一种AFB₁降解菌及降解酶的制作方法

专利名称：一种AFB₁降解菌及降解酶的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种AFB1降解菌及降解酶。
背景技术：
自1960年英国火鸡暴发霉菌毒素疾病以来，世界各地对霉菌毒素中毒症进行了大量的调查研究。目前，已知有300多种真菌可产生霉菌毒素，主要的霉菌毒素包括黄曲霉素(aflatoxin)、玉米赤霉烯酮、赭曲霉素、单端孢烯和橘霉素等。这些毒素分布较广，已从大量的饲料原料和混合饲料中分离出。在各种霉菌毒素中，黄曲霉素被认为是最严重、毒性最大的一种，这是因为它可使肝中毒，并具有很强的抑制免疫，致癌、致突变和致畸性。根据联合国粮农组织(FAO) 2002年资料，世界上约有25%的谷物不同程度地受到霉菌毒素的污染，而危害饲料最严重的有黄曲霉、镰刀菌和青霉三种。这些霉菌主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物，其中玉米和小麦的阳性检出率可分别高达45%和20%以上。动物在采食含有不同剂量黄曲霉毒素的日粮时，将表现为生长受阻、采食量减少、饲料利用率降低、被毛粗乱、精神沉郁、厌食、免疫抑制、肝损伤、黄疸、凝血病、贫血、出血性腹泻等不同症状，严重时可导致动物死亡。另外，饲料霉变后营养物质平均损失15%，甚至完全失去饲用价值。据报道，全球每年因霉毒素污染粮食和饲料所造成的经济损失高达数千亿美元。2011年12月24日，国家质量监督检验检疫总局公布了对全国液体乳产品进行抽检结果，蒙牛乳业(眉山)有限公司生产的一批次产品被检出黄曲霉毒素Ml超标140%，究其原因是由于奶牛食用霉变饲料所引发，一时轰动了全国，产生了严重的不良影响。因而，寻找有效的方法来降低或消除霉菌毒素的危害，变得越来越重要。

发明内容
本发明的目的在于提供一种AFB1 (全称黄曲霉毒素B1)降解菌及降解酶。为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下
一种AFB1降解菌该降解菌为米曲霉(Aspergillus oryzane) A0YIN2012Y8,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC No. 5817，保藏日期2012年02月28日，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号。一种降解酶，按下法制备获得
(IXAFB1降解菌的固体发酵培养
将米曲霉(Aspergillus oryzane) A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817 接种于 PDA 固体培养基中，28 30°C恒温培养，待孢子大量生长时收获，用接种环将孢子刮下，用含有O. 5^0. 7 %Tween 80的生理盐水将孢子浓度调整至I. OX IO8 CFU/mL,按每30g固体发酵培养基接种5^7 mL进行接种，混合均匀后于28 3(TC恒温培养5 7 d后收获，得固体发酵培养物；
(2),AFB1降解酶粗酶液的制备
将步骤(I)获得的固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，室温浸泡，浸泡完成后先过滤，之后将滤液离心，取上清液经盐析、透析纯化得AFB1降解酶粗酶液；
(3)、凝胶层析分离AFB1降解酶粗酶液，浓缩、冻干即得AFB1降解酶。所述固体发酵培养基按如下方法制备按质量比(6 7): (2^3):(广2)称取麸皮、玉米、豆柏，麸皮、玉米与豆柏的总和为10，而后以固体水=1: (O. 8^1. I)质量比加水，搅拌均匀后，高压蒸汽灭菌。盐析、透析和凝胶层析均采用本领域常规操作方法，并且透析时，采用截留分子量为14 KDa的透析袋；凝胶层析时，所用凝胶为S印hadex G-100，分离范围为4 150 KDa0进一步，透析时，以10 mM、pH 7. 4的Tris-HCl为缓冲液；凝胶层析时，上样速度为3 4mL/5min，洗脱速度为3 4 mL/10 min,以O. 025 M KC1-0. I M Hac为洗脱液。本发明以腐烂的有机质作为AFB1降解菌的主要来源，制备的降解酶对AFB1具有较 强的黄曲霉毒素分解能力，其最高降解率达80. 12%。


图I =AFB1降解菌提取基因组DNA电泳检测 图2 =AFB1降解菌基因组DNA扩增26S rDNA ITS区序列后电泳检测 图3 =AFB1降解菌ITS区测序结果 图4 =AFB1降解菌与同源性较高菌株的系统发育分析 图5 :凝胶层析分离AFB1降解酶后蛋白电泳检测 图6 :凝胶层析分离AFB1降解酶对AFB1的降解图。
具体实施例方式AFB1降解菌的筛选用生理盐水将AFB1溶解制成浓度为100 Pg/L的溶液，而后均匀地涂布于PDA固体培养基上；按液固比mL/g，用生理盐水将腐烂的有机质进行IO5倍稀释，而后均匀涂布于表面含有AFB1的PDA固体培养基上，29°C恒温培养6d，每天观察菌落的变化情况，其中出现最早及长势较好的菌落，被认为目的单菌落(具有较强的黄曲霉毒素分解能力)A0YIN2012Y8，在中国微生物菌种保藏中心的登记编号为CGMCC No. 5817，其形态学特征为该菌株在在PDA培养基上生长迅速，固体发酵培养的24 h时既有菌丝大量生长，之后孢子大量产生，至72 h时培养基即被孢子包裹，呈黄褐色。挑取菌丝显微镜观察，菌丝有隔膜，分生孢子串生。AFB1降解酶，按下法制备获得
