用于合成和选择性生物催化修饰肽、肽模拟物和蛋白的方法

专利名称：用于合成和选择性生物催化修饰肽、肽模拟物和蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种使用离子性液体来酶促合成和/或选择性修饰肽、肽模拟物和/或蛋白的方法，并涉及离子性液体作为唯一的反应介质或与水和/或有机溶剂组合用于抑制水解和蛋白水解副反应的应用。
背景技术：
合成和选择性修饰肽、肽模拟物和蛋白对于系统研究作为功能基因产物的多肽的结构-功能关系的重要性渐增，并对于新的有效治疗的发现具有重要的贡献(参见H.-D.Jakubke，PeptideChemie undBiologie，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Berlin，Oxford，1996)。但是，它们的合成或选择性修饰中的重要问题是化学方法缺乏选择性和通用性，底物限制或者在使用酶作为催化剂的情况下发生多种副反应。
原则上，肽化学中提出的化学方法可以用于合成肽、肽模拟物和蛋白。但是，这些方法受到许多限制并增加产物的复杂性。虽然平均链长度为50-60个氨基酸的肽可以由固相肽合成直接获得，但是由于每种情况下的偶合产率不是定量的，因此通常进一步的链延长导致蓄积了多数副产物，从而导致合成产率降低，并复杂化或妨碍目标产物的纯化。因此，目前用于合成较长的多肽或蛋白的方法基于合成制备的肽片断的缩合，似乎完全受保护的肽片断的连接仅在例外情况下是可能的，因为通常离析物的溶解度非常低。
这些方法，基于在1953年第一次提出的以下概念未受保护的肽片断的化学CN连接的分子支架(T.Wieland等人，Annalen 1953，583，129；M.Brenner等人，Helv.Chim.Acta 1957，40，1497)、胺和硫醇截留的研制方法(D.S.Kemp等人，J.Org.Chem.1975，40，3465；N.Fotouhi等人，J.Org.Chem.1989，54，2803)、天然化学连接(M.Schnlzer，S.B.H.Kent，Science 1992，256，221；P.E.Dawson等人，Science 1994，266，776)或醛方法(C.-F.Lin，J.P.Tam，Proc.Natl Acad.Sci.USA 1994，91，6584)，确定选择性进行，但要求它们实现相当特异性的N-或C-末端氨基酸残基，因而它们的应用存在序列-特异性先决条件。在目前认可的天然化学连接的情况下，用C-末端硫酯部分将合成肽与必须包含N-末端半胱氨酸残基的第二肽或蛋白连接。利用关于蛋白接合的知识，可以将天然化学连接进一步发展成为内含肽介导的蛋白连接(expressed protein ligation，EPL；参见特别是T.W.Muir等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 1998，95，6705；G.J.Cotton等人，J.Am.Chem.Soc.1999，121，1100)，其中羧基组分的硫酯部分来自已与裂解组分内含肽融合和通过硫解裂解形成的重组蛋白。除了需要在氨基组分的N-末端的半胱氨酸残基，进一步的一般缺点在于不能排除的C-末端氨基酸残基的部分差向异构，因为所形成(至少当将硫酚用作催化剂时)的硫酯不仅在酯交换之后，还直接通过所加入的氨基组分的末端α-氨基而受到亲核试剂攻击。
催化合成方法给待合成的肽键提供较高的灵活性，虽然至少根据性质仍不知道有关制备的通用的肽连接酶。例如，催化抗体(参见特别是P.G.Schultz，R.A.Lerner，Science 1995，269，1835；G.MacBeath，D.Hilvert，Chem.BioL 1996，3，433；D.B.Smithrub等人，J.Am.Chem.Soc.1997，119，278)表现CN连接酶活性，基于GCN4的卷曲螺旋基元(K.Severin等人，Nature 1997，389，706)或基于由强酸性卷曲螺旋肽(S.Yao，J.Chmielewski，Biopolymers 1999，51，370)组成的肽模板的合成肽连接酶也是如此。所有这些情况对于肽连接酶设计而言其有用的起点是不容置疑的，但它们对于连接要求有特定的先决条件，因此它们的一般适用性受到大大地限制。虽然肽酶的反向催化潜能的利用(参见特别是W.Kullm ann，Enzymatic Peptide Synthesis，CRC Press，Boca Raton，1987；H.-D.Jakubke，Enzymatic Peptide Synthesis，inThe PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，Vol.9，(Eds.S.Udenfriend，3.Meienhofer)，Academic-Press，New York，1987，Chapter 3)总体上在特定的必要条件下提供酶连接肽片断的可能性，但不保证连接的特定肽键的不可逆性，且在其中存在所用肽酶的潜在裂解位点之前不能排除在待连接或终产物的片断中不期望的蛋白水解裂解。虽然不同肽酶如枯草溶菌素的再设计改善肽键形成的催化潜能并还可由要求片断缩合来证明(参见特别是D.Y.Jackson等人，Science 1994，266，243)，但通过这种方式不能消除上述的缺点。虽然关于肽和蛋白片断的CN连接提出的底物模拟物概念(F.Bordusa等人，Angew.Chem.1997，109，2583；ReviewF.Bordusa，Braz.J Med.Biol.Res.2000，72，469)具有不可逆性的优点，它同样要求使用合成、蛋白水解非活性蛋白酶变体以防止待连接的生物聚合物内的竞争性裂解。
