发明的蛋白。
购买感受态DH10B和DH5α亚克隆效率细胞，用生产商的方法使其准备接受转化。使用CaCl2方法使其它大肠杆菌菌株处于能够摄取DNA的感受态。通常在LB培养基(1％细菌用胰蛋白胨，0.5％细菌用酵母提取物，150mM NaCl)中培养20-50mL细胞，直到使用Baush& Lomb Spectronic分光光度计(Rochester，NY)在600纳米(OD600)测得约1.0吸光度的密度。离心收集细胞，重悬浮于五分之一体积的CaCl2溶液[50mM CaCl2，10mM Tris-Cl(10mM 2-氨基-2-(羟甲基)1，3-丙二醇盐酸盐，pH7.4)]，然后在4℃保持30分钟。再次离心收集细胞，重悬浮于十分之一体积的CaCl2溶液。在0.1ml这些细胞中加入连接的DNA，所述样品在4℃保持30-60分钟。所述样品转移到42℃45秒钟，加入1.0ml LB，然后在37℃振荡所述样品一小时。将来自这些样品的细胞铺展在含抗生素的平板(LB培养基加1.5％细菌用琼脂)，所述抗生素在选择氨苄青霉素抗性转化子时使用氨苄青霉素(100微克/mL，ug/ml)，在选择壮观霉素抗性转化子时使用壮观霉素(75ug/ml)。所述平板在37℃温育过夜。挑取集落并接种到添加合适抗生素(100ug/ml氨苄青霉素或75ug/ml壮观霉素)的LB，37℃下振荡培养。
DNA分离和表征可以使用多种不同和使用本领域内技术人员已知的商业化试剂盒分离质粒DNA。使用Promega WizardTMMiniprep试剂盒(Madison，WI)、Qiagen QIAwell质粒分离试剂盒(Chatsworth，CA)或QiagenPlasmid Midi或Mini试剂盒分离质粒DNA。这些试剂和使用分离质粒DNA的相同通用方法。简要地说，离心(5000xg)沉淀细胞，通过顺序NaOH/酸处理释放质粒DNA，然后离心(10000xg)除去细胞碎片。上清液加载到含DNA结合树脂的柱子，洗柱，并洗脱质粒DNA。用目标质粒筛选集落后，将所述大肠杆菌细胞接种进添加合适抗生素的50-100ml LB，在空气培养箱中37℃下振荡培养过夜。所纯化的质粒DNA用于DNA测序、其它限制酶消化、其它DNA片段的亚克隆以及转染进大肠杆菌、哺乳动物细胞或其它细胞类型。
DNA测序方法将纯化的质粒DNA重悬浮于dH2O，用Baush and Lomb Spectronic601UV分光光度计在260/280nm测量吸光度，确定其浓度。使用ABIPRISMTMDyeDeoxyTM终止测序化学(Applied Biosystems Division ofPerkin Elmer Corporation，Lincoln City，CA)试剂盒(部件号码401388或402078)，根据厂家建议的方法对DNA样品进行测序。有时在重复试验中在所述混合物中加入5％DMSO，以便利困难模板的测序。
使用DNA热循环仪(Perkin Elmer Corporation，Norwalk，CT)，根据推荐的扩增条件进行测序反应。在薄壁0.2mL PCR管中制备DNA样品加入500ng模板DNA和100ng选定引物，用Millipore mili-Q(mQ)水调到12uL。在每管中加入2uL 2mM Mg++。管在Perkin-ElmerSystem 9700热循环仪中96℃下变性5分钟。变性后，通过热循环仪将所述管冰冻到4℃。在每管中加入6ul ABI Prism Big Dye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit。将所述样品返回热循环仪，使用下面程序循环测序(1)96℃30秒钟；(2)50℃5秒钟；(3)60℃4分钟，随后重复步骤(1)24个循环，然后在4℃保持。约2.5小时后完成循环测序。
样品用CentriSepTM离心柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)纯化除去多余的染料终止物，或者通过已经充满25uL Sephadex G-50超精细树脂和300uL mQ水的Millipore MAHV N45 50 Multiscreen-HV过滤板进行纯化。过滤板在750xg离心2分钟，除去多余水份，然后将样品加载到该板上。将所述样品加载到树脂上，然后再次在750xg离心该板4分钟。将所述样品收集到96孔板，该板离心时直接放到所述填充Sephadex的板下。使用Speed Vac在室温下干燥所述96孔板内的液体。45-60分钟后，DNA干燥并沉淀在板底部。样品重悬浮于3uL甲酰胺/蓝色Dextran加样染料，加热2分钟(见Perkin-ElmerBig Dye说明书第33页关于加样缓冲液的配方)。将样品加载到48cmwell-to-read长度4.5％丙烯酰胺凝胶上，使用ABI自动化DNA测序仪测序7小时(一般运行模式为Seq Run 48E-1200和染料设置DT，Program BD，Set Any-Primer)。
使用Sequencher DNA Analysis软件(Gene Codes Corporation，AnnArbor，MI)或Perkin-Elmer Data Collection and Sequence Analysis程序分析重叠的DNA序列，装配成母DNA重叠群，以便将碱基分配到所收集的数据。
BLAST、ClustalW和Boxshade同源性排列对比工具可以使用多种程序在核苷酸序列或肽序列之间进行排列对比以及便利在大序列数据库内的同源性搜索。BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)应用Karlin和Altschul的统计学配对理论(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877，1993)，是广泛应用的快速鉴定匹配给定查询序列的无缺口核苷酸亚序列或肽亚序列的程序(可以从National Center forBiotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov获得)。BLAST使用查找局部排列对比而不是全体排列对比的探试性算法，因此能够检测仅共有分离区域相似性的序列之间的关系(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410，1990)。
可以改变影响BLAST搜索结果的灵敏度和数量的两个参数。参数B(默认值10)调节结果中报道的高分区段对(排列对比)的数目。参数V(默认值10)是提供一行描述的数据库序列(搜索结果)的最大数目。配对基于高分区段对(HSP)。假如HSP被缺口分开，那么两个序列可能共有超过一个HSP。BLAST算法对序列中的双关性(ambiguity)敏感，并不适于包含许多缺口的序列。
程序blastp比较氨基酸查询序列以及蛋白质序列数据库。blastn比较核苷酸查询序列以及核苷酸序列数据库。blastx比较翻译出所有可读框的核苷酸查询序列以及蛋白质序列数据库。可以使用该选项查找未知核苷酸序列的可能翻译产物。tblastn比较蛋白质查询序列以及动态翻译所有可读框的核苷酸序列数据库。tblastx比较核苷酸查询序列的六框翻译物以及核苷酸序列数据库的六框翻译物(见http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/，可以获得关于BLAST、相关程序和模式匹配算法的更多信息)。
使用BLAST，分数＝98-557，字长514字进行核苷酸搜索，获取与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。使用BLASTP，分数＝50，字长3进行蛋白质搜索，获取与参考多肽(如SEQ ID NO2)同源的氨基酸序列。
Clustal W版本1.74应用不同算法进行多种DNA或蛋白质序列的排列对比，该程序也用于进行排列对比和分配不同序列之间的同一性百分率。该程序通过赋予序列权重、位置特异性缺口罚分和加权矩阵选择而改善渐进的多序列排列对比的灵敏度(Thompson等，Nucleic Acids Research，22(22)4673-4680，1994)。使用版本1.74默认的参数以便利排列对比和获得两个序列之间的同一性百分率。输入是FASTA格式的序列，输出是以图显示的排列对比。对于核酸序列，使用iub DNA加权矩阵。对于氨基酸序列，使用blosum蛋白质加权矩阵(见http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/，获得关于BLAST、相关程序和模式匹配算法的更多信息)。
Boxshade v 3.31是从多个排列的蛋白质或DNA序列产生精密格式打印输出的公共领域程序。Boxshade本身并不产生排列对比，但对以前通过其它序列排列对比程序产生的文件进行阴影和着色(coloring)。Boxshade的输入是通过ClustalW产生的排列对比以及需要着色或阴影的残基的域值。除具体指出外，在大多数情况下，使用50％的同一性值。使用该设置，假如在一个位置上有半数序列或超过半数序列共有相同残基，则在该位置增加暗度。可以从KayHofmann(khofmann@isrecsunl-unil.ch)或Micheal D.Baron(micheal.baron@bbsrc.ac.uk)通过ftp到ftp或通过电子邮件获得Boxshade。
蛋白纯化和表征可以使用多种色谱方法中的任何一种完成蛋白纯化，所述色谱方法如离子交换、凝胶过滤或疏水层析或反相HPLC。在一些情况下，可以使用亲和试剂亲和纯化正确折叠的蛋白，所述亲和试剂例如附着到合适基质上的单克隆抗体或受体亚单位。这些蛋白纯化方法和其它方法在下面文献中详细描述Methods in Enzymology，第182卷“Guide to Protein Purification”Murray Deutscher编辑，AcademicPress，San Diego，California，1990。
可以通过RP-HPLC、电喷射质谱和SDS-PAGE分析纯化的蛋白。通过氨基酸组成、RP-HPLC和/或Bradford蛋白染料结合测定进行蛋白定量。在一些情况下，联合进行胰蛋白酶肽作图和电喷射质谱，确认蛋白的身份。
实施例下面实施例将更详细地举例说明本发明，但应当理解本发明不限于这些具体的实施例。阅读本公开内容后，不偏离本发明精神和范围的各种其它实施例对于本领域内技术人员是明显的。所有这样的其它实施例将包括在所附权利要求的范围内。
实施例1-制备赭曲霉孢子用于提取RNA在含孢子形成培养基的平板上培养赭曲霉ATCC 18500贮液培养物(50ul)3-4天，所述孢子形成培养基含50g/L糖蜜，5g/L玉米浆，5g/L KH2PO4，25g/L NaCl，25g/L葡萄糖，20g/L琼脂和0.4g/L孕酮，pH5.8。在培养基中包括孕酮以诱导类固醇11α羟化酶。从平板刮下孢子，加入5到7ml盐水，在盐水中洗涤，离心收集，然后重悬浮于含15％甘油的盐水。所述孢子在干冰上冰冻，保存于-80℃。将约0.8g孢子在30℃下接种到盛有400ml 1％葡萄糖，50mM KH2PO4和0.1g坎利酮，pH7.0的瓶中。在破碎孢子前的该处理有三个好处(1)通过与坎利酮温育，诱导类固醇11α羟化酶；(2)确定所述孢子是否催化坎利酮的11α羟化；(3)软化孢子壁。在30℃下振荡温育约26小时以提供更好通气，然后离心收集孢子。使用显微镜的目视检查显示非常少的孢子开始萌发。所述孢子沉淀在液氮中瞬间冻结，保存于-80℃。通过HPLC分析培养基中11α羟基坎利酮的存在，确定用于构建文库的孢子是否显示所需活性。
实施例2-赭曲霉孢子催化坎利酮的11α羟化用70ml乙酸乙酯萃取从孢子诱导获得的约160ml培养基三次，收集类固醇底物和产物。有机相在无水硫酸镁上干燥、过滤、然后蒸发到干。将残余物溶解于8ml甲醇，这样坎利酮的终浓度是约15mM(假设定量回收)。所述培养基提取物在50％甲醇中稀释10到15倍，进行HPLC分析。在甲醇中制备坎利酮和11α-羟基坎利酮的贮液。用50％甲醇将这些贮液稀释到终浓度750uM，制备用于HPLC分析的标准。在C-4反相HPLC柱上色谱分离培养基提取物和标准品。根据在254nm处的监测(数据未显示)，培养基包含一种保留时间与11α羟基坎利酮标准品的保留时间相同的成份。
实施例3-培养赭曲霉菌丝体用于提取RNA28℃下，在体积为160ml的培养基中培养赭曲霉菌丝体的液体培养物72小时，所述培养基含10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物和10g/L葡萄糖，20g/L坎利酮。过滤10ml细胞样品，用冷水洗涤，冰冻，然后保存在-80℃。