(IXAFB1降解菌的固体发酵培养
将AFB1降解菌A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817接种于PDA固体培养基中，29°C恒温培养，待孢子大量生长时(约6d)收获，用接种环将孢子刮下，用含有O. 5% (体积)Tween 80的生理盐水将孢子浓度调整至I. OX IO8 CFU/mL,按每30g固体发酵培养基接种5 mL孢子生理盐水溶液进行接种，混合均匀后于29°C恒温培养6 d后收获，得固体发酵培养物；
(2),AFB1降解酶粗酶液的制备
按照固液比g/ml=l:2的比例将步骤(I)获得的固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，室温浸泡I h (浸泡过程中间断搅拌)，浸泡完成后先用8层纱布过滤，之后将滤液在10000 Xg条件下离心5 min，在上清液中按80 %的饱和度加入硫酸铵(517 g/L)，边加边搅拌(持续时间约20 min)，之后静止4 h或过夜(4°C )，再在3000转/分下，离心15 min，取沉淀装于截留分子量14 KDa的透析袋中，置于10 mM Tris-HCl (pH 7. 4)的烧杯中，在磁力搅拌器的搅拌下透析，每30 min换10 mM Tris-HClCpH 7. 4),选用蒸懼水或自来水作对照，用10% (W/V)氯化钡溶液检查硫酸根离子的浓度，3 4 h透析完毕，透析袋内液体即为AFB1降解酶粗酶液，作凝胶层析用；
(3)、凝胶层析分离AFB1降解酶粗酶液，凝胶层析所用凝胶为Sephadex G-100，分离范围为4 150 KDa
加样首先用f 2倍柱床体积的O. 025 M KC1-0. I M Hac洗脱液平衡柱子，使柱床稳定；上样前先将柱子上端的洗脱液全部吸出，用滴管将步骤(2)的粗酶液加入柱子顶部，打开出水口，待粗酶液渗入胶床后，关闭出水口，上样速度为3 mL/5min ；
洗脱柱上端用洗脱液充满后用3 mL/10 min的速度开始洗脱，采用收集管收集洗脱液(共用了 15个收集管，每管收集约4ml)，浓缩、冻干即得AFB1降解酶。
其中，所述PDA固体培养基为常规培养基，按如下方法制备葡萄糖20.0 g，可溶性淀粉 6.0 g,MgSO4 ·7Η20 0.3 g，KH2PO4 1.0 g，酵母 2 g，大豆蛋白胨 5 g，琼脂粉 15 g，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL，在121°C、1.034X 105 Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min，冷却至50°C倾倒平板，凝固后保存于4°C冰箱备用。所述固体发酵培养基按如下方法制备按质量比6:3:1称取麸皮、玉米、豆柏，而后以固体(麸皮+玉米+豆柏)蒸馏水=1:1质量比加水，搅拌均匀后按每瓶30 g分装于250 mL三角瓶中，在121 °C、I. 034 X IO5 Pa条件下高压蒸汽灭菌。黄曲霉毒素购自Sigma公司；凝胶层析所用凝胶选择Pharmacia Biotech公司 Sephadex G-100,分离范围为 4-150 KDa0性能测试 I、测试方法
I.I、SDS-PAGE蛋白电泳检测AFB1降解酶
电泳样品的处理取层析后的不同收集管内的洗脱液20 μ L与蛋白质电泳通用缓冲液按I :1 (V/V)混合均匀，在100°C条件下处理3 min使酶蛋白变性稳定，之后立即放入冰浴中冷却。用移液枪将处理后的样品移入浓缩胶的点样孔中。在浓缩胶中在80 V电压下电泳，待样品通过浓缩胶之后，调高电压至120 V直至电泳结束。染色及脱色将凝胶从电泳装置上小心取下，用至少5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，放在平缓摇动的振荡器上室温染色过夜。移出后，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝脱色液中，平缓摇动，待脱色液颜色变深时，更换脱色液，直至凝胶空白区域无色为止。取出凝胶放于无色玻璃板上，拍照保存。I. 2、AFB1降解酶对毒素的降解
选取SDS-PAGE电泳检测后有条带、蛋白质分子量基本相同的收集管内的洗脱液进行合并(第5和6管合并，第7、管合并，第10和11管合并，第12 14管合并)，取合并液各6mL,加入AFBi使其浓度约为100 μ g/L,混合均勻后置于30°C恒温气浴振荡器中恒温培养，48 h后取样测定其中AFB1含量。I. 3、黄曲霉毒素B1含量测定
采用德国RIDASCREEN公司Aflatoxin BI 30/15酶联免疫测定试剂盒对AFBi含量进行测定。
1.4、AFB1降解菌的菌种鉴定
