2′－支链核苷的制备方法

专利名称：2′－支链核苷的制备方法
技术领域：
本发明涉及具有保护的氧取代基的糖类似化合物的制备方法，特别是关于2，3，5-(独立任选保护的羟基)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖和2，3，5-(独立任选保护的羟基)-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯的制备方法。本发明还包括制备核苷的方法，特别是通过任选使用按照在此提出的方法制备的糖来制备3′，5′-(独立任选保护的羟基)-2′-C-甲基-β-D-胞苷的方法，特别的，是关于药物化合物前体的合成。更具体地，本发明描述了用作抗病毒核苷和核苷类似物衍生化合物给药的前药的合成，特别的，是2′-C-甲基-β-D-胞苷的′-O-缬氨酸酯的合成。
背景技术：
在用于核苷和维生素合成中的糖类似物的制备中，一种关键的中间体为2-C-甲基-D-核糖酸-内酯。早在1880，Scheibler就介绍了制备内酯的方法(JohnSowden，″The Saccharinic Acids″in Adv.Carbohydrate Chem.1243-46(1957)，引用C.Scheibler，Berichte 132212(1880))。然而，产物的产率却只有大约10％(Id.)。大约在同一时间，H.Kiliani利用氢氧化钙处理D-果糖，合成了2-甲基-D-核糖酸内酯(H.Kiliani，Berichte，152953(1882)，在F.J.Lopez-Herrera etal.，J Carbohydrate Chemistry，13(5)767-775(1994)中被引用)。然而，该方法需要数月的时间来完成，且产率仅有10％(Id.at 768)。但是，Kiliani的方法使他能够确定重要的官能基在化合物上的位置(John Sowden，″The Saccharinic Acids″in Adv.Carbohydrate Chem.1243-46(1957)，引用H.Kiliani，Ann.，213361(1883))。
在20世纪60年代早期，Whistler和BeMiller尝试过改进Kiliani的合成(RoyL.Whistler and J.N.BeMiller，″a-D-Glucosaccharino-1，4-lactone″in Methods inCarbohydrate Chemistry，2484-485(1963))。Whistler和BeMiller向D-果糖中加入沸水和氢氧化钙，向该体系中通入氮气，重复相同的过程。两周后；再将混合物放置6-8周，再用CO2和二水合草酸处理，压力下过滤。重复洗涤残渣，直至变为均匀的浆液状，合并滤液，减压下蒸馏溶剂，使所得产物冷却下结晶(Id.)。最终产率仍仅为约10％(Id.at 485)。
在提高产率的尝试中，Lopez-Aparicio等报道了由2，3-O-异亚丙基-D-甘油醛合成2-C-甲基-D-核糖酸-1，4-内酯来替代Kiliani合成(Lopez-Aparicio et al.，Carbohydrate Res.，12999(1984)，在F.J.Lopez-Herrera et al.，J.CarbohydrateChemistry，13(5)767-775(1994)第768-769页中被引用)。Lopez-Aparicio的方法包括使2，3-O-异亚丙基-D-甘油醛与(1-甲氧基-羰基-乙缩醛)三苯基正膦缩合，产生甲基E-(S)-4，5-二羟基-4，5-O-异亚丙基-2-甲基-2-戊烯酸酯；水和(在HCl中)并且将戊烯酸酯进行光化学异构化；对戊烯酸酯产物进行内酯化，产生丁烯酸内酯；通过与三苯甲基氯和吡啶的反应，在C-5对丁烯酸内酯进行三苯甲基化，然后用高锰酸钾和二氯甲烷在冠醚存在下进行顺式羟基化作用。通过与TFA(三氟乙酸)(Id.at 768)的反应，最终得以除去三苯甲基。据Lopez-Aparicio等报道，核糖酸内酯的产率约为80％，但是其他人根据在他们发表的实验部分中给出的材料的质量(克)，却不能得到上述数据。相反，经计算表明核糖酸内酯的百分产率约为36％。并且，Lopez-Aparicio等的方法比起Kiliani合成而言要复杂得多，需要使用如高锰酸钾这样的有毒试剂和专门的设备用于辐射以获得光化学异构化，且最少需要60小时的反应时间(Id.at 768，770-772)。
Walton等报道了由2-C-甲基-D-核糖酸-内酯合成2′-C-甲基腺苷(Walton etal.，J.Am.Chem.Soc.，88(19)4524-5(1966))。在这里，内酯被转换成其2，3，5-三-O-苯甲酰衍生物，然后用二(3-甲基-2-丁基)硼烷还原，得到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-呋喃核糖(Id.)的端基异构混合物。在酸洗氧化铝和硅胶上试图分离端基异构混合物时，导致重排为1，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-α-D-呋喃核糖(Id)。为了避免重排，需要增加用苯甲酰氯在吡啶中处理混合的端基异构体以获得1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-(α)/(β)-D-呋喃核糖的步骤，以及用色谱分离最终产物的步骤(Id.)。此后，Walton等报道了通过Hilbert-Johnson反应合成了2′-C-甲基-5-氟胞苷、2′-C-甲基-5-氟尿苷和2′-和3′-C-甲基胞苷(Walton et al.，AntiviralNucleosides 12306-309(1969))。然而，出乎意料的是，在由N-乙酰胞嘧啶-汞合成2′-C-甲基胞苷时，产生了大量的O-配醣，而汞本身是有毒试剂，希望避免使用(Id.)。在Walton等报道的两种合成方法中，最终产物的产率均只有约11％。
