专利名称：手性丙酰胺和丙酸类化合物、生物催化合成方法以及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种手性丙酰胺及丙酸类化合物，微生物催化的去不对称化合成方法，以可转化腈化物的菌株Rhodococcus sp.GCMCC 0497(即红球菌GCMCC 0497)为催化剂，取代丙二腈或丙二酰胺为底物，得到各种手性丙酰胺及丙酸类化合物。这些产物可用于合成光学纯的α，α-二取代α-氨基酸。
李祖义、吴中柳发明了名称为‘一种红球菌sp.D12、培养方法及用途’的发明专利(CN 00127452.x)，该微生物可转化腈化物的菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，编号为CGMCC0497，分类命名为红球菌sp.D12(Rhodococcus sp.D12)。为本发明提供了可能性。
至今虽然有很多小组致力于此类氨基酸的合成，但是如何用简单易行的方法大量制备光学纯的产品仍然是个问题(TetrahedronAsymmetry 1998，9，3517-3599).
本发明目的是提供一种合成手性α，α-二取代α-氨基酸的重要中间体手性丙酰胺及丙酸类化合物。
本发明目的还提供一种合成上述手性丙酰胺及丙酸类化合物的高效方法。即通过微生物催化的方法，高效地得到合成此类氨基酸的重要中间体手性丙酰胺及丙酸类化合物。
本发明的另一目的是提供一种手性丙酰胺及丙酸类化合物的用途。即通过常规反应转化成手性α，α-二取代α-氨基酸。
本发明的手性丙酰胺及丙酸类化合物具有如下的结 R1＝CN，CONH2R2＝COOH，CONH2构式本发明的化合物还可以如下表述 如 上述结构式中X＝H，卤素、CnHn+1、OCH3、NO2或OH；R＝CnHn+1、CH2＝CHCH3或环丙基；n＝0-4。
本发明的方法可用反应式描述如下 其中X、R、R1、R2或n如上所述。
本发明方法中用于催化的微生物已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，编号为CGMCC 0497，分类命名为红球菌sp.D12(Rhodococcus sp.D12)。
具体来说，本发明采用微生物催化的方法，以可转化腈化物的菌株Rhodococcus sp.GCMCC 0497(即红球菌GCMCC 0497)为催化剂，以结构式为 的底物，其中R4＝CN或CONH2，在或不在有机溶剂中，4-40℃反应5-200小时，其中按湿菌体与底物的重量比计算为5-500∶1，产物为各种手性丙酰胺及手性丙酸类化合物。反应中还可进一步增加菌体用量，但对反应没有影响，其中X、R或n如上所述，R4＝CN或CONH2。
所述的底物也可以是结构式为 的取代丙二腈或丙二酰胺，其中X、R或n如上所述。
所述的有机溶剂可以是极性溶剂如甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、乙酸乙酯等，也可以是非极性溶剂如石油醚、苯、甲苯、乙醚、异丙醚等。
反应结束后，反应液经处理得到手性丙酰胺及丙酸类化合物。例如用离心处理(8000-18000rpm，5-30min，4-30℃)，取上层清液，调节pH值至9-14，用有机溶剂提取、浓缩得到本发明的产物手性丙酰胺或手性丙酸类化合物及回收原料。如用乙酸乙酯萃取(50ml×3)，分别得到水相和有机相。有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析纯化，得到手性丙酰胺及回收的原料。调节水相pH值至1-5，用乙酸乙酯萃取(50ml×3)，合并有机相，同上步骤洗涤、干燥、减压蒸除溶剂、纯化，得到手性丙酸类化合物。
本发明方法所用菌株Rhodococcus sp.GCMCC 0497既可以是休止的细胞、生长中的细胞，也可以是固定化的细胞。在用于催化反应前可先将上述湿菌体或固定化细胞悬浮于水或pH 5-10的缓冲液中，上述缓冲溶液可以是K2HPO4-KH2PO4或Na2HPO4-NaH2PO4或三羟甲基氨基甲烷(即Tris)-HCl缓冲液等。经过活化的菌株更有利于上述催化反应。
本发明所用的原料可由丙二腈或丙二酸二甲酯制得。通过本发明的反应方法得到的手性丙酰胺及丙酸类化合物通过常规反应就可以转化成手性α，α-二取代α-氨基酸。
这些产物可用于合成光学纯的α，α-二取代α-氨基酸。具体途径如下
本发明采用微生物催化方法，得到光活的α，α-二取代丙酰胺酸、α，α-二取代丙酸腈或α，α-二取代丙酰胺腈等重要的手性中间体，再通过常规反应转化成手性α，α-二取代α-氨基酸催化效率高，过程简洁，产率高，产品光学活性好，可用于大规模生产。催化效率高，过程简洁，产率高。