为了肽、肽模拟物和蛋白的修饰，化学方法(参见T.Imoto，H.Yamada，Chemical Modification，in Protein Function.A PracticalApproach(T.E.Creighton，ed.)pp.247-277，IRL Press，1989；G.E.Means，R.E.Feeney，Chemical Modification of Proteins，Holden-Day，1971)在蛋白研究中已起着，并仍然起着重要的作用。尽管NMR技术在过去取得快速进展，它在过去的十年中使全信号排布成为可能，并因此能够阐明至多150-200个氨基酸蛋白(未修饰)的3D结构，但化学修饰仍是一种在溶液中测定三维结构的工具，因为大蛋白不顺从NMR结构分析，且X-射线结构分析要求蛋白结晶，这在很多情况下是不能获得的。
由于N-末端α-氨基是优选的选择性修饰的目标，在蛋白和肽中无所不在地存在的赖氨酸基团的ε-氨基不允许任何在N-末端靶向引入标记和报道基团。化学酰化反应用醛或者主要用活性酯如N-羟基琥珀酰亚胺-或4-硝基苯基酯来完成，但是采用它其它蛋白源氨基酸残基的侧链官能化也可能反应，因此排除选择性Nα-修饰。仅用酶法引入苯基乙酰基作为肽合成范围内的氨基酸保护基，并确定青霉素酰化酶对于天然作用的逆转的特异性(R.Didziapetris等人，FEBS Lett.1991，287，31)，并通过相同的酶再次裂解出来(参见ReviewA.Reidel，H.Waldmann，J.prakt.Chem.1993，335，109)。与这种直接保护基引入不同的是，已经描述的唯一的方法是基于在肽酶的催化下转移已经N-末端标记的在P1位具有肽酶特异性氨基酸残基的氨基酸或肽衍生物，并不可避免地具有不可逆性。它的一个例外是最初由肽和蛋白片断的CN连接形成的底物模拟物概念(F.Bordusa等人，Angew.Chem.1997，109，2583ReviewF.Bordusa，Braz.J Med.Biol.Res.2000，72，469)。虽然这种方法具有直接和选择性引入标记和报道基因的优点，但如前述它要求使用合成、蛋白水解非活性蛋白酶变体作为生物催化剂以防止待标记的生物聚合物的竞争性裂解。
不仅可以通过靶向酶工程还可以通过反应介质操作来抑制用于合成和修饰肽、肽模拟物和蛋白的水解酶的水解和蛋白水解副反应。文献描述使用水和有机溶剂的单相混合物，在水和有机溶剂不混溶的情况下使用类似二相体系，使用基本上没有或者仅有少量水含量的纯有机溶剂，使用冷冻或超冷却的水性或有机体系，使用超临界溶液和使用基本上没有或仅有少量溶剂含量的非均相的低共熔混合物(参见特别是W.Kullmann，Enzymatic Peptide Synthesis，CRC Press，Boca Raton，1987；H.-D.Jakubke，Enzymatic Peptide Synthesis，inThe PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology，Vol.9，(Eds.S.Udenfriend，J.Meienhofer)，Academic Press，New York，1987，Chapter 3)。但是，基本上所有这些方法通常使酶活性或稳定性大幅降低，并在某些情况下要求可观的仪器的复杂性。其它因素是仅完全研究了少数方法对较长链生物聚合物的合成和修饰的可用性。但是，即使在这些情况下，迄今这些方法都不能表现出常规应用要求的效率和通用性。
一类新的溶剂的代表是具有低熔点的盐。关于这些还称为离子性液体的溶剂体系，在最初的研究中表现对蛋白和酶的稳定化影响(ReviewC.M.Gordon，Appl.Catal.AGen.2001，222，101)。脂酶和半乳糖苷酶的简单模型反应还表明这些液体对反应速率以及有时对酶反应的选择性有积极的作用(U.Kragl等人，Chimica Oggi 2001，19，22；T.L.Husum等人，Biocatal.Biotrans.2001，19，331；S.H.Schofer等人，Chem.Commun.2001，425)。简单氨酸酯底物的实例还表明丝氨酸蛋白酶糜蛋白酶和枯草溶菌素在具有高比例的这些液体的反应体系中都有酶活性，并催化酯的水解及其酯交换(J.A.Laszlo，D.L.Compton，Biotechnol.Bioeng.2001，75，181；T.L.Husum等人，Biocatal.Biotrans.2001，19，331)。