在1997年，Harry-O′Kuru等报道了制备′-C-支链核糖核苷的合成路线(Harry-O′Kuru et al.，J Org.Chem.，621754-9(1997))。可从商业上获得的1，3，5-三-O-苯甲酰-α-D-呋喃核糖被用作起始原料，其是由D-核糖或D-树胶醛醣(D-阿拉伯吡喃糖)制得。1，3，5-三-O-苯甲酰-α-D-呋喃核糖在自由的2-OH和Dess-Martin periodinane试剂作用下被氧化，产生1，3，5-三-O-苯甲酰-2-酮-呋喃核糖以及其相应的水合物。期望的产物以及水合物与过量的MgSO4搅拌，并放置过夜。然后过滤混合物并浓缩产生大量纯的酮类产物。用MeMgBr/TiCl4(或者也可用MeTiCl3、CH2＝CHMgBr/CeCl3、或TMSC＝CLi/CeCl3)处理得到的2-酮糖，以接近5∶3的期望产物和异构形式(Id.at 1755)的比例，产生期望的1，3，5-三-O-苯甲酰-2-取代的烷基、链烯基或炔基核糖呋喃糖苷(ribofuranoside)和其酯交换反应了的异构体的端基异构混合物，以及α-和β-2，3，5-三-O-苯甲酰-2-取代的烷基、链烯基或炔基核糖呋喃糖苷(Id.at 1755)。然后，通过苯甲酰氯、DMAP和三乙胺处理，以大约70％的产率和4∶1的β/α的比率(Id.)，将2-烷基化的核糖呋喃糖苷转化为单独的期望产物1，2，3，5-四苯甲酰-2-烷基核糖呋喃糖苷。
Beigelman等报道了由D-葡萄糖和D-核糖合成2′-C-甲基-核苷(Beigelman etal.，Carbohydrate Research，166219-232(1987))。使用D-葡萄糖作为起始原料时，制备了1，2，5，6-二-O-异亚丙基-3-C-甲基-α-D-allofuranose，通过5，6-O-二丁基stannylidene衍生物选择性地的插入p-甲基苯甲酰基而进行转化(Id.)。然后，用90％的三氟乙酸处理和进行高碘酸盐氧化作用，除去化合物上的甲酸基，进行乙酰化(Id.)。最终产率约为77％(Id.)。使用D-核糖作为起始原料时，使5-位保护的2，3-二甲基-异亚丙基衍生物与甲醛进行醇醛缩合，然后用过量的甲苯p-磺酰氯在吡啶中处理(Id.)。接着，按照文献中已知的条件，例如，Kuhn甲基化、用LiAlH4在THF中还原、酸催化水解，以及在吡啶中过量的Ac2O中沸腾进行乙酰化作用(Id.)，用该化合物形成各种产物。
Novak和Sorm详细报道了通过硼氢化钠还原，由2-C-甲基-D-核糖酸内酯制备结晶2-C-甲基-D-核糖及其衍生化合物(J.J.K.Novak&F.Sorm，CollectionCzechoslov.Chem.Commun.，34857-866(1969))。他们描述了在2-C-甲基-核糖呋喃糖苷的2-位的羟基的性质，特别是与位于相应的内酯的类似位置的羟基进行了比较(Id.)。虽然内酯上的羟基容易在本领域已知的条件下被乙酰化而产生2，3，5-三-O-乙酰基和2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸内酯，但在类似的条件下，由2-C-甲基-核糖呋喃糖苷只产生3，5-二-O-乙酰基-和3，5-二-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸内酯(Id.)。
此后，Novak描述了2-C-甲基-1，4-内酯的手性-光活特性，2-C-甲基-1，4-内酯是由D-lyxose和D-木糖通过次碘酸盐氧化制得，且在内酯的C3和C5上有p-甲苯酰保护基(J.J.K.Novak，Collection Czechoslov.Chem.Commun.，39869-882(1974))。特别是，由3，5-p-甲苯酰-2-Br，2-CH3-核糖酸-1，4-内酯，通过水解合成了2-CH3-核糖酸-1，4-内酯(Id.)。然而，Novak提到了在分离保护的内酯时有难度，并且在尝试通过碱的醇解来切断内酯时生成了浆状的产物(Id.at 871)。
Tokyo Tanabe Co.，Ltd.(JP 61-212592)和BASF Aktiendgesellschaft(EP 0 288847)都报道了由D-树胶醛醣，一种常用的生产核糖的起始原料来制备未保护的D-核糖的方法。
Tokyo Tanabe Co.，Ltd.，教导了含水D-树胶醛醣在有机溶剂中，优选在钼(VI)酸和硼酸化合物的存在下的差向异构，通过2-或3-价的阳离子交换材料(优选转变为Ca-型的多苯乙烯磺酸型强酸性离子交换树脂)收集和通过反应液，用水洗提分离未保护的核糖，以及收集核糖化合物(JP 61-212592，摘要)。
BASF教导了D-树胶醛醣的水/醇溶液在有负载了钼(VI)化合物的碱性离子交换器的存在下，在溶剂中加热的连续工艺。洗出液被收集和干燥，向干燥的洗出液中加入甲醇或乙醇，将混合物冷却至约0℃，使未保护的D-树胶醛醣结晶，然后再对其分离和回收。根据本领域公知道方法，通过强酸性离子交换器以Ca2+的形式浓缩和纯化剩余的滤出液，而在结晶阶段，任何与产物脱离的树胶醛醣/核糖都循环到树胶醛醣中(EP 0288847)。
Tokyo Tanabe Co.，Ltd.和BASF的方法均要求复杂和昂贵的设备和试剂，且得到的产物化合物仍需要添加保护基。
日本Tobacco，Inc.，通过保护位于γ-核糖酸内酯上的5-OH，制得了3-DPA-内酯，其中，用到了盐酸或酸酐以及叔胺使得3-OH发生β-消除，在碳2和3之间形成双键，同时使2-OH发生乙酰化，最终对C-2和C-3之间的双键进行催化加氢，并除去保护基，生成5-OH。参见EP O 526,655A1，EP O 553,358 A1和EP O 553,358B1，以及它们的美国同族专利U.S.5,322,955和U.S.5,391,769。
关于合成带有保护的取代基的核糖酸内酯以及糖类似物合成的其他相关工作还包括以下Li et al.，Organic Letters，3(7)1025-28(2001)由1，3，5-三-O-苯甲酰-α-D-呋喃核糖合成了′-C-β-三氟甲基嘧啶核苷，然后将其转化成3，5-二-O-苯甲酰-2-C-β-三氟甲基-α-D-1-呋喃核糖溴化物。该溴化衍生化合物被发现是在形成核苷时的有效反应中间体。