实施例4-从诱导的孢子提取总RNA使用3110型Mini-BeadbeaterTM(Biospec Products，Bartlesville，OK)在40ml Trizol试剂(Life Technologies，Rockville，MD)中破碎约0.4g孢子。简要地说，在低速度四次30秒脉冲处理孢子-Trizol混合物。在脉冲之间，在冰上冰冻含孢子的管。使用显微镜进行的目测检查显示该处理破碎大多数孢子。低速离心，沉淀碎片，使用Trizol根据厂家建议的方法提取上清液中的总RNA。简要地说，在11ml聚丙烯离心管中，每10ml Trizol加入2ml氯仿。萃取蛋白3分钟后，通过离心分离相，将包含RNA的水相转移到干净的管中，用等体积异丙醇沉淀。通过离心回收沉淀的RNA，然后用70％乙醇洗涤。所述RNA重悬浮于10ml水，用氯仿再萃取，然后用乙醇在-20℃沉淀过夜。通过离心回收总RNA(3mg)，在2ml水中再水化，然后加入等体积冷的4M氯化锂，在冰上沉淀。使用该沉淀步骤除去DNA、糖类、血红素和从胍方法带来的其它杂质。通过25分钟离心回收RNA。
实施例5-从诱导的菌丝体提取总RNA用在干冰中预冷的研钵和研杵，在液氮内磨碎约0.5g湿重细胞成为精细的粉末。将所述粉末加入10ml Trizol试剂(LifeTechnologies)，用Kinematica polytron(Kinematica AG，Lucerne，Switzerland)按设置#4均质化。离心除去细胞碎片，然后用氯仿萃取。用异丙醇在室温下沉淀含核酸的水相10分钟。离心收集沉淀物，用70％乙醇洗涤。在水中再水化RNA，用氯仿再萃取以除去任何残余蛋白。在-20℃下用1/10体积3M乙酸钠和2.5倍体积无水乙醇沉淀水相。最终产量是424ug。在1.2％琼脂糖凝胶上通过电泳分离约4ug和16ug总RNA，然后通过在溴化乙锭中染色而可视化。存在微量染色体DNA污染。
实施例6-从HepG2细胞提取总RNA肝细胞人肝癌细胞(HepG2)ATCC HB-8065保持在补充Penstrep、谷氨酸和10％胎牛血清(Life Technologies，Rockville，MD)的DMEM高葡萄糖培养基中。用0.05％乙醇诱导细胞过夜，通过胰蛋白酶化收获用于提取RNA。简要地说，将细胞沉淀重悬浮于＞10X体积的4M异硫氰酸胍，50mM Tris-HCl，pH7.5，25mM EDTA(溶液D，Life Technologies)，然后搅拌。加入水和乙酸钠，pH4.1，乙酸钠最终浓度为0.1M。用一半体积氯仿萃取所述RNA溶液，然后置于冰上15分钟。用氯仿再次萃取水相，然后用异丙醇沉淀过夜。将总RNA重悬浮于溶液D，用异丙醇再沉淀，然后在含0.3M乙酸钠pH5.5的水中和2.5倍体积乙醇中两次沉淀。如下进行PolyA+选择两次。
实施例7-mRNA的PolyA+选择用Eppendorf 5Prime，Inc.试剂盒(Boulder CO)从总RNA中选择PolyA+RNA。简要地说，每1mg总RNA在含寡聚dT纤维素的柱上选择两次。温和离心，装填柱浆，然后用0.5M NaCl平衡。在室温下使RNA结合dT纤维素15分钟。柱子用0.5M NaCl洗一次，用0.1M NaCl洗两次。在0.5ml 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH7.5中洗脱PolyA+RNA。用寡聚dT纤维素的选择进行两次。用0.3M乙酸钠的50％乙醇溶液在-20℃下沉淀mRNA，其中加入糖元作为载体。
实施例8-cDNA合成和文库构建使用cDNA合成的SuperscriptTM质粒系统和质粒克隆试剂盒(LifeTechnologies)进行cDNA合成和文库构建。42℃下Superscript II反转录酶在20ul反应物中催化cDNA第一条链的合成。最终组合物是50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，10mM DTT，50uM每种dATP、dCTP、dGTP和dTTP，50ug/ml在它们的5′末端磷酸化的寡聚-dT-NotI引物-连接物(Life Technologies)和50,000单位/mlSuperscript II反转录酶。
寡聚-dT-NotI引物-连接物5′ - pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCC(T)23-3′(SEQ ID NO58)SpeI XbeINruI NotI未加入放射性标记的示踪物([α-32P]dCTP)。在150ul反应体积内合成cDNA的第二条链。所述混合物的最终组合物包括第一条链反应物，以及25mM Tris-HCl，pH7.5，100mM KCl，5mM(NH4)2SO4，0.15mM B-NAD+，250uM每种dATP、dCTP、dGTP和dTTP，1.2mMDTT，65单位/ml大肠杆菌DNA连接酶，250单位/ml大肠杆菌DNA聚合酶I和13单位/ml大肠杆菌Rnase H。在16℃温育2小时后，加入10单位T4 DNA聚合酶，在16℃温育5分钟。用10ul 0.5M EDTA终止反应，用GENECLEAN II(BIO 101 Inc.La Jolla，CA)将所述cDNA与小于300碱基对的cDNA、引物连接物和脱氧核苷酸分离开。将在5′平端磷酸化的退火SalI连接物(Life Technologies)在16℃下连接到所述cDNA过夜。
SalI连接物5′-TCGACCCACGCGTCCG -3′(SEQ ID NO59)3′-GGGTGCGCAGGCp-5′(SEQ ID NO60)使用GENECLEAN II去除所述连接物。然后用NotI消化所述cDNA。使用QIAquick柱(QIAGEN，Valencia，CA)从乙醇沉淀的cDNA中去除小DNA片段。
实施例9-cDNA的大小分级分离使用TAE缓冲液中的0.8％Sea-Plaque琼脂糖(FMC BioProducts，Rockland ME)通过凝胶电泳富集约1.5kb和更大的cDNA。制备型凝胶有一道DNA大小标记，电泳后将该标记从凝胶上切下，用溴化乙锭染色，在紫外光下对照直尺目视检查，以便能够可以从所述凝胶回收所述cDNA的合适区。使用GENECLEAN II提取cDNA，然后在20ul水中洗脱。
实施例10-在载体pSport1中构建文库并电穿孔进大肠杆菌在20ul反应物中，将等分量根据大小选择的cDNA与用NotI和SalI预消化的pSport1(Life Technologies，Inc.，Rockville，MD)在4℃下连接过夜，在20ul反应物中包含50mM Tris-HCl，pH7.6，10mMMgCl2，1mM ATP，5％(w/v)PEG 8000，1mM DTT，2.5ug/ml pSport1，约0.5ug/ml cDNA和50单位/ml T4 DNA连接酶。加入12.5ul 7.5M乙酸铵、5ul酵母tRNA载体和70ul无水乙醇，沉淀所述连接反应混合物。室温下离心20分钟，回收连接的cDNA，然后在5ul无菌水中再水化。通过电穿孔将1ul所述连接的cDNA引入ElectroMAXDH10B大肠杆菌(Life Technologies)。使细胞在1ml SOC培养基(LifeTechnologies)上37℃下恢复1小时，然后等分量接种在含100ug/ml氨苄青霉素的LB上。通过用SOC制备细胞悬浮液的顺序稀释物，确定所述赭曲霉孢子文库(命名为LIB3025)的滴度。接种1ul、0.1ul和0.01μl的细胞悬浮液样品，经计算，获得的滴度是1.75×106/ml集落形成单位。
实施例11-通过DNA序列分析鉴定编码细胞色素P450酶的集落，构建编码赭曲霉11α羟化酶的质粒pMON45624从赭曲霉克隆11α羟化酶在含100ug/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择约2,000个集落，制备小量制备的质粒DNA样品用于测序。从已表达序列标记(EST)的3′末端进行单向测序，所述已表达序列标记开始于NotI位点，包括用于合成cDNA的部分寡聚dT引物。使用两种通用引物便利所述测序M13反向 CAG GAA ACA GCT ATC AC(SEQ ID NO40)T7启动子TAA TAC GAC TCS CTA TAG GG(SEQ ID NO41)
众所周知的细胞色素p450包含一个保守血红素结合区，该区约50个氨基酸残基(150个核苷酸)，在终止密码子上游(Nelson等，Pharmacogenetics 61-42，1996)。使用BLASTX，目视检查根据规范的血红素结合基序评为羟化酶的序列，筛选2,000个EST中在合适区编码规范血红素结合基序(FXXGXXXCXG，其中“X”是任何氨基酸)的序列。只有十五个EST有血红素结合基序。一个EST是独特的，其它十四个看起来是重叠序列。然后对从编码推定的细胞色素p450酶的七个集落得到的cDNA插入片段进行完全测序。所有七个集落编码同样的酶。
基因扩增赭曲霉11α羟化酶使用从赭曲霉cDNA孢子文库(LIB3025)获得的独特集落作为模板，通过PCR扩增11α羟化酶的编码区。所述引物包括EcoRI(正向)和XbaI(反向)的识别位点，这两个识别位点用于定向克隆进pFastbacl。使用PCR核心试剂盒(Roche)和50pmol每种引物扩增32个循环。一个循环包括在94℃的变性步骤45秒钟、在60℃的退火步骤45秒钟和在72℃的延伸步骤60秒钟。
引物11αOH-forgatcgaattcATGCCCTTCTTCACTGGGCT (SEQ ID NO42)引物11αOH-revgatctctagaTTACACAGTTAAACTCGCCATATCGAT(SEQ ID NO43)构建pMON45624通过QIAquick柱(Qiagen，Valencia CA)纯化上述扩增的片段，用EcoRI和XbaI消化，然后连接进用EcoRI和XbaI切割的pFastbacl。获得的质粒命名为pMON45624，使用基于载体序列的引物和基于11α羟化酶序列的内部引物(见下文)确认DNA序列。
引物BacfwdCTGTTTTCGTAACAGTTTTG (SEQ ID NO44)引物PolyACCTCTACAAATGTGGTATG (SEQ ID NO45)引物45624-for1GAGATCAAGATTGCCTT (SEQ ID NO46)引物45624-for2CTTCGACGCTCTCAA(SEQ ID NO47)引物45624-rev1GCAATCTTGATCTCGTT (SEQ ID NO48)
所克隆11α羟化酶的核苷酸序列和预测的氨基酸序列显示于图1，分别是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
图4描述克隆在pMON45624内的赭曲霉11α羟化酶与使用BLAST在GenBank中发现的相关酶排列对比的氨基酸同源性排列对比。图5是图解显示这种关系的系统树。图6显示赭曲霉类固醇11α羟化酶与使用BLAST根据ClustalW和Boxshade计算在GenBank中发现的头10个酶之间的同源性百分率。
实施例12-扩增编码人NADPH细胞色素P450还原酶的cDNA并克隆进质粒pMON45603、pMON45604和pMON45605基因扩增人氧化还原酶在11ul反应物中，将从HepG2细胞得到的约1ug polyA+mRNA与100ng随机六聚物(Invitrogen，Carlsbad，CA)一起加热到65℃10分钟。所述混合物在冰上冰冻，然后在下面20ul反应物中42℃温育75分钟1ul Rnase抑制剂(Promega，Madison，WI)，0.01M DTT，5mMdNTP，50mM Tris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2和1ulSuperScriptII酶(Life Technologies)。在95℃加热2分钟，失活反转录酶。第一条cDNA链保存于-20℃。正向引物和反向引物基于登记号S90469(编码细胞色素P450还原酶(SEQ ID NO49)的人胎盘部分mRNA)的核苷酸序列。对应蛋白序列的登记号是AAB21814(SEQ IDNO50)。分两段克隆人氧化还原酶，这两段通过在内部HincII位点连接而在pFastBacl(Life Technologies)中装配。所述引物包括用于定向亚克隆进pFastBacl的限制位点。
引物人氧化还原酶1AgatcggatccaatATGGGAGACTCCCACGTGGACAC (SEQ ID NO07)引物人氧化还原酶1BCAGCTGGTTGACGAGAGCAGAG(SEQ ID NO08)引物人氧化还原酶2ACTCTGCTCTCTCGTCAACCAGCTG (SEQ ID NO09)引物人氧化还原酶2BgatcggtaccttaGCTCCACACGTCCAGGGAGTAG (SEQ ID NO10)在每150ul反应物中，使用400uM dNTP和167nM每个引物组合成第二条链。使用Deep Vent聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)进行扩增。区段2(氧化还原酶cDNA的3′端二分之一)的反应物调整到5％DMSO。扩增反应包括一个初始循环在94℃变性90秒钟，然后在62℃退火2分钟，随后在72℃延伸2分钟。此后是30个循环，包括45秒钟的变性步骤、45秒钟的退火步骤和60秒钟的延伸步骤。最后一个循环延伸步骤延长到5分钟。