实施例1.底物2-苄基-2-甲基丙二腈的合成 2-苄基丙二腈1.56g溶于50ml丙酮中，加入碘甲烷2.84g，无水碳酸钾3.45g，反应结束后用硅藻土滤去固体，滤液旋干过柱，得产物1.67g，yield 98％.白色固体m.p.94.3-95.3℃，Lit.94.5-95.5℃1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ7.35-7.45(m，5H，Ar-H)，3.22(s，2H，CH2)，1.81(s，3H，CH3).IR(KBr)νmax/cm-13070，3034，2994，2251(CN)，1604，1496，1456，1259，1129，765，703.MS m/z(rel.Intensity％)170(M+，1.0)，115(1.6)，92(8.0)，91(100)，89(6.9)，65(15.9)，63(7.4)，62(3.7)，52(11.6)，51(12.4).
实施例2.休止细胞法催化的去不对称化取适量新培养的菌体2-20g，悬浮于20-80ml pH 5-10的K2HPO4-KH2PO4或Na2HPO4-NaH2PO4或Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl缓冲液中。在4-40℃搅拌活化0.5hr。将底物100mg溶于0-1.5ml助溶剂中，慢慢加入。同样温度下电磁搅拌，TLC跟踪反应进程。反应5-200小时，反应结束后，反应液离心处理(8000-18000rpm，5-30min，4-30℃)，取上层清液，调节pH值至9-14，用乙酸乙酯萃取(50ml×3)，分别得到水相和有机相。有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析纯化，得到酰胺及回收的原料，快速柱层析分离。调节水相pH值至1-5，用乙酸乙酯萃取(50ml×3)，合并有机相，同上步骤洗涤、干燥、减压蒸除溶剂、纯化，得到酸，快速柱层析分离。
实施例3.不同条件下Rhodococcus sp.CGMCC 0497催化α-苄基-α-甲基丙二腈的去不对称化 Entr pH T Time(S)-b cd (R)-ey(℃ (h) ％ ％％(yield)％) (yield/ee. (yield/ee. (yield/ee.
) ) )1 7.1072 44/508/70R 41 5/＞9802 7.20123 - 14/ND -84/9603 7.307252/＞99 35/49R7 -047.30112 - 48/1.2S -52/95058.309014/99 39/15S -46/93068.307245/81 50/30R - -9反应方法同实施例2产物数据如下(S)-2-氰基-2-甲基-3-苯基丙酰胺 白色固体m.p.96.5-97.5℃1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ7.40-7.20(m，5H，Ar-H)，6.04(s，br，1H，NH)，5.52(s，br，1H，NH)，3.26(d，1H，J＝13.5Hz，CH)，2.96(d，1H，J＝13.5Hz，CH)，1.66(s，3H，CH3).IR(KBr)νmax/cm-13423，3378，3320，3192，2244(CN)，1694(C＝O，1666，1622，1498，1454，1402，1247，740，701.MS m/z(rel.Intensity％)189(M++1，2.9)，188(M+，20.6)，173(M+-CH3，3.6)，144(M+-CONH2，19.0)，117(6.4)，115(7.9)，92(7.8)，91(100)，78(12.9)，65(10.7).Anal.Calcd.for C11H12N2OC，70.19；H，6.43；N，14.88.FoundC，69.98；H，6.51；N，14.81.2-苄基-2-甲基丙二酰胺 白色固体m.p.195.4-196.4℃，Lit.202-203℃1H NMR(300 MHz，DMSO)δ7.22-7.12(m，9H，ArH，2NH2)，3.06(s，2H，CH2)，1.10(s，3H，CH3).IR(KBr)νmax/cm-13389，3205(NH)，1692，1663，1644，1496，1371，1170，702.MS m/z(rel.Intensity％)206(M+，7.4)，189(9.5)，162(M+-CONH2，100)，160(41.3)，145(39.5)，117(38.3)，115(26.7)，91(69.2)，90(21.2)，44(19.6).(R)or(S)-2-氰基-2-甲基-3-苯基丙酸 白色固体m.p.94.6-95.6℃1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ7.40-7.20(m，5H，Ar-H)，6.04(s，br，1H，NH)，5.52(s，br，1H，NH)，3.26(d，1H，J＝13.5Hz)，2.96(d，1H，J＝13.5Hz)，1.66(s，3H，CH3).IR(KBr)νaxx/cm-13423，3378，3320，3192，2244(CN)，1694，1666(C＝O)，1622，1498，1454，1402，1247，740，701.MS m/z(rel.Intensity％)189(M+，2.2)，174(M+-CH3，3.3)，144(M+-COOH，2.7)，115(4.9)，92(46)，91(100)，65(11.4)，51(15.3).