关于通过蛋白酶嗜热菌蛋白酶由Z-Asp-OH和H-Phe-OMe合成Z-Asp-Phe-OMe，也已证明了用于在平衡-控制合成条件下二种氨基酸的蛋白酶催化的连接的离子性液体的总体上的合适性(M.Erbeldinger等人，Biotechnol.Prog.2000，16，1131)。但是，完全不知道是否肽片断可以在这种液体中进行的动力学控制的反应中通过蛋白酶选择性连接以及是否肽与蛋白的N-末端报道和标记部分的选择性引入在这些条件下由酶催化。同样并不清楚离子性液体对反应物的蛋白水解副反应和所用底物上的水解副反应的程度的影响。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于酶促合成和修饰肽、肽模拟物和蛋白的方法，它克服了现有技术所述方法的缺点。本发明的另一个目的是提供一种这种的方法，其中顺序独立的合成，特别是连接和N-末端修饰局部和立体选择性地进行，同时反应物或反应产物上不发生蛋白水解和水解副反应。
根据本发明，所述目的是通过用于合成肽、肽模拟物和/或蛋白和/或用于选择性N-末端修饰肽、肽模拟物和/或蛋白的方法来实现的，所述方法具有以下步骤a)提供氨基组分，其中该氨基组分具有至少一个氨基酸，b)提供羧基组分，其中该羧基组分在羧基上具有离去基团，且该羧基组分是具有至少一个氨基酸的化合物或具有至少一个标记或报道基团的化合物，c)使该氨基组分与该羧基组分在具有一种或多种离子性液体的反应介质中，在蛋白酶、肽酶和/或水解酶存在下反应，以在氨基组分和羧基组分之间形成肽键，并消除离去基团。
一个优选的实施方案是，根据本发明的方法还包括以下步骤d)通过本身已知的方法分离或富集所得的肽、肽模拟物和/或蛋白。
此外，本发明涉及将离子性液体用作唯一溶剂或与水和/或有机溶剂组合用于用于合成和/或N-末端修饰肽、肽模拟物和/或蛋白的应用。本发明还涉及蛋白酶、肽酶和/或水解酶用于合成和/或N-末端修饰肽、肽模拟物和蛋白的应用，其中该肽、肽模拟物和蛋白或其N-末端标记的种类是通过连接氨基组分和羧基组分来制备的，而该羧基组分含有离去基团。
其它实施方案根据以下的从属权利要求和下列说明是清楚的。
根据本发明，肽指具有大约2-10个氨基酸的氨基酸缩合产物。根据本发明，多肽指具有大约10-100个氨基酸的氨基酸缩合产物。根据本发明，术语蛋白用于具有多于大约100个氨基酸的氨基酸缩合产物，其中文献认为这二种术语之间的转变是容易的。
根据本发明，肽模拟物指模仿或对抗本身不具有典型的仅包含编码的氨基酸的肽结构的肽的生物活性的化合物。肽模拟物的实例不仅是完全的非肽有机化合物(例如包含脂环族和芳香族结构的吗啉或纳洛酮)，还是具有被修饰的氨基酸的化合物(例如N-，α-和β-烷基化氨基酸；Cα-Cβ和N-Cβ环化氨基酸；具有被修饰的侧链的肽，例如α-，β-脱氢氨基酸、硝基酪氨酸等)以及环肽类似物(具有C-末端或氨基酸侧链的N-末端的环化；具有氨基酸侧链的C-末端的环化和具有氨基酸侧链的氨基酸侧链的环化)和具有被修饰的肽键的肽，所述肽键有例如硫代酰胺、酮亚甲基、乙烯、亚甲基胺或其它逆-倒位(retro-inverso)衍生物等。逆-倒位衍生物是具有肽骨架结构R-C-NH-CO-C-R‘的化合物，其中与正常肽键相比氨基官能团和羧酸官能团的位置互换，而正常肽键具有结构R-C-CO-NH-C-R‘。
与盐熔化不同的是，离子性液体是在低温(＜100℃)下熔化并仅由离子组成的盐(Lit.例如参见T.Welton，Chem.Rev.1999，2071-2083)。根据这种定义，水因此不是离子性液体。特征性特点是它们的低对称性、低分子间相互作用和良好的电荷分布。典型的阳离子包含季化杂原子，例如季化铵-或季化磷离子。例如，亚组为N-烷基化咪唑离子如1-乙基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑；N-烷基化吡啶例如4-甲基-N-丁基-吡啶或类似取代的铵-和磷离子。典型的阴离子可以是无机或有机性质，例如氯化物、溴化物、氯铝酸盐(cloraluminat)、硝酸盐、苯磺酸盐、三氟甲磺酸盐、甲苯磺酸盐或四氟硼酸盐。
起始于先前在现有技术中观察到的现象完全和部分用反应惰性溶剂置换作为反应介质的水导致活性损失至酶失活，本发明基于意外的发现可以在高合成速率和选择性地酶催化下，使用离子性液体作为唯一的溶剂或与水和/或有机溶剂组合作为反应介质，将具有离去基团的羧基组分，该羧基组分是肽、肽模拟物，蛋白或标记或报道基团，与优选为肽、肽模拟物和蛋白的氨基组分连接。
此外，本文中还令人惊奇的是通常进行的副反应，例如羧基组分和离去基团之间的键的水解和本发明反应物或产物中对应于酶特异性的肽键的蛋白水解基本上不进行。一般通过将离去基团以酯、硫酯或酰胺的形式连接在羧基组分的C-末端羧基官能团而给羧基组分提供离去基团。因此，根据本发明的方法基于令人惊奇的发现离子性液体或它们的混合物与基本上所有的其它有机溶剂不同的是，对酶的合成活性有有利的影响，同时基本上完全抑制通常由水溶剂参与的不期望的副反应。离子性溶剂与包含酶特异性离去基团的羧基组分的联用还使合成活性独立于所获得的酶的原始底物特异性，从而决定性地增加所述方法的合成应用的范围。