构建pMON45603、pMON45604、pMon45605用BamHI和HincII消化编码氧化还原酶cDNA 5′端二分之一的PCR片段。用HincII和KpnI消化编码氧化还原酶cDNA 3′端二分之一的PCR片段，然后连接进pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)进行测序。得到的质粒命名为pMON45603(5′区段)和pMON45604(3′区段)。将来自pMON45603的BamHI/HincII片段和来自pMON45604的HincII/KpnI片段连接进用BamHI和KpnI切割的pFastbacl，产生pMON45605。
测序引物基于GenBank登记号S90469(SEQ ID NO49)的序列，GenBank登记号S90469是一种编码细胞色素P450还原酶的cDNA[人，胎盘，mRNA部分，2403nt]。关连蛋白序列是AAB21814(SEQID NO 50)细胞色素P450还原酶{EC 1.6.2.4}[人，胎盘，肽部分，676aa][智人]。使用引物氧化还原酶1C测序pMON45603的cDNA插入片段，使用引物氧化还原酶2C和2D测序pMON45604的cDNA插入片段。也使用通用T7(SEQ ID NO41)和M13反向(SEQ ID NO40)引物进行测序，所述两个引物退火结合在所述cDNA插入片段侧翼的载体序列。
引物氧化还原酶1CGTGGACCACAAGCTCGTACTG (SEQ ID NO61)引物氧化还原酶2CCATCGACCACCTGTGTGAGCTG (SEQ ID NO62)引物氧化还原酶2DGTACAGGTAGTCCTCATCCGAG (SEQ ID NO63)所克隆人氧化还原酶的核苷酸序列和预测的氨基酸序列显示于图2，分别是SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。图11描述人氧化还原酶与SwissProt头4个搜索结果的排列对比。图12描述显示人氧化还原酶与这些搜索结果的遗传相关性的系统树。图13显示人氧化还原酶与SwissProt头4个搜索结果之间的同一性百分率。
实施例13-从赭曲霉扩增编码NADPH细胞色素P450还原酶的cDNA并克隆进质粒pMON45630、pMON45631和pMON45632基因扩增赭曲霉氧化还原酶目视检查来自黑曲霉cprA基因登记号Z26938(SEQ ID NO65)的序列与来自烟曲霉(PathoSeq Database，Incyte Pharmaceuticals)的部分cDNA克隆804561639F1之间的排列对比，选择高同源性区以设计PCR引物。选择一个引物组，该引物组跨越cprA基因产物氨基酸203到693的编码区。
从重叠区的5′末端区选择引物，其中二者之间的氨基酸序列相同，而核酸序列在第3个密码子位置的2个位置不同。对于3′引物，所述核酸编码终止密码子、最后7个氨基酸残基和2个附加碱基，所述2个附加碱基对应于从终止密码子开始第8个氨基酸残基位置密码子的第二个位置和第三个位置，所述第8个氨基酸残基位置密码子在黑曲霉中编码ARG，在烟曲霉中编码SER(CGC与AGC)。当黑曲霉和烟曲霉序列之间有差异时，用肌苷取代密码子中的第三个碱基。
引物曲霉氧化还原酶-for1GACGGIGCIGGTACAATGGA (SEQ ID NO11)引物曲霉氧化还原酶-rev1TTAIACCAIACATCITCCTGGTAGC (SEQ ID NO12)(其中I＝肌苷)使用从A.ochreaceus菌丝体提取的约5ug总RNA，扩增部分cDNA克隆。在合成第一条链前，在11ul反应混合物中将所述RNA与100ng随机六聚物(Promega Madison WI)加热到65℃10分钟。所述混合物在冰上冰冻，然后在下面20ul反应物中42℃温育75分钟1ul RNase抑制剂(Promega)，0.01M DTT，5mM dNTP，50mMTris-HCl，pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2和1ul SuperScriptII酶(LTI)。在95℃加热2分钟，失活反转录酶。第一条cDNA链保存于-20℃。使用5ul第一条链作为模板，合成第二条链。所述反应包括500nM引物，200uM每种dNTP，以及PCR核心试剂盒(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)提供的Taq聚合酶和缓冲液。扩增进行32个循环，每个循环在94℃变性步骤30秒钟，在60℃退火步骤30秒钟和在72℃延伸步骤60秒钟。将扩增的DNA产物克隆进pGEM-T(Promega，Madison，WI)，使用通用T7(SEQ ID NO41)和SP6(SEQID NO57)引物测序。
引物SP6GATTTAGGTGACACTATAG (SEQ ID NO57)与黑曲霉cprA基因的序列排列对比揭示赭曲霉克隆在黑曲霉基因内含子的同样位置有内含子。这指出赭曲霉PCR产物可能从总RNA的基因组DNA污染物扩增。设计基于赭曲霉序列的反向引物，用于扩增约600个缺失的bp，其中包括起始甲硫氨酸。然后使用赭曲霉cDNA文库作为模板进行PCR。正向引物基于载体pSport1(LifeTechnologies)碱基299到326的反向互补物。另一引物曲霉氧化还原酶-rev2基于编码残基326-333的赭曲霉序列。
引物pSport-for1CAAGCTCTAATACGACTCACTATAGGGA(SEQ ID NO13)引物曲霉氧化还原酶-revCAGGAACCGATCGACCTCGGAA(SEQ ID NO14)然后使用从大小＞1.5kb的凝胶纯化片段制备的赭曲霉孢子大小文库作为模板，扩增编码区的最后200碱基。从曲霉氧化还原酶序列设计两个新的反向引物，并且使用基于pSport1(碱基295-328)的新的正向引物。
引物曲霉氧化还原-rev3GTCACCCTCACCAGCAGAGCCAATG (SEQ ID NO15)引物曲霉氧化还原酶-rev4CCACATTGCGAACCATAGCGTTGTAGTG(SEQ ID NO16)引物pSport-for2GCCAAGCTCTAATACGACTCACTATAGGGAAAGC (SEQ ID NO17)使用Elongase聚合酶试剂盒(Life Technologies，Rockville MD)扩增35个循环，每个循环包括在94℃变性步骤30秒钟，在63℃退火步骤30秒钟和在68℃延伸步骤5分钟。将所述PCR产物直接克隆进pCRII TOPO(Invitrogen)。测序十二个克隆，所述复合序列延伸到起始甲硫氨酸上游232碱基，并且包括2个框内终止密码子(数据未显示)。
设计加入曲霉氧化还原酶完整编码序列的引物，所述引物带有5′SalI位点和3′XhoI位点，以便连接进表达载体pFastBacl。
引物曲霉氧化还原酶-for2gtcgachTGGCGCAACTCGATACTCTC (SEQ ID NO18)引物曲霉氧化还原酶-rev5ctcgagttaGGACCAGACATCGTCCTGGTAG (SEQ ID NO19)使用赭曲霉总RNA作为模板，应用这些引物和Elongase试剂盒进行PCR。扩增包括35个循环，每个循环在94℃变性步骤30秒钟，在64℃退火步骤30秒钟和在68℃延伸步骤5分钟。所述反应物的等分量cDNA在电泳上表现为约2.1kb的一条带。
构建pMON45630将所述PCR产物直接克隆进pCRII-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA)。所有克隆包含前文提到的内部内含子。一个克隆命名为pMON45630。
构建pMON45631和pMON45632使用基于两步PCR的策略，从5′剪接位点上游约170bp的内部BamHI位点产生缺失内含子的克隆。
引物曲霉氧化还原酶-for3GGATCCCTCGCGACCTGTGATCAT(SEQ ID NO20)引物曲霉氧化还原酶-for4CGAAGATTTCTTGTACAAGGATGAATGGAAGACTTTTC (SEQ ID NO21)引物曲霉氧化还原酶-rev6CTGAAAAGTCTTCCATTCATCCTTGTACAAGAAATC(SEQ ID NO22)引物曲霉氧化还原酶-for4和rev6互补，在所述内含子侧翼。第一个PCR反应使用在内部BamHI位点线性化的曲霉氧化还原酶克隆作为模板。聚合酶和缓冲液由PCR核心试剂盒(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)提供。引物和dNTP浓度分别是500nM和200uM。使用曲霉氧化还原酶-for3和曲霉氧化还原酶-rev6的组合以及曲霉氧化还原酶-for4和曲霉氧化还原酶-rev5的组合进行两个反应。在2分钟初始变性后，PCR扩增28个循环。一个循环包括在94℃变性步骤45秒钟，在64℃变性步骤45秒钟和在72℃延伸步骤45秒钟。使用每个反应各1ul作为第二次PCR扩增的模板，并使用引物曲霉氧化还原酶-for3和曲霉氧化还原酶-rev5以及Elongase酶和缓冲液。扩增包括30个循环，每个循环在94℃变性步骤30秒钟，在62℃退火步骤30秒钟和在68℃延伸步骤5分钟。所述PCR产物直接克隆进pCRII-TOPO。DNA测序证明已经除去所述内含子。该克隆命名为pMON45631。
使用三步连接构建质粒pMON45632连接来自pMON45630的SalI/BamHI片段和来自pMON45631的BamHI/XhoI片段以及载体pFastBacl，在此之前用SalI和XhoI切割所述载体pFastBacl并去磷酸化，以增加携带所需插入片段的载体的回收率。
所克隆的赭曲霉11氧化还原酶的核苷酸序列和氨基酸序列显示于图3，分别是SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。图7描述赭曲霉和人氧化还原酶与来自黑曲霉、小鼠和啤酒酵母的NADPH细胞色素P450还原酶之间的氨基酸同源性。图8图示赭曲霉、黑曲霉和啤酒酵母氧化还原酶之间的氨基酸排列对比。图9是显示赭曲霉和人氧化还原酶与来自黑曲霉、酵母和小鼠的还原酶关系的系统树。图10显示赭曲霉类固醇11α羟化酶与来自黑曲霉、酵母和小鼠的氧化还原酶之间使用Clustal W和Boxshade计算得到的同源性百分率。
实施例15产生识别赭曲霉11α羟化酶和赭曲霉NADPH细胞色素p450还原酶的多克隆抗体产生抗11-α-羟化酶抗体在兔体内针对合成肽(由Sigma/Genosis，The Woodlands，TX制备)产生抗赭曲霉11α羟化酶和NADPH细胞色素p450还原酶的多克隆抗体，所述合成肽对应于下面预测的蛋白序列的几个区11αOH肽1AAAYWLATLQPSDLPELN (SEQ ID NO23)11αOH肽2CRQILTPYIHKRKSLKGTTD (SEQ ID NO24)11αOH肽3HMGFGHGVHACPGRFFASNEI (SEQ ID NO25)oxr肽1CTYWAVAKDPYASAGPAMNG (SEQ ID NO26)所述11αOH肽2(SEQ ID NO24)对应于在Wang和Lu描述的11α羟化酶氨基酸序列与CYP3A4对应序列的排列对比中存在的G螺旋、G/H环和H螺旋区(Drug Metab.Dispos.25(6)，762-767，1997)。所述11αOH肽3(SEQ ID NO25)对应于血红素结合域的肽片段。
使用反相高效液相色谱(HPLC)监测免疫级肽的纯度。每种肽缀合到匙孔血蓝蛋白(KLH)，并悬浮于完全弗氏佐剂。然后在多个位点将所述缀合的肽皮下注射入兔体内。每种缀合的肽注射入两只兔。所有随后的免疫都应用不完全弗氏佐剂。一般地说，初次免疫后以两周间隔给予五次随后的注射。使用Sepharose-蛋白A柱亲和纯化IgG组份。将每种肽注射的两只兔的组份以1∶1比例混合。汇集的抗11α羟化酶(兔GN 1187/1188)是0.34mg/ml IgG。汇集的抗氧化还原酶(兔GN 2023/2024)是0.26mg/mlIgG。混合的IgG各自以1∶10、1∶100和1∶1,000稀释进行预试验，确定哪个稀释度最适于探测蛋白质印迹。1∶10稀释给出最佳结果，使用该稀释度用于探测随后的蛋白质印迹。
实施例16-昆虫细胞感染和异源表达使用杆状病毒穿梭载体在Sf9细胞中表达蛋白(Luckow等，J.Virol.674566-4579，1993)。所述杆状病毒穿梭载体(杆粒)包含用于在细菌细胞中表达的小F复制子、用于选择的卡那霉素抗性标记和lacZα序列内的attTn7(细菌Tn7转座子的靶位点)。将这些元件的每一种都插入苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV，天然杆状病毒)基因组的多角体蛋白基因座。使用供体质粒(pFastBacl，Life Technologies)传递需要表达的基因，将所述供体质粒通过细菌Tn7转座因子插入杆粒。pFastBacl包含在多角体蛋白启动子两侧的Tn7左末端和右末端、多接头克隆序列、SV40 polyA转录终止序列以及用于选择的庆大霉素抗性基因。将pFastBacl质粒转化进包含所述杆粒和辅助质粒的DH10Bac大肠杆菌细胞(Life Technologies)后产生重组病毒，所述pFastBacl质粒包含一个11α羟化酶或氧化还原酶cDNA。