(R)-2-甲基-2-苄基丙酰胺酸 白色固体m.p.117.9-118.9℃，Lit.120-121℃94％ee，[α]D15-15.01(c 1.07，MeOH)；88％ee，[α]D17-13.09(c 1.20，MeOH).{Lit.[α]D-4.4(c 0.5，MeOH)，R}1H NMR(300 MHz，(CD3)2O)δ7.29-7.19(m，5H，ArH)，3.61(br s，3H，NH2，OH)，3.25(d，1H，J＝13.8Hz)，3.20(d，1H，J＝13.5Hz)，1.37(s，3H，CH3).IR(KBr)νmax/cm-13423，3204，3034，1745(C＝O)，1659(C＝O)，1598，1399，1371，1256，1192，1095，736，705.MS m/z(rel.Intensity％)207(M+，1.9)，180(1.5)，163(15.5)，148(25.2)，131(15.5)，117(20.2)，91(100)，78(15.2)，65(19.2)，44(48.2).
实施例4.Rhodococcus sp.CGMCC0497催化α-苯乙基-α-甲基丙二腈的去不对称化 Entr T Timeb c d ey(℃) (h)％ ％％(yield％(yield/ee. (yield/ee. ) (yield/ee.
)) )1 30 1251/44-39-2 30 2448/49 4/53 38-3 30 90 - 6/10 - 90/99反应方法同实施例2产物数据如下(S)-2-苯乙基-2-氰基丙酰胺 白色固体m.p.85.5-86.5℃44％ee，[α]D21+7.56(c 1.376，CHCl3).49％ee，[α]D21+8.03(c 0.986，CHCl3).1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.34-7.19(m，5H，Ar-H)，6.36(s，br，1H，NH)，5.82(s，br，1H，NH)，3.85-2.69(m，2H，CH2)，2.34-2.24(m，1H，CH)，2.04-1.94(m，1H，CH)，1.64(s，3H，CH3).IR(KBr)νmax/cm-13412，3190(NH)，2928，2860，2241(CN)，1692(C＝O)，1623，1498，1458，1396，1362，1158，810，718，697，600.MS m/z(rel.Intensity％)203(M++1，1.0)，202(M+，1.0)，158(M+-CONH2，0.9)，115(4.0)，104(23.5)，98(100)，92(12.7)，91(36.6)，70(26.0)，68(13.0)，65(14.6).Anal.Calcd.for C12H14N2OC，71.26；H，6.98；N，13.85.FoundC，71.28；H，6.95；N，13.88.2-苯乙基-2-甲基丙二酰胺 白色固体m.p.169.3-170.3℃1H NMR(300 MHz，DMSO)δ7.30-7.11(m，9H，ArH，2NH2)，2.47-2.41(m，2H，CH2)，2.02-1.96(m，2H，CH2)，1.32(s，3H，CH3).IR(KBr)νmax/cm-13417，3371，3250，3214(NH)，1652(C＝O)，1624，1602，1453，1354，1173，1093，755，701，656，555.MS m/z(rel.Intensity％)220(M+，0.1)，219(0.8)，205(0.1)，204(1.4)，187(1.6)，159(2.6)，131(13.10，116(100)，99(30.4)，91(33.1)，88(11.9)，71(35.0)，65(12.7)，44(12.4).Anal.Calcd.for C12H16N2O2C，65.43；H，7.32；N，12.72.FoundC，65.18；H，7.09；N，12.62.2-苯乙基-2-甲基丙酰胺酸 白色固体＞99％ee，[α]D15-4.72(c 0.924，CHCl3).1H NMR(300 MHz，(CD3)2O)δ12.5(br s，1H，OH)，7.39-7.05(m，5H，ArH)，2.62-2.56(m，2H，CH2)，2.21-2.17(m，2H，CH2)，1.53(s，3H，CH3).IR(KBr)νmax/cm-13449，3313，3250(NH)，2500-3250(br OH)，3028，2929，2577，1919，1710(C＝O)，1650(C＝O)，1456，1372，1264，1204，742，699.MS m/z(rel.Intensity％)222(M++1，10.6)，178(M+-CONH2，32.1)，161(6.5)，117(7.3)，91(42.2)，73(100)，65(13.6)，44(20.0).