Beigelman et al.，Bioorg Khim.，12(10)1359-65(1986)，通过1，2，5，6-二-O-异亚丙基-3-C-甲基-α-D-allofuranose的苄基化合成了2-C-甲基-D-核糖衍生化合物，形成第一中间体；水解并选择性乙酰化该第一中间体，形成3-O-卞基-1，2-O-异亚丙基-3-C-甲基-6-O-甲苯酰-c-D-allofuranose；继续脱除异亚丙基，氧化(用高碘酸)，脱甲酰化，乙酰化，脱卞基化，再次乙酰化，从而得到最终产品1，2，3-三-O-乙酰-2-C-甲基-5-O-甲苯酰-β-D-核糖呋喃糖。
Feast et al.，Acta Chemica Scandinavica 191127-34(1965)，报道了α-D-葡糖酸的制备，其为2-C-甲基-D-核糖-戊酸，是通过1，4-内酯中间体，经碱处理D-果糖或1-O-取代的D-果糖得到的。
Kohn et al.，J.Am.Chem.Soc.，87(23)5475-80(1965)描述了获得醛醣的呋喃糖衍生物的简短的路径，其是采用disiamyl硼烷作为还原剂，将四环己氧基-γ-内酯还原成其相应的四酰基己糖呋喃糖。该反应对于在合成C-1′呋喃基核苷中的中间体的形成尤为重要。
Kempe et al.，Nucleic Acids Res.，10(21)6695-6714(1982)报道了在保护的核糖核苷的顺2′，3′-二醇的选择性的2′-苯甲酰化，以及将2′-苯甲酸酯异构化为3′-苯甲酸酯。这些保护的核苷被用于在固体硅胶支撑物上合成低聚核糖核苷，然后进行脱保护，这样的好处是内部核苷分解最少。
Schmidt等的美国专利U.S.4,294,766详细介绍了由核糖酸内酯和阿拉伯酸内酯的混合物合成纯的核糖酸内酯。核糖酸内酯是在形成核黄素(riboflavin(维生素B2))时的中间体。阿拉伯酸钾和核糖酸钾的混合物被“内酯化”，得到的约70％为核糖酸内酯的内酯混合物用二噁烷或乙二醇单甲醚通过分级结晶进行分离。采用已知道方法进行内酯化，例如，通过使用离子交换器，或在H2SO4或K2SO4下浓缩内酯，并过滤掉沉淀物。
核苷偶联Walton描述了支链核苷的合成，其是通过使2，3，5-三-O-酰基-2-(或3)-C-烷基核糖呋喃糖卤化物和氯汞嘌呤或嘧啶化合物反应而制备(U.S.3,480,613)。3-低级烷基-D-核糖呋喃糖卤化物中间体是以1，2-O-异亚丙基-5-O-酰基-α-D-赤-戊呋喃-3-酮糖作为起始原料，通过使该化合物与格氏试剂反应而在C3引入低级烷基而得到。然后，按两条途径进行在第一条途径中，5-O-酰基-1，2-O-异亚丙基-3-低级烷基-D-核糖呋喃糖被进行酸性醇解，形成烷基5-O-酰基-3-低级烷基D-核糖呋喃糖苷；其又被酰化为烷基2，3，5-三-O-酰基-3-低级烷基-D-核糖呋喃糖苷；所得到核糖呋喃糖苷然后通过进行碱性溶剂分解以及进一步在强酸溶液介质中水解，而被转化为自由糖，或者通过在合适当溶剂中进行卤素取代反应而转变为卤代糖。在第二条途径中，5-O-酰基-1，2-O-异亚丙基-3-低级烷基-D-核糖呋喃糖在碱性条件(吡啶)下的惰性溶剂中被酰化，形成3，5-二-O-酰基-1，2-O-异亚丙基-3-低级烷基-D-核糖呋喃糖，其再在强酸中被水解，进而酰化得到目标中间体。然后，通过使2，3，5-三-O-酰基-D-核糖呋喃糖卤化物和氯汞2，6-二取代嘌呤在100℃到140℃的甲苯或二甲苯等溶剂中反应，制备在糖部分的2位或3位具有支链的2-取代、6-取代或2，6-二取代的嘌呤核苷。通过与2，4-二烷氧基-嘧啶反应形成1-(2，3，5-三-O-酰基-2(或3)-C-低级烷基-D-核糖呋喃糖)-4-烷氧基-2(1H)-嘧啶酮，由2，3，5-三-O-酰基-2(或3)-C-低级烷基-D-核糖呋喃糖卤化物衍生得到了具有期望嘧啶酮碱基的核苷，其再与氨或伯胺或仲胺反应得到在嘧啶酮的C-4有氨基取代的化合物，或者在酸性或碱性条件下水解，得到在C-4具有羟基的嘧啶酮碱。然而，Walton的合成包含多个步骤、特殊的条件以及多种有毒试剂。
如图5所示，现有技术教导了在乙腈中使用BSA，使1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)和N4-苯甲酰胞嘧啶偶联。反应混合物被加热回流约30分钟，然后加入路易斯酸SnCl4，溶液再次加热并回流约3.5小时，得到4-NH-苯甲酰-2′，3′，5′-三-O-苯甲酰-β-D-2′-C-甲基-胞苷(5a)。通过用乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤并进行充分色谱纯化而得到化合物(5a)。用氨预饱的甲醇溶液对(5a)进行过夜处理以除去苯甲酰保护基，得到β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)。
前药药学上的活性化合物有时以酯化的前药形式给药。其中以羧酸酯最为常用，而膦酸酯和磷酸酯由于不能够在体内水解而可能产生有毒副产物，因而较少使用。(参见Erion等的美国专利U.S.6,312,662)。酰氧基烷基酯有时被用作膦酸酯和磷酸酯化合物，如环状膦酸酯和芳香酯特别是苯基和卞基酯的前药(Farquhar et al.，J.Pharm.Sci.，(1983)，72(3)324；Erion等的美国专利U.S.6,312,662)。如同核苷一样，膦酸例如膦甲酸和PMEA(Adefovir；9-(2-膦酰甲氧基-乙基)腺嘌呤)与核苷的羧酸或醚脂质前药一样，均显示出抗病毒活性(Gosselin等的美国专利U.S.6,458,773)。