使用CellFectinTM试剂(Life Technologies)，按照厂家针对秋粘虫(Sf9)细胞的方法进行转染。将细胞以每孔9×105细胞接种到6孔组织培养板上的SF-900无血清培养基(Life Technologies)中，使其吸附至少一小时。在盛有200ul SF-900培养基的聚苯乙烯管内加入5ul小量制备的DNA和5μl Cellfectin，制得转染混合物。使所述混合物在室温下温育15-30分钟。转染前，每管加入800ul SF-900培养基。用2ml SF-900培养基洗涤细胞一次，然后在细胞中加入所述DNA混合物。所述培养物在27℃温育5小时。温育5小时后，取出所述转染混合物，每孔加入补充10％胎牛血清的IPL-41培养基(LifeTechnologies)，补充所述培养物。温育三天后，收获细胞，离心，取出包含重组病毒的上清(命名为第1代或P1贮液)，保存于4℃。用0.5ml所述P1培养基感染100ml密度为每ml 5×105细胞的新鲜Sf9细胞，制备更大体积的病毒贮液。随后使用噬菌斑测定方法(O’Reilly等，1992)滴定所述更大体积的病毒贮液，所述病毒贮液用于分别或同时生产11α羟化酶或氧化还原酶。
图14描述一个免疫印迹，该免疫印迹说明用杆状病毒感染昆虫细胞并在感染后25和48小时收获时，赭曲霉P450 11α羟化酶在昆虫细胞内的表达。由缀合合成肽11aOH肽2(SEQ ID NO 24)免疫的两只兔制备抗体1∶1混合物，用所述抗体混合物探测硝酸纤维素膜。
图15描述一个免疫印迹，该免疫印迹说明用杆状病毒感染昆虫细胞并在感染后25和48小时收获时，赭曲霉P450氧化还原酶在昆虫细胞内的表达。由缀合合成肽oxr肽1(SEQ ID NO 26)免疫的两只兔制备抗体1∶1混合物，用所述抗体混合物探测硝酸纤维素膜。
实施例17-共感染表达赭曲霉11α羟化酶和人氧化还原酶的杆状病毒用包含类固醇11α羟化酶cDNA的病毒颗粒和包含人NADPHP450-氧化还原酶的另一独立病毒共感染Sf9细胞。以0.1∶0.01(11aOH对oxr)的感染复数(MOI)加入两种病毒。感染一天后，在培养物中加入0.9μg/ml氯高铁血红素。感染三天后离心收获细胞(除不同说明外)，冰冻经过洗涤的细胞沉淀，随后加工获得亚细胞组份。
实施例18共感染表达赭曲霉11α羟化酶和赭曲霉氧化还原酶的杆状病毒用包含类固醇11α羟化酶cDNA的病毒颗粒和包含赭曲霉NADPH P450-氧化还原酶的另一独立病毒共感染Sf9细胞。以0.1∶0.01(11aOH与oxr)的感染复数(MOI)加入两种病毒。感染一天后，在培养物中加入0.9μg/ml氯高铁血红素。感染三天后离心收获细胞(除不同说明外)，冰冻经过洗涤的细胞沉淀，以备用于随后加工获得亚细胞组份的试验。
实施例19从杆状病毒感染的昆虫细胞制备亚细胞组份融化来自感染sf9细胞和未感染对照细胞的半克细胞糊，悬浮于40ml 0.25M蔗糖的10mM KHPO4溶液(调整到pH7.4)。用FisherSonic Dismembrator，300型探针超声波仪(Fisher Scientific，St.Louis，MO)匀浆所述悬浮液。将所述样品转移到圆锥形离心管(Corning CostarCorporation，Cambridge，MA)，在5℃下500xg离心15分钟。沉淀重悬浮于等体积新鲜缓冲液，镜检观察以确认完全裂解。观察到很少或没有完整的细胞。然后上清液在5℃下10,000xg离心30分钟，收集线粒体、高尔基体和其它亚细胞细胞器。沉淀重悬浮于新鲜缓冲液，在5℃下7,800xg离心30分钟，收集线粒体。
如上所述，将所述线粒体沉淀重悬浮于缓冲液中，再次离心。将线粒体沉淀重悬浮于2ml缓冲蔗糖溶液，以100μl等分量保存于-80℃。
来自原始线粒体组份的上清液在5℃下200,000xg离心1小时。将线粒体沉淀重悬浮于2ml缓冲蔗糖溶液，以100μl等分量保存于-80℃。
温育微粒体温育混合物在100mM磷酸钾缓冲液，pH7.4或150mM HEPES缓冲液，pH7.4内包含Sf9微粒体(最终浓度1mg蛋白/mL)、NADPH生产系统和250uM底物(AD)。所述NADPH生产系统包括所示最终浓度的下面成分MgCl2(7.5mM)，D-葡萄糖-6-磷酸(7.5mM)，NADP(0.80mM)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1.0单位/mL)。在37℃水浴中进行温育指定时间。温育后，加入0.3ml甲醇终止反应。旋涡搅拌样品三次，每次两秒钟，然后置于冰上，或保存于-70℃以备用于以后的分析。
实施例20使用HPLC分析测定测量类固醇底物到它们的羟化物的转化情况高效液相色谱(HPLC)用于分离羟化类固醇化合物和类固醇底物(例如分离11α-羟化雄甾烯二酮和雄甾烯二酮)的HPLC方法是Sonderfan等，Arch.Biochem.Biophys.25527-41，1987所述睾酮羟化酶测定的改进形式。从Sigma获得雄甾烯二酮和11-β-羟化雄甾烯二酮的标准。Searle MedicinalChemistry提供11α-羟化雄甾烯二酮(89.5％纯度，主要杂质是雄甾烯二酮)。从Burdick & Jackson获得HPLC级水和甲醇。
HPLC系统包括1050型泵、自动进样器和可变波长检测器(Hewlett-Packard，Naperville，IL)、TC-50型温度控制器和CH-30型柱加热器(均为Eppendorf，Madison，WI)。
用表达11-羟化酶和互补电子转运蛋白的重组杆状病毒转染昆虫细胞，在反应混合物内分析从所述昆虫细胞获得的细胞膜组份的11-羟化酶活性，所述反应混合物在200ul最终体积内含80mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，8mM MgCl2和0.9mM NADP+。为保证还原当量的足够来源，加入葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(1.5U/ml)和8mM葡萄糖-6-磷酸，提供NADPH生产系统。提供最终浓度为0.3mM的类固醇底物(如雄甾烯二酮)。反应混合物在37℃温育30分钟。加入200ul甲醇终止反应，然后置于冰上。离心收集样品，除去沉淀的蛋白。
在一种情况下，在渗硅聚丙烯1.5ml微量离心管内，37℃下在0.5ml体积中进行温育120分钟。加入从微粒体组份或线粒体组份制备的酶，并加入底物达到浓度250μM(如AD的25mM甲醇贮液)。辅因子缓冲液是100mM磷酸钾，pH7.4，7.5mM MgCl2，7.5mM葡萄糖-6-磷酸，0.80mM NADP和1.0单位/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。如下制备HPLC样品加入0.3ml甲醇终止所述0.5ml反应混合物，旋涡搅拌三次，每次2秒钟，然后在冰上保存。所述管用微量离心机在约20,000xg离心5分钟，将样品转移到自动进样器的小管内并加盖。
使用250mm×4mm Vydac分析型C-4柱，通过反相HPLC分离和分析在反应混合物和培养基提取物中的类固醇成分。如下发展色谱在十分钟内使用从40％到100％甲醇的溶剂梯度，在100％甲醇保持5分钟，然后再平衡到初始条件。在254和220nm监测柱洗脱液的UV吸光度。
使用装备0.22微米柱前滤器的Nova-pak C-18柱，4微米，3.9×150mm(Waters Chromatography，Milford，MA)在40℃和1.0流动相/分钟分离雄甾烯二酮、睾酮和单羟基化雄甾烯二酮代谢物。使用步进梯度，水是流动相溶剂A，甲醇是流动相溶剂B。溶剂B的起始浓度是42％6分钟。B的百分率在4分钟内线性增加到45％，然后保持3分钟。然后B的百分率在10分钟内线性增加到80％，在该点保持另外2分钟，总共运行25分钟。紫外检测波长是247nm，注射体积是200ul。
“线粒体”样品和“微粒体”样品产生的峰都符合11α-羟化雄甾烯二酮标准的保留时间，而其它组份都不符合该保留时间。这些“线粒体”和“微粒体”峰分别占在247nm定量的总峰面积的3.2％和2.3％。将11α-羟化雄甾烯二酮标准也以5.0μg/mL的浓度加入空白微粒体温育样品。在根据标准纯度(89.5％)进行校正后，“线粒体”和“微粒体”11α-羟化雄甾烯二酮峰的浓度是1.75μg/mL和1.31μg/mL。这些浓度说明在250μM底物浓度下，2.3％和1.7％的底物转化为11α-羟化雄甾烯二酮。
图16图示一个HPLC描图，该描图说明用从表达赭曲霉11α羟化酶和人氧化还原酶的杆状病毒感染的昆虫细胞制备的亚细胞部分温育雄甾烯二酮(AD)后，从AD到其11α羟化物的转化。
实施例21通过使用针对合成肽产生的多克隆抗体进行的免疫印迹，识别赭曲霉11α羟化酶和赭曲霉NADPH细胞色素p450还原酶将来自Sf9细胞裂解物的蛋白(从未感染的细胞和重组杆状病毒感染的细胞获得)以相等浓度(每孔10μg)加载到10％梯度丙烯酰胺微型凝胶(BioRad，Hercules，CA)的道上。使用含0.1％SDS的Tris-甘氨酸缓冲液(Sigma，St.Louis，MO)，以16mAmp衡流电泳分离蛋白约1小时。用70mAmp衡流将蛋白转移到硝酸纤维素膜(Schleicher &Schuell，Keene，NH)40分钟。1∶10稀释第一抗体(从抗-11α羟化酶IgG(从肽11aOH肽2CRQILTPYIHKRKSLKGTTD(SEQ ID NO24)制备的抗体GN-1187和GN-1188)的贮液浓度0.34mg/ml，以及抗-氧化还原酶IgG(从oxr肽1CTYWAVAKDPYASAGPAMNG(SEQ ID NO26)制备的抗体GN-2023和GN-12024)的贮液浓度0.26mg/ml)，用于探测所述硝酸纤维素膜。用抗兔辣根过氧化物酶(HRP)连接的第二抗体，按照厂家(New England Biolabs，Beverly，MA)的推荐检测抗原。使用鲁米诺试剂和过氧化物试剂(New England Biolabs，Beverly，MA)，按照厂家提供的方法检测化学发光。使用X-OMAT AR膜(Eastman Kodak Company，Rocchester，NY)记录发光。使用MinoltaDimage V数字照相机(Minolta Corporation，Ramsey，NJ)记录图像。
实施例22表征编码11α羟化酶和氧化还原酶的赭曲霉基因组DNA可以使用上文所述方法鉴定在赭曲霉和密切相关的微生物的基因组内的编码类固醇羟化酶和氧化还原酶的基因，所述密切相关的微生物包括黑曲霉和构巢曲霉。其它优选生物是米根霉、匍枝根霉、弗氏链霉菌、巨大芽孢杆菌、克罗斯韦假单胞菌、粉红单端孢、Fusariumoxysporum f.sp.cepae、少根根霉和Monosporium olivaceum。已知具有类固醇11α羟化酶活性的其它优选生物在本发明上文详细描述中描述。
简要地说，制备基因组DNA并通过鸟枪法克隆进在细菌内繁殖的低拷贝人工染色体。测序大量克隆，以保证完整基因组的统计学代表性，融合重叠克隆的序列，产生基因组的最终图谱和序列。对可读框的分析将揭示与本发明类固醇羟化酶和氧化还原酶基因同源的区，以及与使用如BLAST、CLUSTAL W和BoxShade等程序找到与上述酶同源的翻译可读框区，所述程序用于对核苷酸和蛋白质序列数据进行多序列排列对比。从人工染色体获得编码这些蛋白的基因，再次克隆进表达载体如pFastBacl，将所述表达载体转化进合适宿主细胞，然后测定能够转化类固醇底物成为其氧化对应物的酶的存在。
应当根据所附权利要求确定本发明的范围。人们知道可以根据本文所述对本发明作出多种改变，而不偏离本发明的范围和精神，并且不损害其任何好处。包括从已知进行类固醇底物的11α羟化的微生物(最好是真菌和细菌)分离同源基因。本发明还涉及取代任何类似成分。包括但不限于使用上述技术分离涉及类固醇形成的其它P450(包括在核心分子的其它位置作用的羟化酶)，以及应用这些酶在改良的宿主微生物中生物转化类固醇中间体。
本文引用的所有参考文献、专利或申请通过引用完整地结合到本文中，就如同在本文写出一样。