实施例5.Rhodococcus sp.CGMCC 0497催化α，α-二取代丙二酰胺类底物的转化 entryaX T(℃) Concentration yieldee. (％)(g/L) (％)1n＝1H201.25 97 ＞98 R2n＝1H302.594 97 R3n＝2H302.594 ＞99 R4n＝1CH3302.597 ＞99 R5n＝1F302.595 ＞99 R6n＝1Cl 302.592 ＞99 Ra所有反应时间均为一天反应方法同实施例2。所有底物均能完全转化，得到唯一产物α，α-二取代丙酰胺酸，分离产率90％以上，ee值97％以上。产物数据如下(R)-2-(4′-氯苄基)-2-甲基丙酰胺酸 白色固体＞99％ee，[α]D21-12.99(c 0.83，MeOH)1H NMR(300 MHz，(CD3)2O)δ12.1(br s，1H，OH)，7.31-7.23(m，5H，ArH，NH)，6.91(br s，1H，NH)，3.25(d，1H，J＝13.8Hz，CH)，3.20(d，1H，J＝13.2Hz，CH)，1.41(s，3H，CH3).IR(KBr)νmax/cm-13403，3227，2800-3300(br OH)，2570，1727(C＝O)，1688(C＝O)，1609，1492，1371，1263，1197，1096，873，833，609.MS m/z(rel.Intensity％)243(M++2，0.5)，241(M+，1.4)，199(8.2)，197(M+-CONH2，25.1)，184(14.5)，182(44.1)，167(7.2)，165(21.3)，153(17.3)，127(33.0)，125(100)，115(17.5)，44(34.0).(R)-2-(4′-甲基苄基)-2-甲基丙酰胺酸 白色固体＞99％ee，[α]D21-11.18(c 0.96，MeOH).1H NMR(300 MHz，(CD3)2O)δ12.4(br s，1H，OH)，7.27(brs，1H，NH，7.11，7.05(AB，4H，J＝8.1Hz，ArH)，6.91(brs，1H，NH)，3.19(s，2H，CH2)，2.27(s，3H，CH3)，1.41(s，3H，CH3).IR(KBr)νmax/cm-13451，3329，3083，2850-3350(br，OH)，1745(C＝O)，1670(C＝O)，1643，1600，1513，1398，1368，1259，1193，820，539，495.MS m/z(rel.Intensity％)221(M+，3.1)，177(21.8)，162(16.8)，145(14.8)，133(19.2)，132(14.8)，117(15.9)，105(100)，91(14.8)，44(14.8).
实施例6.(S)-α-甲基苯丙氨酸的合成 (R)-2-甲基-2-苄基丙酰胺酸12mg溶于DMF中，加入溴乙烷，无水碳酸钾固体10mg，反应结束后液倒入水中，用乙醚萃取，硫酸镁干燥，旋干过柱得到产物中加入Hg(OAc)2固体77mg，无水MeOH 0.24ml，N-溴代丁二酰亚胺固体46mg，反应结束后倒入水中，乙醚萃取，硫酸钠干燥，旋干过柱后加入20％HCl水溶液，加热回流，结束后将水蒸干，得到的浅黄色固体，纯化得到白色固体34mg，yield 85％.产物数据如下白色固体1H NMR(300 MHz，D2O)δ7.22-7.19(m，3H，ArH)，7.10-7.07(m，2H，ArH)，3.11(d，1H，J＝14.4Hz，CH)，2.79(d，1H，J＝14.4Hz，CH)，1.37(s，3H，CH3).IR(KBr)νmax/cm-13474，3261，3032，2500-3300(br，OH)，1650(C＝O)，1582，1402，1370，744，701.MS(ESI)202([M+Na]+)，180([M+H]+)实施例7.(R)-α-甲基苯丙氨酸的合成 (R)-2-氰基-2-甲基-3-苯基丙酸50mg溶于少量乙醚，加入二氯亚砜0.5ml，加热回流5小时后溶于1ml丙酮，加入NaN3水溶液(0.2ml)。1小时后用乙醚萃取，过滤后加无水甲醇2ml，缓缓加热，2小时后蒸干过柱，得到产物加入20％HCl水溶液3ml，加热回流，结束后将水蒸干，得到的浅黄色固体，纯化得到白色固体，yield 84％.