长久以来，典型的前药的合成和设计均包括核苷或核苷类似物的5′位。上述Gosselin等报道的核苷中，5′-OH的H被以下任何一种基团取代酰基，包括其中的酯基的非羰基部分选自直链、支链或环状的C1-C20烷基，苯基或卞基；天然和非天然的氨基酸；5′-醚脂质或5′-磷酸醚脂质；烷氧基烷基，包括甲氧基甲基；芳烷基，包括卞基；芳氧基烷基，如，苯氧基甲基；芳基，包括苯基，任选以卤素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代；二羧酸，如琥珀酸；磺酸酯，如，磺酸烷基酯或磺酸芳烷基酯，包括磺酸甲酯；或单-、二-或三磷酸酯。
Matulic-Adamic等(U.S.6,248,878)报道了核苷类似物的合成。该类似物包含呋喃核糖环，其上在3′位通过氧原子和取代的嘧啶碱连有含磷基团。含磷基团包括dithioates或亚磷酰胺，或者可以是低聚核苷的部分。这些前药化合物进一步反应而提供最终期望的核苷和核苷类似物。这些化合物通过多步合成，包括偶联作为起始原料的在C-1具有羟基或乙酸基，在C-2-、C-3和C-5具有苯甲酰保护基的呋喃核糖和4-OSiMe3嘧啶，产生1-(2，3，5-三-O-苯甲酰-核糖-呋喃糖)-嘧啶-4-酮；然后，向第一反应的产物中加入含有氨的甲醇，以除去苯甲酰保护基；然后，DMT-Cl/Pyr与未保护的化合物反应，在呋喃核糖的5′-O位加成DMT；接着，用TBDMS-Cl、AgNO3和Pyr/THF与5′-O-DMT取代的呋喃核糖反应；最后进行标准的亚磷酸化(phosphitylation)，在3′-O产生含磷基团。各合成包括至少4～7步。
Chu等描述的前药是叠氮化物衍生物和组合物，包括核苷以及磷酸化的核苷类似物(U.S.6,271,212)。这种叠氮化物前药的优点是能够通过血-脑屏障，提供更长的半衰期和更高的生物利用度，以及增加药物活性形式的稳定性。然而，Chu等报道了为制备他们的叠氮化物前药需要长期和多步的合成。
Borretzen等描述的抗病毒前药是核苷及核苷类似物。他们报道了抗病毒核苷及核苷类似物的某些脂肪酸酯，其中某些一元不饱和C18或C20脂肪酸通过酰化过程而连接在核苷及核苷类似物的5′-位(U.S.6,153,594)。该过程在催化剂存在下进行24-60小时。经有机溶剂萃取完成产物分离，通过选择适当溶剂进行色谱和/或重结晶进行纯化。产物的百分产率在15-82％之间变化。但是，Borretzen等没有使用术语“前药”。
1999年，McCormick等描述了使用未保护的核糖作为起始原料，在鸟苷的3′-OH形成碳酸酯。(McCormick et al.，J Am.Chem.Soc.1999，121(24)5661-5)。McCormick通过连续、逐步地引入O-和N-配醣联接、利用某些保护基、磺化以及最后脱保护，完成了合成。作为他们的方法中的步骤之一，McCormick等使未保护的鸟苷与BOC-酐、DMAP、Et3N和DMSO在室温下反应4小时，直接获得鸟苷的3′-OH的碳酸酯。
同样在1999年，Tang等公开了制备′-C-β-甲基-胞苷核糖核苷的亚磷酰胺前药的方法。(Tang et al.，J.Org.Chem.，1999，64747-754)。与他们的许多同行一样，Tang等将1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D呋喃核糖与经全硅烷化去活的4-N-苯甲酰胞嘧啶在路易斯酸和SnCl4的存在下反应，以其作为合成中的第一个步骤。(Id.at 748，SchemeIa)。
2000年，Novirio Pharmaceuticals(现在为Idenix)发现了通过施用抗病毒核苷的氨基酸酯形式，抗病毒核苷的稳定性及生物利用度得以提高(U.S.序列号No.09/864,078，审查中；U.S.序列号No.10/261,327，审查中；WO01/90121；及U.S.临时申请60/377,983和60/392,351)。制备这些核苷和核苷类似物的氨基酸酯的方法首先是以适当的可被适当的保护基如甲硅烷基选择性保护的支链β-D或β-L核苷开始，然后，采用公知的方法进行脱保护(Zhang et al.，Tetrahedron Letters，1992，331177-80；Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley&Sons，2ndEdition(1991)；Kerr et al.，J.Pharmaceutical Sciences，1994，83582-6；Tang et al.，J.Org.Chem.，1999，64(3)747-754；及Cavelier et al.，TetrahedronLetters，1996，375131-4)。然后，被选择性保护的支链核苷与合适的酰基供体，如酰氯和/或酰酐或活性酸偶联，偶联在合适的质子溶剂或非质子溶剂中在合适的反应温度下进行，得到1′，2′，3′或4′支链β-D或β-L核苷的2′或3′前药，任选在适当的偶联剂存在下进行(参见Synthetic Communications，1978，8(5)327-33；J.Am.Chem.Soc.，1999，121(24)5661-5；Bryant et al.，Antimicrob.Agents Chemother.，2001，45，229-235；Standring et al.，Antiviral Chem.&Chemother.，2001，12(Suppl.1)，119-129；Benzaria et al.，Antiviral Res.，2001，50，A79；Pierra et al.，Antiviral Res.，2001，50，A79；以及Cretton-Scott et al.，Antiviral Res.，2001，50，A44)。可用的偶联试剂是那些能够将化合物和其中一部分连接到其他部分之上的物质，包括但不限于各种碳二酰亚胺，CDI，BOP和羰基二酰亚胺。例如，对于2′-支链核苷的3′-前药，核苷优选被保护，但是通过碳二酰亚胺偶联剂，直接偶联到烷醇酸或氨基酸残基上。