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序列表<110>Suzanne L.BoltenAlan M.EastonLeslie C.EngelDean M.MessingJohn S.NgBeverly A.ReitzScott A.VaccaroMark C.WalkerPing T.WangRobin A.Weinberg<120>赭曲霉11α-羟化酶和氧化还原酶<130>S03196-00-US<140>US 09/XXX,XXX<141>2001-10-26<150>USSN 60/244,300<151>2000-10-30<160>65<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1776<212>DNA<213>赭曲霉(Aspergillus ochraceus)<220>
<221>CDS<222>(146)...(1690)<223>赭曲霉11α羟化酶<400>1tggaagtttt tacacttatt atgccggagc cgaaagattc tgagtcgagg ggttggggaa 60caacactata agacctacaa ccacttggat ttggtgaatt tacacgggca ttatcaaaac120agccacaagc tgacagctca ttatc atg ccc ttc ttc act ggg ctt ctg gcg 172Met Pro Phe Phe Thr Gly Leu Leu Ala1 5att tac cat agt ctc ata ctc gac aac cca gtc caa acc ctg agc acc 220Ile Tyr His Ser Leu Ile Leu Asp Asn Pro Val Gln Thr Leu Ser Thr
10 15 20 25att gtc gta ttg gcg gca gcg tac tgg ctc gca acg ctc cag ccg agc 268Ile Val Val Leu Ala Ala Ala Tyr Trp Leu Ala Thr Leu Gln Pro Ser30 35 40gac ctt cct gag ctg aat ccc gcc aaa cca ttc gag ttc acc aat cgt 316Asp Leu Pro Glu Leu Ash Pro Ala Lys Pro Phe Glu Phe Thr Asn Arg45 50 55cgt cgt gtt cat gag ttt gtt gaa aat agt aag agc ttg ctt gct cgg 364Arg Arg Val His Glu Phe Val Glu Asn Ser Lys Ser Leu Leu Ala Arg60 65 70ggg agg gaa ttg cac ggg cac gag ccg tac aga ctc atg tct gaa tgg 412Gly Arg Glu Leu His Gly His Glu Pro Tyr Arg Leu Met Ser Glu Trp75 80 85gga tcc ttg att gtc ctg ccc cca gag tgc gcc gac gag ctg cgc aac 460Gly Ser Leu Ile Val Leu Pro Pro Glu Cys Ala Asp Glu Leu Arg Asn90 95 100 105gac cca aga atg gac ttt gag acg ccc acc acc gac gac tcc cac gga 508Asp Pro Arg Met Asp Phe Glu Thr Pro Thr Thr Asp Asp Ser His Gly110 115 120tat atc cct ggc ttc gac gct ctc aac gca gac ccg aac ctg act aaa 556Tyr Ile Pro Gly Phe Asp Ala Leu Asn Ala Asp Pro Asn Leu Thr Lys125 130 135gtg gtc acc aag tac ctc aca aaa gca ttg aac aag ctt act gct ccg 604Val Val Thr Lys Tyr Leu Thr Lys Ala Leu Asn Lys Leu Thr Ala Pro140 145 150atc tcg cat gaa gcg tcc atc gcc atg aaa gcg gtg ctg ggt gac gat 652Ile Ser His Glu Ala Ser Ile Ala Met Lys Ala Val Leu Gly Asp Asp155 160 165cca gat tgg cgt gag atc tac cca gcc aga gac ttg ctc cag ctc gtc 700Pro Asp Trp Arg Glu Ile Tyr Pro Ala Arg Asp Leu Leu Gln Leu Val170 175 180 185gcc cgg atg tcg aca aga gtg ttc ctt ggc gag gaa atg tgc aat aac 748Ala Arg Met Ser Thr Arg Val Phe Leu Gly Glu Glu Met Cys Asn Asn190 195 200cag gat tgg atc caa acc tca tca caa tac gcg gcc ctt gcc ttc ggt 796Gln Asp Trp Ile Gln Thr Ser Ser Gln Tyr Ala Ala Leu Ala Phe Gly205 210 215
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<223>具有NotI位点聚dT尾的合成接头<221>misc_structure<222>(1)...(1)<223>第一个碱基磷酸化<400>58gactagttct agatcgcgag cggccgccct tttttttttt tttt 44<210>59<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SalI接头的上面一条链<400>59tcgacccacg cgtccg16<210>60<211>12<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>SalI接头的下面一条链，第一个碱基磷酸化
<221>misc_feature<222>(1)...(1)<223>第一个碱基磷酸化<400>60gcctgcgcac cc12<210>61<211>21<212>DNA<213>人氧化还原酶引物1C<400>61gtggaccaca agctcgtact g 21<210>62<211>22<212>DNA<213>人氧化还原酶引物2C<400>62catcgaccac ctgtgtgagc tg 22<210>63<211>22<212>DNA<213>人氧化还原酶引物2D<400>63gtacaggtag tcctcatccg ag 22<210>64<211>3710<212>DNA<213>黑曲霉NADP CYP450氧化还原酶Z26838<400>64cctgtatcct gataactcct cagcaaatcg gagtaaacag aaggacaagt cattggagta 60ctaagtagct ccgtgtcaga gacccggaca ggatcagctt ctccgaaccc gagactccgg 120gcgaaaaggc caccatcgct caggctacca cctgtgttcc ttccgtcgat cgtcctccct 180cgtttccggc tcacggcccc ccaaattatt gcggtctgct tagcagtggg ttcggcctct 240ctgttcttcc tggatcacac cacggcttac tttcttatcc ttttcctttt cctttcttcc 300tttcttcctg ttctcctttc ttcctttcca cccccttctt tcttttaacc ccatagcgtc 360attctttctt ccgttttatc tttggttttg ggacgccgcc accttatctc ggttcctgcc 420tcggtctccg gtgatcgcac ctggataggc taagcgtagg gaggtgtgac attcttcttt 480cacctcctct ccttttcccg cctcactccg ttcaatcccc cgctccaccc tttcagactc 540gccatcgtat caagtcgggg cctttgcttg cgccgctgaa cagcctcacc atggcgcaac 600tcgataccct cgatctggtg gtcctggcgg tgcttttggt gggtagcgtg gcctacttca 660
ccaagggcac ctactgggca gttgcaaaga cccgtatgcc tctaccggcc ccgcggatga 720acggcgccgc taaggctggc aagactcgga acatcattga gaagatggaa gaaacgggca 780agaattgtgt tattttctac ggatcgcaaa ctggaaccgc tgaggactac gcctccagat 840tggccaagga aggatctcag cgcttcggcc tcaagaccat ggtggctgac ctcgaggaat 900acgactatga gaacctggac caattcccgg aggacaaggt tgcgtttttc gtgctcgcca 960cctacggaga gggtgagcct acggataatg ctgttgagtt ctaccagttc ttcaccggtg1020acgacgttgc ttttgagagc gcgtccgcgg acgagaagcc tctgtccaag ctgaagtatg1080ttgctttcgg tctgggtaac aacacttatg agcactacaa cgccatggtt cgtcaagtcg1140atgctgcttt ccagaagctc gggccgcagc gtattggttc tgctggcgag ggtgatgacg1200gtgccggtac aatggaagaa gacttcttgg cctggaagga gcccatgtgg gcagcactgt1260cggagtcgat ggatctcgaa gagcgtgaag cggtctacga acctgttttc tgcgtcaccg1320aaaacgagtc cctgagccct gaggacgaga cggtctatct tggagagccc acccagagcc1380accttcaggg tactcccaaa ggcccgtact ctgcgcacaa cccctttatc gcccctattg1440ccgaatctcg tgagcttttc accgtcaagg atcgcaactg tctgcacatg gaaattagca1500tcgctggaag taacttgtcc taccagactg gtgaccacat cgctgtttgg cccacaaacg1560ctggtgccga agtggatcgg ttccttcagg tcttcggtct cgagggcaag cgtgattcgg1620tcatcaacat caagggtatc gatgttacgg ccaaggtccc aatcccgacc ccgaccacgt1680acgatgccgc tgttcggtac tatatggaag tctgcgcccc tgtgtcccgt cagtttgtag1740ccactctggc cgcgttcgct ccgatgagga aagcaaggca gagattgtgc gtctgggtag1800cacaaggact atttccacga gaaggtcacc aaccaatgct tcaacatgcc caggctcttc1860agagcatcac gtccaagcct ttctctgctg ttccgttctc tctgcttatt gaaggcatta1920cgaagctgca gcctcgctac tactcgatct cttcgtcctc ccttgtccag aaggacaaga1980tcagcatcac ggccgttgtg gaatctgttc gtctgcccgg tgcctctcac atggtgaagg2040gtgtgactac gaattatctc ctcgcgctca agcagaagca gaacgggcga tccctctccc2100gaccctcacg gcttgactta ctccatcacg gtccccggaa caagtacgac ggtatccacg2160ttcccgtgca tgttcgccac tcgaacttca agctgccctc tgatccctct cggcccatta2220tcatggttgg tcctggtact ggtgttgctc ctttccgtgg