米用 26S rDNA ITS (Internal Transcribed Space)区序列分析对 AFB1 降解真进行菌种鉴定。挑取固体PDA培养基平板中降解菌纯培养单菌落2个(A0YIN2012Y8 CGMCCNo. 5817和Z9)接种于PDA液体培养基(葡萄糖20. O g，可溶性淀粉6. O g，MgSO4 · 7H20
0.3g，KH2 PO4 1.0 g，酵母2 g，大豆蛋白胨5 g，用蒸馏水溶解后定容至1000 mL，在121°C、
1.034X IO5 Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min)中，培养48 h后过滤取菌体。采用真菌基因组DNA提取方法提取降解菌株的基因组DNA，经O. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，然后使用TakaRaFungi Identification PCR Kit (Code No. D317)进行 PCR 扩增目的片段。PCR 扩增的条件为引物浓度O. 5 ymol/L (上游引物为Y -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3;，下游引物为 5' -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3' )、Mg2+ 浓度为 2. O 2. 5 mmol/L、dNTP 浓度为 O. 2mmol/L、Taq酶的用量为I. 2 U、DNA模板用量为50 60 ng。PCR反应条件为先94°C预 变性I min，94°C变性30 sec，68°C退火I min，72°C延伸3 min，5个循环，后94°C变性30sec，62°C退火I min，72°C延伸3 min，30个循环，最后72°C延伸10 min。目的基因片段经
O.8%琼脂糖凝胶电泳和切胶回收后进行DNA测序。测序结果在NCBI数据库中进行Blast同源序列分析，选取同源性较高的序列运用MEGA 4软件进行系统发育分析，构建系统发育树。I. 5、数据处理
试验数据采用SAS 6. 12软件进行统计分析，借助最小显著极差法对数据进行差异显著性检验。2、结果与分析
2.1 AFB1降解菌的菌种鉴定
2.I. I AFB1降解菌基因组DNA电泳检测图
见图1，M为标样DNA( λ-Hind III digest),自上而下条带的大小依此为=23130,9416,6557、4361、2322、2027 bp ;1、2 为两株 AFB1 降解菌 A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817 和 Z9 的DNA。从图I可以看出，所提取的AFB1降解菌A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817和Z9的基因组DNA在23 Kb处均有明显条带，鉴定结果显示所提取基因组DNA无弥散和降解。2. I. 2菌株ITS区域PCR扩增产物电泳图
使用 TakaRa Fungi Identification PCR Kit (Code No. D317)扩增出大小约为 650 bp的条带，电泳图如图2，M为DL2，000 DNA Marker,自上而下条带的大小依此为2000、1000、750、500、250、100 bp ;1、2 为两株 AFB1 降解菌 A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817 和 Z9 的的 PCR扩增产物，3为正对照一检测PCR反应体系是否正常，4为负对照一检测被测样品的DNA是否被污染。Takara公司所测降解菌A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817的26S rDNA ITS区序列测定结果如图3所示。2. I. 3降解AFB1真菌系统发育分析
测序结果在NCBI数据库中Blast比对，选取同源性较高的菌株序列进行系统发育分析，结果如图4所示。结果显示降解菌A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817在系统发育树中与米曲霉(Aspergillus oryzae)属于同一分支,序列同源性约99%,因此可以确定AFB1降解菌A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817 为米曲霉。2. 2凝胶层析后分离AFB1降解酶后蛋白电泳检测图见图5，第6泳道为200 KDa蛋白质Marker，自上而下条带的大小依此为2000、1000、750、500、250、100 bp ;其余为凝胶层析洗脱过程中各收集管。从图5中可以看出，降解AFBi菌株Y8凝胶层析后从第5管开始有明显条带。第5和6管(第5和7泳道)有较明显条带蛋白质分子量基本相同，蛋白分子量大小分别为109. 4和80. 4 KDa0第7_9管(第8_10泳道)蛋白质分子量基本相同，大小约为80. 4、61. 7和58. 5 KDa0第10和11管(第11和12泳道)蛋白质分子量分别33. 7 KDa0第12-14管(第13-15泳道)蛋白质分子量分别为27. 6KDa。2. 4凝胶层析分离AFB1降解酶对AFB1的降解图