图5中所示的现有技术的方法包括按以下顺序反应来制备胞苷的3′-缬氨酸酯核苷前药将1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)加入到乙腈中的BSA和N4-苯甲酰胞嘧啶的混合物中，加热至回流约30分钟，然后，向溶液中加入路易斯酸SnCl4，溶液再次加热至回流约3.5小时，产生4-NH-苯甲酰-2′，3′，5′-三-O-苯甲酰-β-D-2′-C-甲基-胞苷(5a)。化合物(5a)通过用乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤并进行充分色谱纯化而得到。用氨预饱和的甲醇溶液对(5a)进行过夜处理以除去苯甲酰保护基，得到β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)。化合物(6)的DMF溶液与N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛在室温下反应约1.5小时，得到在C4有保护的氨基的胞苷N4-[(二甲基氨基)亚甲基]-β-D-2′-C-甲基-胞苷(7)；然后，氨基酸-保护的胞苷(7)的干吡啶溶液与咪唑和TBDPSCl在室温下反应约6小时，得到5′-O甲硅烷基保护的胞苷(8)；然后，在DEC、DMAP以及THF/DMF的存在下，将N-Boc-L-缬氨酸在室温下加入到4-和5′-保护的β-D-2′-C-甲基胞苷(8)，约两天后，得到4-和5′-保护的β-D-2′-C-甲基-胞苷3′-O-L-N-BOC-缬氨酸酯(9)；在4-和5′-保护的β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-O-L-N-BOC-缬氨酸酯(9)的干甲醇溶液中加入氟化胺，然后混合物回流以除去5′-甲硅烷基和4-氨基保护基，生成β-D-2′-C-甲基胞苷的3′-O-L-N-(叔-丁氧基羰基)缬氨酸酯(10)，其通过色谱柱提纯；最后，向β-D-2′-C-甲基胞苷的3′-O-L-N-(叔-丁氧基羰基)缬氨酸酯(10)的干乙酸乙酯溶液中，加入20％的HCl/乙酸乙酯溶液，将混合物搅拌约2小时，除去BOC-保护基，生成最终产物β-D-2′-C-甲基胞苷的′-O-缬氨酸酯的盐酸盐(11)。图6中表示的现有技术的合成使用了尿嘧啶代替苯甲酰胞嘧啶来制备化合物(11)β-D-2′-C-甲基胞苷。
综上所述，若能够有一种有效的方法制备核苷或核苷类似物将会是有利的。这样的核苷或核苷类似物例如是2′-甲基-核苷或2′-甲基-3′-O-缬氨酸-核苷，它们的中间体，包括2-C-甲基-核糖酸内酯和2-C-甲基-D-呋喃核糖，以及它们的盐和/或前药。
本发明的另一目的是提供在核苷的3′-OH选择性加成的方法，以衍生出前药化合物。
本发明的再一目的是提供一种有效的制备保护的糖类似化合物的方法，该方法包含最少数目的步骤，并使用廉价的起始原料。
本发明的又一目的是与合成类似产物相比，大幅减少制备保护的糖中间体的时间。
另外，本发明的目的之一是提供一种方法，其在数小时内即能完成，并且以高产率和高纯度提供最终产物。
本发明的另一目的是提供一种方法，该方法采用了易于使用的无毒的试剂，且其最终产品易于通过常规技术被分离，且容易扩大规模。
本发明的又一目的是以超过至少90或95％的高产率和高纯度获得最终产物。
本发明的再一目的是使用无毒、易于操作的试剂。

发明内容
本发明公开了一种新的改改进的用于制备核苷及核苷类似物，如β-D和β-L2′-C-甲基-核苷及2′-C-甲基-3′-O-酯核苷以及它们的盐和/或前药的方法，该方法通过在更短的时间内使用一种或多种用量更少的试剂，通过更为简单的纯化步骤，得到比现有技术更高的产率。此外，本发明的方法在满足工业生产的要求上非常有利。
本发明的具体实施方式
中，特别包括含有以下步骤的方法(a)将D-果糖与CaO反应，获得2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯；和/或(b)使任选保护的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯与合适的还原剂如Red-Al，任选在溶剂如乙醇中反应，获得任选保护的2-C-甲基-D-呋喃核糖；和/或(c)将任选保护的2-C-甲基-D-呋喃核糖与未保护的碱基进行偶联，偶联如是与胞嘧啶在活化剂如甲硅烷化试剂(例如BSA)存在下，任选在路易斯酸如SnCl4存在下进行的，得到任选保护的2′-C-甲基-核苷，例如，2′-C-甲基-胞苷；和/或(d)在优化的试剂、反应条件(溶剂、反应时间等)和提取/纯化技术下，得到2′-C-甲基-核苷，例如2′-C-甲基-胞苷的3′-酯。在本发明的一个具体的实施方式中，反应过程示于图1和4中。
还提供一种有效的可扩大规模的、以高产率制备核苷前药的方法，这种核苷在核苷的3′-位有可裂开的部分。
进一步提供节约成本的采用无毒试剂来制备核苷、核苷类似物、其盐及前药的方法。比较示于图4的本发明的方法和示于图5的现有技术的方法，可以看出，在改进的方法中经济效益有所增加。比较示于图4中的本发明的方法，以及示于图5中的现有技术的方法，可以证明在改进的方法中提高了过程的经济性。
另外，再提供一种有效的、可扩大规模的制备2-C-甲基糖中间体，如独立的2，3，5-(独立任选保护的)和未保护的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯(也称作2-C-甲基-核糖酸内酯)和独立的1，2，3，5-(独立任选保护的)和未保护的2-C-甲基-D-呋喃核糖的合成方法。比起现有技术的方法而言，该方法采用了一种或多种便宜的试剂，所需时间更短，纯化方法更为简便，产率更高。
本发明与众不同的一方面在于使用了特定组合的试剂，从而省去了合成步骤中的分离、离析和/或纯化。特定试剂的选择使得绝大多数的起始原料被转化为产物，并降低了外消旋化作用，能够容易地从最终产物中除去，从而提供了比以往的方法更为有效的合成方法。总的结果是得到最终前药产品的时间缩短，并且期望产品的百分产率提高。
此外，需要更少的时间以及更少的试剂提高了整体成本效率和工业上可扩大规模和安全的方法。