已发现，目前研究的所有丝氨酸-和半胱氨酸蛋白酶表现出上述的行为，并因此特别适用于合成和修饰肽、肽模拟物和蛋白的根据本发明的方法的范围。其它适宜的酶可以在筛选方法的范围内，使用适宜的模型反应来获得，它可以根据本文公开的技术教导来完成。
在这种筛选方法中，其过程是通过合成模型反应来研究离子性液体或其混合物中的蛋白酶、肽酶和/或水解酶的合成活性。为此目的，在最简单的情况下，将由一个氨基酸组成的羧基组分(常规的羧基组分或底物模拟物)与氨基组分，在最简单的情况下为一个酰胺或氨基酸，但优选肽和待测试的蛋白酶、肽酶或水解酶一起温育。离子性液体对酶的耐受性由在后续温育期中的产物形成来表明。产物形成本身可以被分析，例如通过HPLC或其它色谱分离法来分析。
根据本发明，优选的蛋白酶为半胱氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶。但是，原则上也可以使用所有其它已知类型的蛋白酶，也可加入天冬氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。其它有用的水解酶组具体是脂酶或酯酶。根据本发明，所用的肽酶(EC 3.4.11-3.4.19)原则是可以是已知的肽酶亚组。关于水解酶、肽酶和蛋白酶的定义，具体参见RmppChemielexikon，9th edition，1989-1992。
根据本发明的方法的其它优点基于与大部分化学方法相比所用的酶的区域特异性和外消旋化风险的缺少。这在具有手性中心的反应物的范围内是有利的，而其它可酰基化官能团可以在不使用导致附加的副反应的实验上复杂的临时和选择性的阻断方法的情况下使用。唯一的例外是在某些情况下需要将N-末端保护基引入羧基组分，这在羧基组分的N-末端序列比氨基组分的N-末端序列对酶具有较高特异性的时候变得特别必要。此外，与选择性化学方法相比，对进入反应的反应物的顺序基本上没有限制。
根据本发明，所用的酶可以是蛋白酶、肽酶和/或水解酶。这些酶优选对羧基组分的离去基团和/或某些氨基酸或氨基酸类具有选择性或特异性。根据本发明，离去基团和/或这些氨基酸或氨基酸类可以优选是由所用的酶天然识别的化合物。根据本发明，它们还可以优选是结构类似的化合物(底物模拟物)。
本文所用的术语氨基组分和羧基组分是相对于待合成的多肽定义的。术语氨基组分指提供至少一个与羧基或其衍生物，例如已用离去基团衍生的羧基反应形成肽键的氨基的化合物。所述氨基组分优选为氨基酸，更优选为多肽或蛋白。在后者的情况下，多肽或蛋白具有氨基末端和羧基末端。羧基末端是未受保护或受保护的形式。为避免与其它反应基团，例如氨基组分的其它分子中的氨基反应，氨基组分的羧基通常并优选为非活化的形式。还优选氨基组分的Nα-氨基官能团未受保护地存在，且这种Nα-氨基官能团与羧基组分的羧基官能团反应。
羧基组分优选为配备羧基官能团的标记-或报道基团，或为氨基酸，或者更优选为多肽或蛋白。与氨基，通常为氨基组分的N-末端氨基反应形成肽键的羧基组分的羧基官能团或基团通常并优选是活化的。
本发明优选羧基组分的离去基团选自未取代或取代的-O-烷基-、-O-芳基-、-S-烷基-、-S-芳基-基团、-NH-烷基-、-NH-芳基-、-N，N-二烷基-、-N，N-二芳基-和-N-芳基-N-烷基-基团，同样优选羧基组分的离去基团被一个或多个羧酸基团、磺酸基团或磺酸酯取代。在此实例中，术语烷基还包括环烷基和杂环烷基。有用的杂原子具体是N、O和S。优选具有5-6个环碳原子的环烷烃或杂环烷烃。根据本发明，烷基包括正烷基和支链烷基，其中优选具有1-5个碳原子的正烷基。
在此实例中，术语芳基具体包括取代和未取代的苯基，其优选在苯环上被胍基和/或脒基取代。此处的术语芳基还包括稠环体系。优选联苯；和非稠环体系，例如萘基，它可以继而优选被胍基和/或脒基取代；以及杂类似体系，例如喹啉或异喹啉。此处的术语芳基还包括具有5-6个环原子的杂芳香化合物，其中一个或多个环碳原子优选被N、O和/或S取代。实例为吡啶子基、噻吩-、呋喃-、吡唑-或咪唑基团。
特别优选羧基组分的离去基团为4-胍基苯基、4-脒基苯基、4-胍基苯硫基或4-脒基苯硫基或者其结构同系物。
在羧基组分中，离去基团优选与羧基组分的羧基形成酯或酰胺，更优选在羧基组分的C-末端羧基上形成。如已经详述，离去基团的特异性识别最终将酶活性修饰成这样的效果，即肽片断或标记-和报道基团还通过蛋白酶、水解酶或肽酶而不是具有酶特异性氨基酸残基的反应物连接。
关于精氨酸-特异性蛋白酶，例如胰蛋白酶，从4-胍基苯基酯离去基团上检测到这种特异性调解作用。类似的功能还可以从脒基苯基酯上观察到。此外，由于结构同系，4-胍基苯基硫酯和4-脒基苯基硫酯类似物具有类似的作用，且在化学合成中也具有优点。这些化合物的结构同系物同样用作特异性调节的离去基团。