实施例8.(S)-α-甲基高苯丙氨酸的合成 方法同实施例6产物数据如下白色固体99％ee，[α]D16+37.5(c 0.60，HCOOH).1H NMR(300 MHz，D2O)δ 7.23-7.18(m，2H，ArH)，7.13-7.10(m，3H，ArH)，2.55-2.49(m，1H，CH)，2.44-2.35(m，1H，CH)，2.02-1.92(m，1H，CH)，1.89-1.78(m，1H，CH)，1.38(s，3H，CH3).IR(KBr)νmax/cm-13448，3028，2569，2500-3200(br，OH)，1653(C＝O)，1605，1553，1404，1364，749，699.MS(ESI)216([M+Na]+)，194([M+H]+)
权利要求
1.一种手性丙酰胺及丙酸类化合物，其特征是具有如下的结构式 其中R1＝CN、CONH2；R2＝COOH、CONH2；、X＝H，卤素、CnHn+1、OCH3、NO2或OH；R＝CnHn+1、CH2＝CHCH3或环丙基；n＝0-4。
2.如权利要求1所述的一种手性丙酰胺及丙酸类化合物，其特征是具有如下的结构式 其中R1、R2、X或R如权利要求1所述。
3.如权利要求1所述的一种手性丙酰胺及丙酸类化合物，其特征是具有如下的结构式 其中X、R、n如权利要求1所述。
4.如权利要求1所述的一种手性丙酰胺及丙酸类化合物的合成方法，其特征是以如下结构式为底物 R4＝CN，CONH2，在或不在有机溶剂中，4-40℃反应5-200小时，其中按湿菌体与底物的重量比计算为5-500∶1，产物为各种手性丙酰胺及丙酸类化合物，其中X、R、n如权利要求1所述。
5.如权利要求4所述的一种手性丙酰胺及丙酸类化合物的合成方法，其特征是将反应液的上层清液，调节pH值至9-14，用有机溶剂提取、有机相浓缩得到手性丙酰胺或手性丙酸类化合物及回收原料。
6.如权利要求4所述的一种手性丙酰胺及丙酸类化合物的合成方法，其特征是将反应液的上层清液，调节pH值至9-14，用有机溶剂提取后的水相，调节pH值至1-5，有机溶剂提取，有机相浓缩得到手性丙酸类化合物。
7.如权利要求4所述的一种手性丙酰胺及丙酸类化合物的合成方法，其特征是所述的菌株Rhodococcus sp.GCMCC0497是休止的细胞、生长中的细胞或固定化的细胞。
8.如权利要求4所述的一种手性丙酰胺及丙酸类化合物的合成方法，其特征是在催化反应前可先将所述的菌株Rhodococcus sp.GCMCC 0497的湿菌体或固定化细胞悬浮于水或pH 5-10的缓冲液中。
9.如权利要求4所述的一种手性丙酰胺及丙酸类化合物的合成方法，其特征是所述的缓冲溶液是K2HPO4-KH2PO4或Na2HPO4-NaH2PO4或三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液。
10.如权利要求1所述的一种手性丙酰胺及丙酸类化合物的用途，其特征是用于合成手性α，α-二取代α-氨基酸。
全文摘要
本发明涉及如右结构式的一种手性丙酰胺及手性丙酸类化合物:X=H,卤素、CnHn+1、OCH
文档编号C07C235/00GK1384096SQ0211190
公开日2002年12月11日 申请日期2002年5月31日 优先权日2002年5月31日
发明者李祖义, 吴中柳 申请人:中国科学院上海有机化学研究所