在一个实施方式中，本发明的方法是一种核苷的制备，其在2′-C上发生双取代，如2′-甲基-核苷或2′-甲基-3′-O-缬氨酸-核苷，其中间体，例如2，3，5-(独立任选保护的)和未保护的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯(也称作2-C-甲基-核糖酸内酯)以及1，2，3，5-(独立任选保护的)和未保护的2-C-甲基-D-呋喃核糖，和其盐和/或前药。在一个优选的实施方式中，本发明被用于制备2，3，5-(独立任选保护的)或未保护的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯。在另一优选的实施方式中，本发明被用于制备1，2，3，5-(独立任选保护的)或未保护的2-C-甲基-D-呋喃核糖。在又一优选的实施方式中，本发明被用于制备β-D-2′-C-甲基-胞苷(4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-C-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮)。在另一优选的实施方式中，本发明被用于制备β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-4-C-甲基-2-羟甲基-四氢呋喃-3-基酯)的3′-O-氨基酸酯(包括但不限于缬氨酰酯)或其优选的盐酸盐形式。由本发明制备的核苷、核苷类似物、盐或酯前药可用作制备各种其他核苷类似物的中间体，或者直接用作抗病毒和/或抗肿瘤试剂。
在一个实施方式中，本发明的改进的方法包括使胞嘧啶与活化剂，如BSA，任选在路易斯酸如SnCl4存在下，以及1，2，3，5-(独立任选保护的)或未保护的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖反应，生成4-氨基-1-(3，4-(独立任选保护的-羟基)-5-O-保护-羟基亚甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(见图4) 其中，各P1、P2、P3和P4独立地为氢或适当的氧保护基，例如，酰基，优选为苯甲酰基；然后，如果需要，则选择性地将前步反应中的4-氨基-1-(3，4-(独立任选保护的-羟基)-5-(任选O-保护-羟基亚甲基)-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮脱去保护，形成4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(6)。
例如，如果中间体(V)的P1、P2和P3是苯甲酰基，则该化合物可以与NaOMe/MeOH反应，得到4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(VI)，其也被称为β-D-2′-C-甲基-胞苷，可任选从乙醇等中重结晶，获得β-D-2′-C-甲基-胞苷的纯化形式。该化合物可根据需要用作抗病毒制剂，或者进一步进行衍生成为前药。
然后，中间体(VI)可选择地被任选保护，如在3′-位被酯化，使用已知的方法进行任选脱保护，获得β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-酯前药，例如，β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-4-C-甲基-2-羟甲基-四氢呋喃-3-基酯)的3′-O-缬氨酸酯，或者其优选的盐酸盐形式。
作为本发明的一个非限制性的实例，如果3′-缬氨酸酯是优选的，则酯化反应可包括图4中所表示出的步骤，即，使β-D-2′-C-甲基-胞苷与Me2NCH(OMe)2在DMF中反应，形成(7)，N[1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲酰胺，其是(VI)的氨基-保护的形式；使(7)与TBDPSCl和咪唑在DCM中反应，生成(7)的5′-甲硅烷基-保护的形式，N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅氧基甲基)-3，4-二羟基-3-甲基-四氢呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基甲酰胺(8)；使(8)与N-Boc-L-缬氨酸、EDC、和DMAP在DCM中反应，形成2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亚甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羟基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯(9)；使(9)与NH4F在MeOH中反应，并加入乙酸乙酯(为防止析出的氨切断3′-O-缬氨酸酯)，以除去甲硅烷基和氨基保护基，并回流混合物，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯(10)，其通过简单的结晶而纯化；最后，使(10)与HCl在EtOH中反应，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯，二盐酸盐(11)作为最终产品。
使用胞嘧啶代替现有技术中使用的苯甲酰胞嘧啶或其他保护的胞嘧啶，改善了经济性并简化了纯化过程。
本发明的方法与类似的现有技术相比的优势在于，其使用的试剂可减少到约50％。即便是使用更少的试剂，与最接近的现有技术相比较，本发明的方法的总产率却得到提高，比如在一例中，产率由12％提高到38％。进一步的优势体现在减短了完成前药合成的周期。与现有技术的合成相比较，本发明的改善的方法将周期简短了约80％。这主要是出于以下四个原因i)随着负荷的增加，减少了所需反应的批次；ii)百分产率的提高；iii)使用易于处理的溶剂和试剂；以及iv)避免了耗费工时的色谱纯化步骤。