tttcattcag gaacgtgctg2280ctttggcggc caagggcgag aaggttggac ccactgttct cttcttcggt tgccgcaaga2340gtgacgagga tttcttgtac aaggatgaat ggaaggtaag atatcttttt ttcttttccg2400cagctacctt catacatctc ggatgctaac atatcgcgat tcgcagacct atcaggacca2460gcttggagac aacttgaaga tcatcactgc gttctcgcgt gagggtcctc agaaggtcta2520cgttcagcac agactccgcg agcactccga acttgtcagc gaccttctga agcagaaagc2580taccttctac gtctgtggtg acgctgcaaa catggctcgc gaggttaacc ttgtgcttgg2640ccagatcatt gctgcgcagc gtggtctgcc cgccgagaag ggcgaagaaa tggtcaagca2700catgcgtaga cgtggacgct accaggaaga tgtgtggtca taatctttca atgcatcgac2760ttttctttct tgtctatcac gacggccttc tcgatccatt attttattta acgcctagat2820gatctttgca tatatactcc gctgattttg cctattcatc tgttttgctt ggcgtggttt2880atgtatgcct agtttatttg ttttgtgcac cgaccggcca gccacacatt gaagtggctt2940gagcatgagt gcggtagcca gtgtcgaaag aacaggatag acgatcatga ttattgcggg3000aacatgttat gccattctgg gcatattgat atctggttgc atgagcccag aggatacgaa3060aagatgaatc catatttaat ttgcacaata cttttcgcct tcttcatcta gtaattaaat3120taattgagca ctgaccgaac gagctgacac ctgctgctcg gaatagccga caacgcattg3180acgtgcaaga gatgcataat cattacaatc aacaagtaga ctggtaacta aatcactgaa3240tactacagtt actgcctact ttcagccaaa aagtaatact gaagatttcg gggaatcaaa3300tagaagaaac atgcataagc ccaacctcgg caataccggg agttaagcac agtaaccaaa3360accaaaccaa actagaaccg gcgcgcgacc agtgacccat cgtcattccc ggtatcagca3420gttcagtcag actggctggc tagcccgaac ccaactgccg caatcatcca tccatcctca3480acccgcccct cccatgccaa cctctctact ccgcagagcg agggacaaaa aaatgagatg3540cagcaattaa ccacgataat ctagcaaaaa gaaagttaga agccggaaga acatacatat3600
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Pro Thr Asn Ala Gly Ala Glu Val Asp Arg Phe Leu Gln Val Phe Gly325 330 335Leu Glu Gly Lys Arg Asp Ser Val Ile Asn Ile Lys Gly Ile Asp Val340 345 350Thr Ala Lys Val Pro Ile Pro Thr Pro Thr Thr Tyr Asp Ala Ala Val355 360 365Arg Tyr Tyr Met Glu Val Cys Ala Pro Val Ser Arg Gln Phe Val Ala370 375 380Thr Leu Ala Ala Phe Ala Pro Met Arg Lys Ala Arg Gln Arg Leu Cys385 390 395 400Val Trp Val Ala Gln Gly Leu Phe Pro Arg Glu Gly His Gln Pro Met405 410 415Leu Gln His Ala Gln Ala Leu Gln Ser Ile Thr Ser Lys Pro Phe Ser420 425 430Ala Val Pro Phe Ser Leu Leu Ile Glu Gly Ile Thr Lys Leu Gln Pro435 440 445Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Ser Leu Val Gln Lys Asp Lys Ile450 455 460Ser Ile Thr Ala Val Val Glu Ser Val Arg Leu Pro Gly Ala Ser His465 470 475 480Met Val Lys Gly Val Thr Thr Asn Tyr Leu Leu Ala Leu Lys Gln Lys485 490 495Gln Asn Gly Arg Ser Leu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Asp Leu Leu His500 505 510His Gly Pro Arg Asn Lys Tyr Asp Gly Ile His Val Pro Val His Val515 520 525Arg His Ser Asn Phe Lys Leu Pro Ser Asp Pro Ser Arg Pro Ile Ile530 535 540Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly Phe Ile Gln545 550 555 560Glu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Lys Gly Glu Lys Val Gly Pro Thr Val565 570 575Leu Phe Phe Gly Cys Arg Lys Ser Asp Glu Asp Phe Leu Tyr Lys Asp580 585 590Glu Trp Lys Thr Tyr Gln Asp Gln Leu Gly Asp Asn Leu Lys Ile Ile595 600 605Thr Ala Phe Ser Arg Glu Gly Pro Gln Lys Val Tyr Val Gln His Arg610 615 620Leu Arg Glu His Ser Glu Leu Val Ser Asp Leu Leu Lys Gln Lys Ala625 630 635 640Thr Phe Tyr Val Cys Gly Asp Ala Ala Asn Met Ala Arg Glu Val Asn645 650 655Leu Val Leu Gly Gln Ile Ile Ala Ala Gln Arg Gly Leu Pro Ala Glu660 665 670Lys Gly Glu Glu Met Val Lys His Met Arg Arg Arg Gly Arg Tyr Gln675 680 685Glu Asp Val Trp Ser690
权利要求
1.一种分离纯化的核酸，所述核酸编码赭曲霉(Aspergillusochraceus)11α羟化酶。
2.一种分离的DNA，所述DNA编码赭曲霉11α羟化酶。
3.一种分离的eDNA，所述cDNA编码赭曲霉11α羟化酶。
4.一种分离的基因，所述基因编码赭曲霉11α羟化酶。
5.一种基因的分离的等位基因，所述基因编码赭曲霉11α羟化酶。
6.一种分离纯化的核酸，其中所述核酸序列为SEQ ID NO1。
7.一种分离的DNA，其中所述DNA序列为SEQ ID NO1。
8.一种分离的cDNA，其中所述cDNA序列为SEQ ID NO1。
9.一种分离的基因，其中所述基因序列为SEQ ID NO1。
10.一种基因的分离的等位基因，其中所述基因序列为SEQ IDNO1。
11.一种分离的蛋白，所述蛋白具有赭曲霉11α羟化酶的氨基酸序列。
12.一种分离的蛋白变异体，所述蛋白具有赭曲霉11α羟化酶的氨基酸序列。
13.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含赭曲霉11α羟化酶的氨基酸序列。
14.一种分离的蛋白，其中所述蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO2。
15.一种分离的蛋白变异体，其中所述蛋白的氨基酸序列为SEQID NO2。
16.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO2，并且具有至少一个保守氨基酸取代。
17.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO2至少99％相同的序列。
18.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO2至少95％相同的序列。
19.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO2至少90％相同的序列。
20.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO2至少75％相同的序列。
21.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO2至少50％相同的序列。
22.一种分离纯化的核酸，所述核酸编码赭曲霉11α氧化还原酶。
23.一种分离的DNA，所述DNA编码赭曲霉氧化还原酶。
24.一种分离的cDNA，所述cDNA编码赭曲霉氧化还原酶。
25.一种分离的基因，所述基因编码赭曲霉氧化还原酶。
26.一种基因的分离的等位基因，所述基因编码赭曲霉氧化还原酶。
27.一种分离纯化的核酸，其中所述核酸序列为SEQ ID NO5。
28.一种分离的DNA，其中所述DNA序列为SEQ ID NO5。
29.一种分离的cDNA，其中所述cDNA序列为SEQ ID NO5。
30.一种分离的基因，其中所述基因序列为SEQ ID NO5。
31.一种基因的分离的等位基因，其中所述基因序列为SEQ IDNO5。
32.一种分离的蛋白，所述蛋白具有赭曲霉氧化还原酶的氨基酸序列。
33.一种分离的蛋白变异体，所述蛋白具有赭曲霉氧化还原酶的氨基酸序列。
34.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含赭曲霉氧化还原酶的氨基酸序列。
35.一种分离的蛋白，其中所述蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO6。
36.一种分离的蛋白变异体，其中所述蛋白的氨基酸序列为SEQID NO6。
37.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO6，并且具有至少一个保守氨基酸取代。
38.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO6至少99％相同的序列。
39.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO6至少95％相同的序列。
40.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO6至少90％相同的序列。
41.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO6至少75％相同的序列。
42.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列包含与SEQ ID NO6至少50％相同的序列。
43.一种分离纯化的核酸，所述核酸编码可以催化如下反应的酶3酮δ4，5类固醇(3酮δ4类固醇)、3酮δ4，5δ6，7类固醇(3酮δ4δ6类固醇)、3酮δ6，7类固醇(3酮δ6类固醇)或3酮δ1，2δ4，5类固醇(3酮δ1δ4类固醇)的11α羟化。
44.权利要求43的分离纯化核酸，其中所述酶不催化以下反应3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇或3酮δ6，7类固醇的15β羟化。