结构同系物是具有碱性基团的这些化合物的衍生物，所述碱性基团例如氨基、脒基、胍基和亚氨基部分，它们与决定特异性的蛋白酶的氨基酸残基相互作用，即特别是这些氨基酸残基直接或间接地与底物相互作用，或者影响催化反应，并在特定的碱性部分和酯或酰胺官能之间具有例如带1-6个亚甲基单元的链长度的脂肪族或芳香族碱性结构或者苯、萘或吲哚碱性结构，作为羧基组分的羧基和离去基团之间的连接元件。在图示意义上，这同样适用于对谷氨酸或天门冬氨酸具有主要特异性的酶，例如V8蛋白酶，其差别在于不是脂肪族或芳香族碱性结构的碱性基团而是酸性部分如羧基或磺酸基团被结合。以类似的方式，仅由所监测的碱性结构组成，即没有任何碱性或酸性基团的酯或酰胺构成含有对疏水氨基酸残基具有优先特异性的酶，例如糜蛋白酶和枯草溶菌素的羧基组分。
根据本发明，优选根据所用的蛋白酶、肽酶和/或水解酶的特异性改变离去基团。
在进一步优选的实施方案中，包含离去基团的羧基组分具有以下结构Y-(Xaa)n-R其中Y＝N-末端保护基或为H，Xaa＝任何α-氨基酸、β-氨基酸或其衍生物，或者为标记-或报道基团，R为离去基团，特别是离去基团，其选自未取代和取代的-O-烷基-、-O-芳基-、-S-烷基-、-S-芳基-基团，优选4-胍基苯基-、4-脒基苯基-、4-胍基苯硫基-、4-脒基苯硫基-基团(其中的每一个基团可以被磺酸基或磺酸酯取代)，或者所述基团的结构同系物，n为1-1000，优选30-500，更优选30-250的整数。
在本文中，术语烷基和芳基如以上定义，并还包括如上述的环烷烃、杂环烷烃、稠环体系和非稠环体系，以及上述优选的实施方案。
同样优选羧基组分为选自以下的标记-或报道基团含羧基的荧光标记，例如荧光素、若丹明、四甲基若丹明、2-氨基苯甲酸；含羧基的同位素标记，例如含13C-、15N-和17O-的氨基酸或肽片断；自旋标记物，例如含硝基氧化物标记的氨基酸和脂肪酸衍生物；生物素；包含羧基的交联剂，例如重氮乙酸酯、重氮丙酮酸酯、对硝基苯基-3-重氮丙酮酸酯；2-(1，2-二硫代茂烷(Dithiolan)-3-基)乙酸酯；N，N′-1，2-亚苯基二马来酰亚胺；N，N′-1，4-亚苯基二马来酰亚胺。所述的所有衍生物具有已在酶反应之前提供一种上述定义的离去基团的羧基。在这方面，所述的荧光标记物不是完全的羧基组分，而是转移到氨基组分的部分。
氨基组分和羧基组分连接形成多肽或选择性修饰的多肽或其类似物，其中氨基组分的C末端对应于多肽的C-末端，而羧基组分的氨基末端对应于在酶影响下连接的多肽的氨基末端或者对应于引入的标记-和报道基团。合成或修饰的多肽的长度是至少二个氨基酸。典型地，根据本发明制备的多肽或蛋白的长度的大小为1-1000个氨基酸，更优选30-1000个氨基酸，甚至更优选50-600个氨基酸，最优选100-300个氨基酸。
氨基组分的大小可以小至一个氨基酸。氨基组分的长度不需要有任何上限，但如果有的话，它最终取决于所用的酶的特异性和反应动力学考虑，例如氨基组分的扩散速率。典型的氨基组分的大小为1-1000个氨基酸，更优选30-500个氨基酸，更优选30-250个氨基酸。但是，氨基组分的长度明显较大的情况也在本发明的保护范围之内，特别是在根据本发明的方法的实施方案中进行顺序的酶或蛋白酶催化的肽片断结合或者蛋白用作反应物的情况。因此长度优选为上述的长度范围的倍数。氨基组分比羧基组分较大、大小相同或较小的情况也在本发明的保护范围之内，用于此目的的标准通常是形成氨基组分或羧基组分的氨基酸数。
优选羧基组分的大小为1-1000个氨基酸，优选30-500个氨基酸，更优选30-250个氨基酸。
在根据本发明的方法中，优选作为氨基组分使用N-末端未受保护的肽、肽模拟物和蛋白。
所述反应优选在纯离子性液体，例如4-甲基-N-丁基吡啶四氟硼酸盐(没有或仅具有非常少量的水含量(通常小于5％))中进行。
在本发明的另一个实施方案中，反应介质中离子性液体的比例为50-100vol％，优选70-100或80-100vol％，更优选90-100vol％，同样优选95-100vol％、95-99vol％或97-99vol％。
含有和不含有水和其它添加剂，例如无机盐的离子性液体和有机溶剂的混合物同样构成本发明范围内的反应介质，而它是溶液或悬浮液并不重要。所用的添加剂可以具体是无机盐、缓冲组分、还原和氧化剂、酶活化剂、调节剂和抑制剂、表面活性剂、脂质、用于共价或粘着固定蛋白的聚合物(例如聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇或羧甲基纤维素)和蛋白变性试剂如SDS(十二烷基硫酸钠)、脲或胍盐酸盐。
使用溶剂混合物的一个重要的优点可能是反应物或酶溶解度的增加或减小，或者可能通过除离子性液体之外所用的溶剂的数量、类型和比例来影响酶活性和特异性。
根据本发明，当还与离子性液体混合时，优选使用与水混溶的有机溶剂。另一方面，本发明还包括不与水混溶的疏水性有机溶剂(例如己烷或辛烷)，在这种情况下溶剂混合物作为二相体系出现。本发明还包括使用部分或全部与疏水性有机溶剂混合的具有疏水性烷基的改性的离子性液体。
根据本发明，优选使用阳离子为烷基咪唑离子、烷基铵离子、烷基吡啶离子和/或烷基磷离子的离子性液体，其中每种情况下的烷基化是完全的，即上述的杂原子都不与氢原子结合，因而是季化的。
同样优选离子性液体的烷基为支链或直链，并具有1-20个碳原子，优选1-20个碳原子，更优选4-6个碳原子。尤其优选至少-个烷基为甲基、乙基、丙基或丁基，特别是丁基。