本发明与众不同的一个方面在于使用了特定组合的试剂，从而省去了合成步骤中的分离、离析和/或纯化。特定试剂的选择使得绝大多数的起始原料被转化为产物，并降低了外消旋化作用，能够容易地从最终产物中除去，从而提供了比以往的方法更为有效的合成方法。总的结果是得到最终前药产品的时间缩短，并且期望产品的百分产率提高。此外，需要更少的时间以及更少的试剂提高了整体成本效率和工业上可升级的和安全的方法。
在本发明的另一实施方式中，通过使2，3，5-(独立任选保护的)-2-C-甲基-D-核糖酸内酯与还原剂如二(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠(Red-Al)，任选在溶剂如乙醇中反应，得到了1，2，3，5-(独立任选保护的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
其中，各P1、P2和P3独立地为氢或适当的氧保护基，例如，酰基，优选为苯甲酰基；然后，如果需要，则选择性地保护(例如苯甲酰化)前步反应中的呋喃核糖衍生化合物，形成1，2，3，5-(独立任选保护的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4独立地为氢或适当的氧保护基，例如，酰基，优选为苯甲酰基。
使用Red-Al作为本发明的还原剂，出乎意料地提供了具有特定立体化学的产物，这就实现了有效分离。从而简化了最终期望产品的分离。
在本发明的又一实施方式中，2，3，5-(独立任选保护的)-2-C-甲基-D-核糖酸内酯通过使D-果糖与CaO反应得到；
然后，如需要，则任选保护内酯，例如，用苯甲酰氯(或其他合适当酰氯)，形成2，3，5-(独立任选保护的)-2-C-甲基-D-核糖酸内酯； 其中，各P1、P2和P3独立地为氢或适当的氧保护基，例如，酰基，优选为苯甲酰基。
另外，为了分离纯的单一的端基异构产物(例如，实质纯的形式指的是至少95％)，可根据需要增加纯化步骤。
本发明的方法采用了廉价的D-果糖作为起始原料，因此为生产者节省了大量的成本。这一点对于需要和预计扩大工业应用时尤其重要。
除了使用D-果糖作为起始原料带来的重大的经济效益外，本发明与众不同的一方面还在于使用氧化钙(CaO)作为方法的第一步中的试剂。CaO被加入到D-果糖的水溶液中，制备2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯。这一步本身很快就完成，比起现有技术中的类似步骤提高了产率30-40％。此外，CaO无毒，易于使用，并与果糖和水混合良好。
可利用沉淀剂来从溶液中除去钙。在一个实施方式中，向反应混合物中加入CO2和比核糖酸强的酸，在一个优选的实施方式中，加入的是有机酸，形成碳酸钙。适合的有机酸包括但不限于草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸、马来酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、丁酸、戊酸己酸或己酸。
此外，图1和图4结合起来的总过程的优势在于，与现有技术方法相比，其使用的试剂可减少到约50％。即便是使用更少的试剂，与最接近的现有技术相比较，本发明的方法的总产率却得到提高，比如在一例中，产率由12％提高到38％。进一步的优势体现在缩短了完成前药合成的周期。与现有技术的合成相比较，本发明的改善的方法将周期简短了约80％。这主要是出于以下四个原因i)随着负荷的增加，减少了所需反应的批次；ii)百分产率的提高；iii)使用易于处理的溶剂和试剂；以及iv)避免了耗费工时的色谱纯化步骤。
因此，在本发明的一个实施方式中，提供了由D-果糖制备2′-C-甲基-D-胞苷的方法，其包括以下步骤(a)使D-果糖CaO反应，得到2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯； (b)如需要，则任选保护内酯，例如，用苯甲酰氯(或其他合适当酰氯)，形成2，3，5-(独立任选保护的)-2-C-甲基-D-核糖酸内酯； 其中，各P1、P2和P3独立地为氢或适当的氧保护基，例如，酰基，优选为苯甲酰基；(c)使2，3，5-(独立任选保护的)-2-C-甲基-D-核糖酸内酯与还原剂如二(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠(Red-Al)，任选在溶剂如乙醇中反应；
其中，各P1、P2和P3独立地为氢或适当的氧保护基，例如，酰基，优选为苯甲酰基；(d)如果需要，则选择性地保护(例如苯甲酰化)前步反应中的呋喃核糖衍生化合物，形成1，2，3，5-(独立任选保护的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4独立地为氢或适当的氧保护基，例如，酰基，优选为苯甲酰基，(e)使1，2，3，5-(独立任选保护的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖与胞嘧啶和活化剂，如BSA，任选在路易斯酸如SnCl4存在下反应，生成4-氨基-1-(3，4-(独立任选保护的-羟基)-5-O-保护-羟基-亚甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮 其中，各P1、P2、P3和P4独立地为氢或适当的氧保护基，例如，酰基，优选为苯甲酰基；然后，(f)如果需要，则选择性地将前步反应中的4-氨基-1-(3，4-(独立任选保护的-羟基)-5-O-保护-羟基亚甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮脱去保护，形成4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(VI)，
(g)如果需要，任选保护/脱保护，然后对4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(VI)的3′-位用L-缬氨酸等进行酯化，得到β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-4-C-甲基-2-羟甲基-四氢呋喃-3-基酯)的3′-O-缬氨酸酯，任选以盐的形式存在。