45.权利要求43或权利要求44的分离纯化核酸，其中所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD；(e)从孕甲酯丙酸酮(mexrenone)到11α羟基孕甲酯丙酸酮；(f)从6β孕甲酯丙酸酮到11α羟基6β孕甲酯丙酸酮；(g)从9α孕甲酯丙酸酮到11α羟基9α孕甲酯丙酸酮；(h)从12β孕甲酯丙酸酮到11α羟基12β孕甲酯丙酸酮；(i)从δ12孕甲酯丙酸酮到11α羟基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)从睾酮到11α羟基睾酮；(k)从孕酮到11α羟基孕酮；(l)从孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯；(m)从孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯。
46.权利要求45的分离纯化核酸，其中所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD。
47.权利要求46的分离纯化核酸，其中所述羟化反应是从坎利酮到11α羟基坎利酮。
48.一种表达蛋白的方法，所述蛋白能够催化3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇、3酮δ6，7类固醇或3酮δ1，2δ4，5类固醇的11α羟化，所述方法包括(a)用表达盒转化或转染宿主细胞，所述表达盒包含启动子和与之有效连接的编码所述蛋白的核酸，(b)在所述宿主细胞中表达所述蛋白。
49.权利要求48的生产蛋白的方法，所述方法还包括回收所述蛋白的步骤。
50.权利要求48或权利要求49的方法，其中所述蛋白是赭曲霉11α羟化酶。
51.权利要求50的方法，所述方法还包括表达电子供体蛋白，其中所述电子供体蛋白能够为催化以下反应的所述蛋白提供电子3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇、3酮δ6，7类固醇或3酮δ1，2δ4，5类固醇的11α羟化。
52.权利要求51的方法，其中所述电子供体蛋白选自人氧化还原酶和赭曲霉氧化还原酶。
53.权利要求51的方法，其中所述电子供体蛋白是赭曲霉氧化还原酶。
54.权利要求51的方法，其中编码所述类固醇11α羟化酶和所述电子供体蛋白的核酸在独立表达盒上。
55.权利要求51的方法，其中编码所述类固醇11α羟化酶和所述电子供体蛋白的核酸在同一表达盒上。
56.权利要求54或权利要求55的方法，其中所述类固醇11α羟化酶是赭曲霉11α羟化酶，所述电子供体蛋白是人氧化还原酶。
57.权利要求54或权利要求55的方法，其中所述类固醇11α羟化酶是赭曲霉11α羟化酶，所述电子供体蛋白是赭曲霉氧化还原酶。
58.权利要求48的方法，其中所述表达盒在表达载体上。
59.权利要求58的方法，其中所述表达载体是一种杆状病毒。
60.权利要求59的方法，其中所述杆状病毒是选自以下的核型多角体病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒和家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒。
61.权利要求60的方法，其中所述核型多角体病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。
62.权利要求58的方法，其中所述宿主细胞是昆虫细胞。
63.权利要求62的方法，其中所述昆虫细胞选自以下秋粘虫(Spodoptera frugiperda)细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞、苜蓿银纹夜蛾细胞和烟草天蛾(Manduca sexta)细胞。
64.权利要求63的方法，其中所述昆虫细胞是秋粘虫细胞。
65.权利要求48到权利要求64中任一项的方法，其中所述赭曲霉11α羟化酶是SEQ ID NO2。
66.权利要求48到权利要求64中任一项的方法，其中所述人氧化还原酶是SEQ ID NO4。
67.权利要求48到权利要求64中任一项的方法，其中所述赭曲霉氧化还原酶是SEQ ID NO6。
68.一种分离纯化的多肽，所述多肽能够催化以下反应3酮δ4，5类固醇(3酮δ4类固醇)、3酮δ4，5δ6，7类固醇(3酮δ4δ6类固醇)、3酮δ6，7类固醇(3酮δ6类固醇)或3酮δ1，2δ4，5类固醇(3酮δ1δ4类固醇)的11α羟化。
69.权利要求68的分离纯化多肽，其中所述酶不催化以下反应3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇或3酮δ6，7类固醇的15β羟化。
70.权利要求68或权利要求69的分离纯化多肽，其中所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD；(e)从孕甲酯丙酸酮到11α羟基孕甲酯丙酸酮；(f)从6β孕甲酯丙酸酮到11α羟基6β孕甲酯丙酸酮；(g)从9α孕甲酯丙酸酮到11α羟基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羟基12β孕甲酯丙酸酮；(i)从δ12孕甲酯丙酸酮到11α羟基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)从睾酮到11α羟基睾酮；(k)从孕酮到11α羟基孕酮；(l)从孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯；(m)从孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯。
71.权利要求70的分离纯化多肽，其中所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD。
72.权利要求71的分离纯化的酶，其中所述羟化反应是从坎利酮到11α羟基坎利酮。
73.一种表达盒，所述表达盒包含启动子以及与之有效连接的编码一种多肽的分离纯化核酸，所述多肽催化3酮δ4，5类固醇(3酮δ4类固醇)、3酮δ4，5δ6，7类固醇(3酮δ4δ6类固醇)、3酮δ6，7类固醇(3酮δ6类固醇)或3酮δ1，2δ4，5类固醇(3酮δ1δ4类固醇)的11α羟化。
74.权利要求73的表达盒，其中所述多肽不催化3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇或3酮δ6，7类固醇的15β羟化。
75.权利要求73或权利要求74的表达盒，其中所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD；(e)从孕甲酯丙酸酮到11α羟基孕甲酯丙酸酮；(f)从6β孕甲酯丙酸酮到11α羟基6β孕甲酯丙酸酮；(g)从9α孕甲酯丙酸酮到11α羟基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羟基12β孕甲酯丙酸酮；(i)从δ12孕甲酯丙酸酮到11α羟基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)从睾酮到11α羟基睾酮；(k)从孕酮到11α羟基孕酮；(l)从孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯；(m)从孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯。
76.权利要求75的表达盒，其中所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD。
77.权利要求76的表达盒，其中所述羟化反应是从坎利酮到11α羟基坎利酮。
78.一种表达盒，所述表达盒包含启动子以及与之有效连接的编码赭曲霉氧化还原酶的分离纯化核酸。
79.权利要求78的表达盒，其中所述核酸是SEQ ID NO06。
80.一种表达盒，所述表达盒包含编码从谷固醇合成依普利酮的代谢途径中一种酶的异源DNA，其中所述酶催化选自以下的至少一种转化(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从alona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD；(e)从孕甲酯丙酸酮到11α羟基孕甲酯丙酸酮；(f)从6β孕甲酯丙酸酮到11α羟基6β孕甲酯丙酸酮；(g)从9α孕甲酯丙酸酮到11α羟基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羟基12β孕甲酯丙酸酮；(i)从δ12孕甲酯丙酸酮到11α羟基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)从睾酮到11α羟基睾酮；(k)从孕酮到11α羟基孕酮；(l)从孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯；(m)从孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯；并且其中所述异源DNA与在重组宿主中表达其编码的酶所需的控制序列有效连接。
81.依照权利要求80的表达盒，所述表达盒的特征在于所述异源DNA编码序列选自以下属和物种赭曲霉、赭曲霉、黑曲霉(Aspergillusniger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、米根霉(Rhizopus oryzae)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、克罗斯韦假单胞菌(Pseudomonascruciviae)、粉红单端孢(Trichothecium roseum)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、蓝色梨头霉(Absidiacoerula)、灰绿梨头霉(Absidia glauca)、雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)、黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、白僵菌(Beauveria bassiana)、Botryosphaeria obtusa、Calonectria decora、螺卷毛壳(Chaetomium cochliodes)、山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicoa)、短刺小克银汗霉(Cunninghamellablakesleeana)、刺孢小克银汗霉(Cunninghamella echinulata)、雅致小克银汗霉(Cunninghamella elegans)、Curvularia clavata、弯孢(Curvularialunata)、Cylindrocarpon radicicola、Epicoccum humicola、卵形孢球托霉(Gongronella butleri)、金孢菌寄生(Hypomyces chrysospermus)、Monosporium olivaceum、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、大毛霉(Mucor mucedo)、灰蓝毛霉(Mucor griseocyanus)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)、Nocardia corallina、Paecilomyces carneus、展青霉(Penicillum patulum)、Pithomyces atroolivaceus、Pithomycescynodontis、Pycnosporium sp.、红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythrae)、黄瘤孢(Sepedonium chrysospermum)、Stachylidium bicolor、吸水链霉菌(Streptomyces hyqroscopicus)、浅绛红链霉菌(Streptomycespurpurascens)、总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)、Thamnostylum piriforme、Thielavia terricola和可可轮枝孢(Verticilliumtheobromae)、Cephalosporium aphidicola、Cochliobolus lunatas、Tieghemella orchidis、Tieghemella hyalospora、Monosporiumolivaceum、焦曲霉(Aspergillus ustus)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、灰绿轮枝孢(Verticillium glaucum)和Rhizopusnigricans。