根据本发明，可以优先使用的离子性液体的阴离子为氯化物、溴化物、氯铝酸盐、硝酸盐、苯磺酸盐、tritlate(三氟甲磺酸盐)、甲苯磺酸盐和/或四氟硼酸盐。
根据本发明，所用的离子性液体更优选1-乙基-3-甲基咪唑、I-丁基-3-甲基咪唑和/或4-甲基-N-丁基吡啶盐，其中特别优选四氟硼酸盐。
具有优选的酶特异性离去基团的羧基组分可以通过羧基组分的酰基与特定的离去基团(或适宜的前体)或在聚合载体上缩合来化学合成，例如通过使用氨磺酰基丁酰基氨基甲基安全擎子(safety-catch)树脂(参见R.Ingenito等人，J.Am.Chem.Soc.1999，121，11369)或肟树脂(参见V.Cerovsky，F.Bordusa，J.Peptide Res.2000，55，325；V.Ceroysky等人，ChemBioChem 2000，2，126)，同时产生酯或酰胺，并除去肽，所用的释放亲核试剂为含有适宜的醇、酚、巯基或氨基的离去基团，或者已经制备的Nα-未受保护的氨基酸酯或酰胺或适宜的前体。作为可替代的选择，羧基组分可以通过基因工程途径，例如通过使用内含肽介导的多肽酯合成来合成(M.W.Southworth等人，Biotechniques 1999，27，110)。可以通过选择内含肽裂解中的亲核试剂或者在通过在溶液中进行反应完成酯的产生来改变离去基团。
用作氨基组分的肽片断的合成可以常规地在溶液中或通过在聚合载体上使用常规的Fmoc或Boc合成方案完成。典型地，聚合载体上的合成优选通过更复杂的溶液合成完成，因为其在各中间产物的纯化方面存在优点。作为可替代的选择，氨基组分可以得自生物材料或由基因工程方法然后进行分离来表达。
可以通过常规的肽和蛋白化学方法分离和纯化所得的合成或标记产物。任何存在的保护基可以通过本技术中已知的方法除去。
在本发明的一个优选的实施方案中，由步骤a)-c)和任选的d)制备的一种化合物可以用作氨基组分，而由步骤a)-c)和任选的d)制备的另一种化合物可以用作羧基组分，以由确定的组分装配更大的多肽或蛋白，所述组分根据方法的不同还可以具有标记-或报道基团。
与其它潜在有用的生物催化方法不同的是，本发明使用离子性液体或其其混合物，同时联合使用酶，特别是蛋白酶和肽酶，从而实现高合成速率、灵活性、合成效率并简化操作。
参照附图和实施例说明本发明，根据这些附图和实施例本发明的其它特征、实施方案和优点是显而易见的。
附图的简要说明

图1表示通过应用根据本发明方法和实施例4所述的制备的生物素基化肽的选择的MALDI-ToF质谱。
具体实施例方式
实施例实施例1-离子性液体4-甲基-N-丁基吡啶四氟硼酸盐的比例对胰蛋白酶催化的二肽和三肽的合成的影响(Bz，苯甲酰基；OGp，4-胍基苯基酯)将表1特别指出的1ml包含4-甲基-N-丁基吡啶四氟硼酸盐和0.1M Hepes缓冲液pH8.0(包含0.1M NaCl和0.01M CaCl2、1.5％(v/v)4-甲基吗啉、2mM Bz-Phe-OGp、20mM氨基组分和10μM胰蛋白酶)的反应溶液于25℃下搅拌。30-120分钟后，用在甲醇/水(1∶1，v/v)中的1％三氟乙酸将反应溶液变成pH 2。二肽和三肽的产率通过HPLC分析来测定，并如下表1所列。
Bz-Phe-OGp采用类似于M.Thormann等人，Biochemistry1999，38，6056的合成方案来合成。所用的氨基组分是可商购的产物，并在表1中指出。胰蛋白酶购自Fluka(Switzerland)。
表1

实施例2-附加的有机溶剂的种类和含量对在离子性液体4-甲基-N-丁基吡啶四氟硼酸盐中进行的胰蛋白酶催化的起始于Bz-Phe-OGp和H-Leu-NH2的Bz-Phe-Leu-NH2的合成的影响(Bz，苯甲酰基；OGp，4-胍基苯基酯；MeOH，甲醇；DMSO，二甲亚砜；DMF，二甲基甲酰胺)。
将1ml包含4-甲基-N-丁基吡啶四氟硼酸盐、5％水和所指定比例的附加的有机溶剂、1.5％(v/v)4-甲基吗啉、2mM Bz-Phe-OGp、20 mM氨基组分和20、40、80、200μM胰蛋白酶(并增加附加的有机溶剂的比例)的反应溶液于25℃下搅拌。30-120分钟后，用在甲醇/水(1∶1，v/v)中的1％三氟乙酸将反应溶液变为pH2。产率通过HPLC分析来测定，并列于下表2。
表2

实施例3-在离子性液体4-甲基-N-丁基吡啶四氟硼酸盐中进行的胰岛素催化的起始于Bz-Phe-OGp和不同长度和序列的多肽的具有酶特异性裂解位点的多肽的合成。
各个酶特异性氨基酸残基分别用黑体字(Bz，苯甲酰基；OGp，4-胍基苯基酯)突出。
将1ml包含4-甲基-N-丁基吡啶四氟硼酸盐、5％水、1.50％.(v/v)4-甲基吗啉、2mM Bz-Phe-OGp、5mM氨基组分和10μM胰蛋白酶的反应溶液于25℃下搅拌。由于溶解度的原因，用甲醇作为附加的有机溶剂完成反应，并使用一定比例的20％和50％(v/v)甲醇。30-120分钟后，用在甲醇/水(1∶1，v/v)中的1％三氟乙酸盐将反应溶液变为pH2。在从反应溶液中分离之后通过MALDI-ToF鉴定的多肽产物如表3列出，具有特定的计算和实测的分子质量。