见图6，I为凝胶层析第5、6管(蛋白质分子量为109. 4和80. 4 KDa )，2为第7_9管(蛋白质分子量为80. 4、61. 7和58. 5 KDa )，3为第10、11管(蛋白质分子量为33. 7 KDa，4为第12-14管(蛋白质分子量为27.6 KDa )，5为降解AFB1的空白对照。由图6可知，降解菌株Y8凝胶层析后第10和11管对AFB1的降解率最高，降解率约为54. 33%，其相应的蛋白质分子量为33. 7 KDa0 2. 5 AFB1降解酶的进一步纯化及对AFB1的降解作用
由于图6中第3处理组(第10、11管)的层析液对AFB1的降解能力最强(54. 33%)，但蛋白质的纯度不高。为了提高蛋白的纯度，采用超滤膜截留分子量大于40 KDa的蛋白质，并浓缩分子量为33. 7 KDa处的蛋白质。进一步的AFB1酶解试验证明，浓缩和纯化后分子量为33. 7 KDa的酶蛋白质对AFB1酶解率高达80. 12%。通过对AFB1降解酶蛋白的热变性试验证明，酶蛋白在100°c下处理15 min，酶的活力仅剩余22. 45%，充分证明了 33. 7 KDa大小的物质就是一种可降解AFB1的蛋白质酶。3、结论
从自然界中筛选到一株可产生黄曲霉毒素B1降解酶的真菌A0YIN2012Y8 CGMCCNo. 5817，经26S rDNA鉴定为米曲霉。黄曲霉毒素降解酶对AFB1的最大降解率为80. 12%，其蛋白质分子量为33.7 KDa0
权利要求
1.一种AFB1降解菌，其特征在于该降解菌为米曲霉(Aspergillus oryzane) A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817。
2.—种AFB1降解酶，其特征在于按下法制备获得(IXAFB1降解菌的固体发酵培养将米曲霉(Aspergillus oryzane) A0YIN2012Y8 CGMCC No. 5817 接种于 PDA 固体培养基中，28 30°C恒温培养，待孢子大量生长时收获，用接种环将孢子刮下，用含有O. 5^0. 7 % Tween 80的生理盐水将孢子浓度调整至I. OX IO8 CFU/mL,按每30g固体发酵培养基接种 5^7 mL孢子生理盐水溶液进行接种，混合均匀后于28 30°C恒温培养5 7 d后收获，得固体发酵培养物；(2),AFB1降解酶粗酶液的制备将步骤(I)获得的固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，室温浸泡，浸泡完成后先过滤，之后将滤液离心，取上清液经盐析、透析纯化得AFB1降解酶粗酶液；(3)、凝胶层析分离AFB1降解酶粗酶液，收集、浓缩、冻干即得AFB1降解酶。
3.如权利要求2所述的AFB1降解酶，其特征在于所述固体发酵培养基按如下方法制备按质量比(6 7) : (2^3) : ( f 2)称取麸皮、玉米、豆柏，麸皮、玉米与豆柏的总和为10， 而后以固体水=1: (O. 8 I. I)质量比加水，搅拌均匀后，高压蒸汽灭菌。
4.如权利要求2所述的AFB1降解酶，其特征在于透析时，采用截留分子量为14KDa 的透析袋；凝胶层析时，所用凝胶为Sephadex G-100,分离范围为4 150 KDa0
5.如权利要求4所述的AFB1降解酶，其特征在于透析时，以10mM、pH 7.4的 Tris-HCl为缓冲液；凝胶层析时，上样速度为3 4mL/5min，洗脱速度为3 4mL/10min，以O.025 M KC1-0. I M Hac 为洗脱液。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了一种AFB1降解菌及降解酶。该降解菌为米曲霉(Aspergillusoryzane)AOYIN2012Y8CGMCCNo.5817。将米曲霉(Aspergillusoryzane)AOYIN2012Y8CGMCCNo.5817接种于PDA固体培养基中，28~30℃恒温培养，待孢子大量生长时收获，用接种环将孢子刮下，用含有0.5~0.7%Tween80的生理盐水将孢子浓度调整至1.0×108CFU/mL，每30g固体发酵培养基接种5~7mL，于28~30℃恒温培养5~7d后收获；将固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，室温浸泡，过滤、离心，取上清液经盐析、透析、凝胶层析分离，浓缩、冻干即得AFB1降解酶。本发明降解酶对AFB1具有较强的分解能力，其最高降解率达80.12%。
文档编号C12R1/69GK102925361SQ201210283758
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月10日 优先权日2012年8月10日
发明者尹清强, 左瑞雨, 王平, 刘俊熙, 王潇, 常娟, 郑秋红 申请人:河南普爱饲料股份有限公司, 河南农业大学