82.依照权利要求81的表达盒，其中所述属和物种选自以下赭曲霉、赭曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、米根霉、匍枝根霉、弗氏链霉菌、巨大芽孢杆菌、克罗斯韦假单胞菌、粉红单端孢、尖镰孢、少根根霉和Monosporium olivaceum。
83.依照权利要求82的表达盒，其中所述属种是赭曲霉。
84.一种重组宿主细胞及其后代，所述重组宿主细胞及其后代包含至少一种依照权利要求80的表达盒。
85.依照权利要求84的重组宿主细胞及其后代，其中所述宿主是一种微生物。
86.依照权利要求85的重组宿主细胞及其后代，其中所述宿主是一种细菌。
87.一种制造一种或多种酶的方法，所述酶来自从谷固醇合成依普利酮的代谢途径，所述方法包括在表达和积累所述异源DNA所编码的一种或多种酶的条件下，在营养培养基中培养权利要求86的重组宿主细胞。
88.一种将化合物选择性氧化成为羟化产物的方法，所述方法包括下面步骤(a)在羟化所述化合物并积累所述羟化产物的条件下，在权利要求86的重组宿主细胞存在下温育需要羟化的化合物，然后(b)回收所述羟化产物。
89.一种在体外将化合物选择性羟化成为羟化产物的方法，所述方法包括下面步骤(a)在羟化所述化合物并积累所述羟化产物的条件下，在用权利要求88的方法生产的酶存在下温育需要羟化的化合物，然后(b)回收所述羟化产物。
90.携带权利要求73到83中任一项的表达盒的宿主细胞。
91.权利要求90的宿主细胞，其中所述表达盒整合入所述宿主细胞的染色体。
92.权利要求90的宿主细胞，其中所述表达盒整合入一种表达载体。
93.一种测定克隆的11α羟化酶的比活的方法，所述方法包括下面步骤(a)用表达载体转化宿主细胞，所述表达载体包含编码所述11α羟化酶的核酸；(b)在所述宿主细胞中表达所述11α羟化酶；(c)从所述细胞制备亚细胞膜组份；(d)将所述亚细胞膜组份微粒体与类固醇底物温育，然后(e)监测所述类固醇底物转化为其11α羟基类固醇对应物的转化情况。
94.权利要求93的方法，所述方法还包括用编码氧化还原酶的表达载体核酸转化宿主细胞，然后在所述宿主细胞中表达所述氧化还原酶。
95.权利要求94的方法，其中所述氧化还原酶来自人或赭曲霉。
96.权利要求95的方法，其中所述氧化还原酶是人氧化还原酶。
97.权利要求95的方法，其中所述氧化还原酶是赭曲霉氧化还原酶。
98.一种具有SEQ ID NO2的蛋白及其变异体，所述变异体与SEQID NO2至少95％相同，它们催化3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇、3酮δ6，7类固醇或3酮δ1，2δ4，5类固醇的11α羟化，其中所述羟化反应选自以下(a)从坎利酮到11α羟基坎利酮；(b)从雄甾烯二酮到11α羟基雄甾烯二酮；(c)从aldona到11α羟基aldona；(d)从ADD(1，4雄烯二烯二酮)到11α羟基ADD；(e)从孕甲酯丙酸酮到11α羟基孕甲酯丙酸酮；(f)从6β孕甲酯丙酸酮到11α羟基6β孕甲酯丙酸酮；(g)从9α孕甲酯丙酸酮到11α羟基9α孕甲酯丙酸酮；(h)12β孕甲酯丙酸酮到11α羟基12β孕甲酯丙酸酮；(i)从δ 12孕甲酯丙酸酮到11α羟基δ12孕甲酯丙酸酮；(j)从睾酮到11α羟基睾酮；(k)从孕酮到11α羟基孕酮；(l)从孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮6，7-二内酯；(m)从孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯到11α羟基孕甲酯丙酸酮7，9-二内酯。
99.权利要求98的蛋白，所述蛋白不催化3酮δ4，5类固醇、3酮δ4，5δ6，7类固醇或3酮δ6，7类固醇的15β羟化。
100.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ IDNO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25。
101.一种纯化免疫原性多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ IDNO2的至少十个连续残基。
102.一种分离纯化的抗体，所述抗体对具有SEQ ID NO2氨基酸序列的11α羟化酶具有结合特异性。
103.权利要求102的抗体，所述抗体结合选自以下的蛋白区(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO2的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQ ID NO24；(e)氨基酸SEQ ID NO25。
104.权利要求102或权利要求103的抗体，其中所述抗体在肽柱上纯化，其中所述肽选自(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO2的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQ ID NO24；(e)氨基酸SEQ ID NO25。
105.一种纯化多肽，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO26。
106.一种纯化免疫原性多肽，所述多肽的氨基酸序列包含SEQ IDNO6的至少十个连续残基。
107.一种分离纯化的抗体，所述抗体对具有SEQ ID NO6氨基酸序列的11α羟化酶具有结合特异性。
108.权利要求107的抗体，所述抗体结合选自以下的蛋白区(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。
109.权利要求107或权利要求108的抗体，其中所述抗体在肽柱上纯化，其中所述肽选自(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。
110.一种组合物，所述组合物包含权利要求102、103、104、107、108或109的抗体以及有效载体、媒介物或辅助剂。
111.一种组合物，所述组合物包含权利要求102、103、104、107、108或109的抗体以及溶液。
112.权利要求102、103、104、107、108或109的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
113.权利要求102、103、104、107、108或109的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
114.权利要求102、103、104、107、108或109的抗体，所述抗体缀合免疫亲和基质。
115.一种方法，其利用权利要求114的免疫亲合基质从生物体液或细胞裂解物中纯化多肽。
116.权利要求114的抗体，其中所述免疫亲和基质是SEPHAROSE 4B。
117.一种方法，其利用权利要求116的免疫亲合基质从生物体液或细胞裂解物中纯化多肽。
118.一种使用肽柱纯化抗体的方法，其中所述肽选自以下(a)SEQ ID NO2的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO2的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO23；(d)氨基酸SEQ ID NO24；(e)氨基酸SEQ ID NO25。
119.一种使用肽柱纯化抗体的方法，其中所述肽选自以下(a)SEQ ID NO6的N末端氨基酸1-10；(b)SEQ ID NO6的最后10个C末端氨基酸；(c)氨基酸SEQ ID NO26。
120.一种检测生物体液中的第一种多肽的方法，其中所述第一种多肽是11α羟化酶或氧化还原酶，所述方法包括以下步骤(a)使所述体液与第二种多肽接触，所述第二种多肽对所述第一种多肽具有结合特异性，然后(b)测定所述第二种多肽的存在，从而确定所述第一种多肽的水平。
121.权利要求120的方法，其中所述第二种多肽是抗体。
122.权利要求120或权利要求121的方法，其中所述第二种多肽进行了放射性标记。
123.一种生产分离核酸的方法，所述方法包括在6XSSC中于65℃使SEQ ID NO1与基因组DNA杂交，然后分离用SEQ ID NO1检测到的核酸。
124.根据权利要求123的方法制备的分离DNA核酸。
125.一种分离的核酸，所述核酸在高度严格条件下与SEQ IDNO1序列的互补物特异性杂交。
123.一种生产分离核酸的方法，所述方法包括在6XSSC中于65℃使SEQ ID NO5与基因组DNA杂交，然后分离用SEQ ID NO5检测到的核酸。
124.根据权利要求123的方法制备的分离DNA核酸。
125.一种分离的核酸，所述核酸在高度严格条件下与SEQ IDNO5序列的互补物特异性杂交。
126.一种DNA构建物，当将所述DNA构建物插入细胞的染色体DNA时，所述DNA构建物改变通常在所述细胞内不表达的类固醇11α羟化酶基因的表达，所述DNA构建物包括a)导向序列；b)调节序列；c)类固醇11α羟化酶的结构基因。
127.携带权利要求126的DNA构建物的宿主细胞。
128.携带克隆的11α羟化酶的宿主细胞的应用，所述宿主细胞用于生产治疗性用于治疗心脏病、炎症、关节炎或癌症的药物。
129.一种组合物，所述组合物包含约0.5-500g/L糖蜜，0.5-50g/L玉米浆，0.5-50g/L KH2PO4，2.5-250g/L NaCl，2.5-250g/L葡萄糖和0.04-4g/L孕酮，pH 3.5-7。
130.一种组合物，所述组合物包含约10-250g/L糖蜜，1-25g/L玉米浆，1-25g/L KH2PO4，5-125g/L NaCl，5-125g/L葡萄糖和0.08-2g/L孕酮，pH4.5-6.5。
131.一种组合物，所述组合物包含约25-100g/L糖蜜，2.5-10g/L玉米浆，2.5-10g/L KH2PO4，12.5-50g/L NaCl，12.5-50g/L葡萄糖和0.2-8g/L孕酮，pH5.5-6.0。
132.一种组合物，所述组合物包含约50g/L糖蜜，5g/L玉米浆，5g/L KH2PO4，25g/L NaCl，25g/L葡萄糖，20g/L琼脂和0.4g/L孕酮，pH5.8。
133.权利要求129-132中任一项的组合物，所述组合物还包含约4-100g/L琼脂。
134.权利要求129-132中任一项的组合物，所述组合物还包含约10-40g/L琼脂。
135.权利要求129-132中任一项的组合物，所述组合物还包含约20g/L琼脂。
136.权利要求129-135中任一项的组合物的应用，所述组合物用于生产选自以下的微生物的孢子赭曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、米根霉、匍枝根霉和粉红单端孢、尖镰孢、少根根霉、Monosporiumolivaceum、产黄青霉(Penicillum chrysogenum)和蓝色梨头霉。
136.权利要求129-135中任一项的组合物的应用，所述组合物用于生产赭曲霉孢子。
全文摘要
本发明涉及新型细胞色素P450样酶(赭曲霉)，所述酶分离自赭曲霉孢子mRNA产生的cDNA文库。当编码所述11α羟化酶的cDNA与编码作为电子供体的人氧化还原酶的cDNA在秋粘虫(Spodopterafrugiperda)(Sf－9)昆虫细胞内共表达时，根据HPLC分析，所述11α羟化酶成功催化从类固醇底物4－雄烯－3，17－二酮(AD)到11α－羟基－AD的转化。本发明还涉及与这些cDNA有关的核酸分子或衍生自这些cDNA的核酸分子，包括它们的互补物、同源物和片段，以及使用这些核酸分子产生例如多肽及其片段的方法。本发明还涉及产生识别赭曲霉11α羟化酶和氧化还原酶的抗体，以及使用这些抗体检测分别在未改变的宿主细胞和转化的宿主细胞内的这些天然和重组多肽的存在的方法。本发明还提供下面方法在异源宿主细胞内分别表达或联合表达曲霉(Aspergillus)11α羟化酶基因和人或曲霉氧化还原酶，以便有利于类固醇底物到它们的11α羟基对应物的生物转化。
文档编号C07K16/40GK1531590SQ01821405
公开日2004年9月22日 申请日期2001年10月26日 优先权日2000年10月30日
发明者苏珊尼·博尔藤, 罗伯特·克莱顿, 阿伦·伊斯顿, 勒斯利·恩格尔, 迪安·梅辛, J·S·吴, B·雷茨, M·C·瓦尔克, P·T·王, 克莱顿, 恩格尔, 伊斯顿, 吴, 梅辛, 王, 瓦尔克, 苏珊尼 博尔藤 申请人:法马西亚公司