表3

*单一同位素质量的说明实施例4-在离子性液体4-甲基-N-丁基吡啶四氟硼酸盐中进行的起始于生物素基-OGp以及不同长度和序列的多肽的胰岛素催化的将生物素标记基团的N-末端引至具有酶特异性裂解位点的多肽各个酶特异性氨基酸残基分别用黑体字强调(Bz，苯甲酰基；OGp，4-胍基苯基酯)。
反应条件对应于实施例3的条件。唯一的改变是羧基组分(生物素基-OGp4mM)和氨基组分(各肽2mM)的浓度。在从反应溶液中分离之后通过MALDI-ToF鉴定的多肽产物如表4列出，具有特定的计算和实测的分子质量。酶促生物素基化反应的选择性通过使用N-末端酰基化肽类似物来研究。将在这些情况下产物形成的缺乏评价为证明排它性N-末端生物素基化。
表4

*单一同位素质量的说明所得的生物素基-RIVDARLEQVKAAGAY合成产物的MALDI-ToF质谱如图1例示。实测的摩尔质量1986.31对应于具有计算为1985.05的肽产物的单一同位素摩尔质量的(M+H+)信号。
实施例5-在离子性液体4-甲基-N-丁基吡啶四氟硼酸盐中进行的起始于鸡蛋白的糜蛋白酶催化的将生物素标记基团选择性引至溶菌酶糜蛋白酶具有较宽的底物特异性，其中虽然酶在芳香氨基酸残基之后优先裂解。溶菌酶中存在的各芳香氨基酸残基分别用黑体字强调(Hepes，N-[2-羟基乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸]；OGp，4-胍基苯基酯)。
来自鸡蛋白的溶菌酶的主要序列KVFGRCELAA AMKRHGLDNY RGYSLGNWVC QATNRNTDGSTDYGILQINS RWWCNDGRTP GSRNLCNIPC SALLSSDITASVNCAKKIVS DGNGMNAWVA QAWIRGCRL将1ml包含4-甲基-N-丁基吡啶四氟硼酸盐、20％Hepes缓冲液(0.05M，pH8.0)、2mM生物素基-OGp、0.5mM溶菌酶和10μM糜蛋白酶的反应溶液于25℃下搅拌。120分钟后，用在甲醇/水(1∶1v/v)中的1％三氟乙酸将反应溶液变为pH2。在产物分离之后通过MALDI-ToF实测的摩尔质量为14589.06的合成产物对应于理论计算的单一同位素摩尔质量的一生物素基溶菌酶的(M+H+)信号。
以上说明书、权利要求书和附图中公开的本发明的特征可以单独或以任何组合使用以在不同的实施方案中完成本发明。
权利要求
1.一种用于合成肽、肽模拟物和/或蛋白和/或用于选择性N-末端修饰肽、肽模拟物和/或蛋白的方法，包括以下步骤a)提供氨基组分，其中该氨基组分具有至少一个氨基酸，b)提供羧基组分，其中该羧基组分在羧基上具有一个离去基团，该羧基组分是具有至少一个氨基酸的化合物或具有至少一个标记或报道基团的化合物，c)使该氨基组分与该羧基组分在含有一种或多种离子性液体的反应介质中，在蛋白酶、肽酶和/或水解酶存在下反应，其中在氨基组分和羧基组分之间形成肽键，并消除离去基团。
2.如权利要求1所要求的方法，还包括以下步骤d)通过本身已知的方法富集和/或分离所得的肽、肽模拟物和/或蛋白。
3.如权利要求1或2所要求的方法，其特征在于所述氨基组分为多肽或蛋白。
4.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于氨基组分的大小为1-1000个氨基酸，优选30-500个氨基酸，更优选30-250个氨基酸。
5.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于氨基组分的羧基末端以受保护或未保护的非活化形式存在。
6.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于氨基组分的Nα-氨基官能团未受保护地存在，其中这种Nα-氨基官能团与羧基组分的羧基官能团反应。
7.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于羧基组分为多肽或蛋白。
8.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于羧基组分的大小为1-1000个氨基酸，优选30-500个氨基酸，更优选30-250个氨基酸。
9.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于羧基组分的羧基与离去基团形成羧酸酯或羧酰胺。
10.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于羧基组分的离去基团选自未取代或取代的-O-烷基-、-O-芳基-、-S-烷基-、-S-芳基基团、-NH-烷基-、-NH-芳基-、-N，N-二烷基-、-N，N-二芳基-和-N-芳基-N-烷基-基团。
11.如权利要求10所要求的方法，其特征在于羧基组分的离去基团被一个或多个羧酸基团、磺酸基团或磺酸酯取代。
12.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于离去基团为4-胍基苯基、4-脒基苯基、4-胍基苯硫基或4-脒基苯硫基，或者它们的结构同系物。
13.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于根据所用蛋白酶、肽酶和/或水解酶的特异性改变离去基团。
14.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于含有离去基团的羧基组分具有以下结构Y-(Xaa)n-R其中Y＝N-末端保护基或为H，Xaa＝任何α-氨基酸、β-氨基酸或其衍生物；或者为标记或报道基团，R为离去基团，特别是选自以下的离去基团未取代或取代的-O-烷基-、-O-芳基-、-S-烷基-、-S-芳基-基团，优选4-胍基苯基-、4-脒基苯基-、4-胍基苯硫基-、4-脒基苯硫基-基团，其中的每一个可以被磺酸基或磺酸酯取代，以及它们的结构同系物，n为1-1000，优选30-500，更优选30-250的整数。
15.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于羧基组分为选自以下的标记或报道基团含羧基的荧光标记物，例如荧光素、若丹明、四甲基若丹明、2-氨基苯甲酸；含羧基的同位素标记，例如含13C-、15N-和17O-的氨基酸或肽片断；含羧基的自旋标记物，例如含硝基氧化物标记的氨基酸和脂肪酸衍生物；生物素；含羧基的交联剂，例如重氮乙酸酯、重氮丙酮酸酯、对硝基苯基-3-重氮丙酮酸酯；2-(1，2-二硫代茂烷-3-基)乙酸酯；N，N′-1，2-亚苯基二马来酰亚胺；N，N′-1，4-亚苯基二马来酰亚胺。
16.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于步骤a)-c)和任选的d)进行两次或多次，以依次制备可以具有标记或报道基团的多肽或蛋白。
17.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于根据步骤a)-c)和任选的d)制备的一种化合物用作氨基组分，而根据步骤a)-c)和任选的d)制备的另一种化合物用作羧基组分。
18.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于反应介质仅含有一种或多种离子性液体。
19.如权利要求1-17之一或多项所要求的方法，其特征在于反应介质包含一种或多种离子性液体和水，和/或有机溶剂和任选的常规添加剂。
20.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于反应介质中离子性液体的比例为50-100vol％，优选70-100或80-100vol％，更优选90-100vol％，同样优选95-100vol％或95-99vol％。
21.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于所用的离子性液体的阳离子为季化烷基咪唑离子、季化烷基铵离子、季化烷基吡啶离子和/或季化烷基磷离子。
22.如权利要求21所要求的方法，其特征在于离子性液体的烷基为支链或直链，并具有1-20个碳原子，优选2-10个碳原子，更优选4-6个碳原子。
23.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于所用的离子性液体为1-乙基-3-甲基咪唑-、1-丁基-3-甲基咪唑-和/或4-甲基-N-丁基吡啶-盐。
24.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于所用的离子性液体的阴离子为氯化物、溴化物、氯铝酸盐、硝酸盐、苯磺酸盐、triflate(三氟甲磺酸盐)、甲苯磺酸盐和/或四氟硼酸盐。
25.如前述权利要求之一或多项所要求的方法，其特征在于所用的蛋白酶为半胱氨酸蛋白酶或丝氨酸蛋白酶。
26.离子性液体作为唯一的溶剂或与水和/或有机溶剂组合用于合成和/或N-末端修饰肽、肽模拟物和/或蛋白的应用。
27.蛋白酶、肽酶和/或水解酶用于合成和/或N-末端修饰肽、肽模拟物和蛋白的应用，其中该肽、肽模拟物和蛋白或其N-末端标记的种类是通过连接氨基组分和羧基组分来制备的，而该羧基组分含有离去基团。
全文摘要
本发明涉及一种用于合成肽、肽模拟物和/或蛋白和/或用于选择性N－末端修饰肽、肽模拟物和/或蛋白的方法。该方法包括以下步骤a)制备包含至少一个氨基酸的氨基组分，b)制备包含羧基上的一个离去基团的羧基组分，该羧基组分是包含至少一个氨基酸的化合物或包含至少一个标记基团或报道基团的化合物，和c)使氨基组分和羧基组分在包含至少一种或多种离子性液体的反应介质中，在蛋白酶、肽酶和/或水解酶存在下反应，其中在氨基组分和羧基组分之间形成肽键，并且分裂离去基团。
文档编号C07K1/00GK101027315SQ03820459
公开日2007年8月29日 申请日期2003年9月1日 优先权日2002年8月30日
发明者雷纳·鲁道夫, F·博尔杜萨, N·维霍夫斯基 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司