图1是制备1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖和2，3，5-三-O-保护-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯的优选方法的示意图。
图2是制备2-C-甲基-β-D-核糖酸内酯的选择性方法的示意图。
图3是制备1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖的供选方法的示意图。
图4是本发明的优选的制备核苷、核苷类似物或其盐或前药的方法的示意图。
图5是制备β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-O-缬氨酸酯的药学上可接受到的盐的供选方法。
图6示出了现有技术中已知道制备β-D-2′-C-甲基-胞苷的供选路径。
具体实施例方式
提供了一种制备核苷和核苷类似物，如2′-C-甲基-核苷和2′-C-甲基-3′-O-缬氨酸核苷以及它们的盐和/或前药的方法，产物包括了所有的立体化学和互变异构的形式。与现有技术相比，该方法使用更少的试剂，在更短时间内获得了更高的产率。并且，省去了耗时耗力的色谱纯化步骤，并将不期望的外消旋化抑制到可接受到水平。该改良的方法包括形成期望的核苷作为前药合成中的中间体，并且有望扩大规模为符合工业生产的要求。
另外，还提供了一种有效的可扩大规模制备2-C-甲基糖中间体，如2，3，5-(独立任选保护的)和未保护的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯(也称作2-C-甲基-核糖酸内酯)和1，2，3，5-(独立任选保护的)和未保护的2-C-甲基-D-呋喃核糖的合成方法。比起现有技术的方法而言，该方法采用了便宜的试剂，所需时间更短，纯化方法更为简便，产率更高。
在一实施方式中，本发明的方法是一种核苷的制备，其在2′-C上发生双取代，如2′-甲基-核苷或2′-甲基-3′-O-缬氨酸-核苷，其中间体，例如2，3，5-(独立任选保护的)和未保护的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯(也称作2-C-甲基-核糖酸内酯)以及1，2，3，5-(独立任选保护的)和未保护的2-C-甲基-D-呋喃核糖，和其盐和/或前药。在一个优选的实施方式中，本发明被用于制备2，3，5-(独立任选保护的)或未保护的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯。在另一优选的实施方式中，本发明被用于制备1，2，3，5-(独立任选保护的)或未保护的2-C-甲基-D-呋喃核糖。在又一优选的实施方式中，本发明被用于制备β-D-2′-C-甲基-胞苷(4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-C-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮)。在另一优选的实施方式中，本发明被用于制备β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-4-C-甲基-2-羟甲基-四氢呋喃-3-基酯)的3′-O-缬氨酸酯或其优选的盐酸盐形式。由本发明制备的核苷、核苷类似物、盐或酯前药可用作制备各种其他核苷类似物的中间体，或者直接用作抗病毒和/或抗肿瘤试剂。
在第一实施方式中，本发明的方法使用D-果糖作为起始原料，以简短的合成路径制得了1，2，3，5-(独立任选保护的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
在第二实施方式中，本发明的方法是一种核苷、核苷类似物以及其盐或前药的制备，它们在2′-C上发生双取代。
在第三实施方式中，本发明的方法被用于制备β-D-2′-C-甲基-胞苷(4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-C-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮)。
在第四实施方式中，本发明的方法被用于制备β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-4-C-甲基-2-羟甲基-四氢呋喃-3-基酯)的3′-O-缬氨酸酯，或其优选的盐酸盐形式。
由本发明制备的核苷、核苷类似物、盐或酯前药可用作制备各种其他核苷类似物的中间体，或者直接用作抗病毒和/或抗肿瘤试剂。
本发明的方法与类似的现有技术相比的优势在于，其使用的试剂比现有技术的少50％。即便是这样，与最接近的现有技术相比较，本发明的方法的总产率却由12％提高到38％。进一步的优势体现在缩短了完成前药合成的周期。再一优势在于该新方法的安全性和易升级性，有望成为符合工业生产的要求的方法。
本发明与众不同的一个方面在于使用了特定组合的试剂，从而省去了合成步骤中中间体的分离、离析和/或纯化。特定试剂的选择使得绝大多数的起始原料被转化为产物，并降低了氨基酸前药部分的外消旋化作用，从而能够容易地从最终产物中除去，从而提供了比以往的方法更为有效的合成方法。总的结果是得到最终前药产品的时间缩短，并且期望产品的百分产率提高。此外，由于需要更少的时间以及更少的试剂，总的来说，从节约成本考虑是有利的。成本效率和工业上可升级的和安全的方法。
本发明改进方法的优势体现在图1中，使用D-果糖作为廉价的起始原料，以及使用CaO，其减少了反应时间并增加了内酯生产的百分产率；采用Red-Al/乙醇进行还原，提供了端基异构产物化合物的区域选择混合物，能够采用已知的方法容易地从该混合物中将最终产物1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖分离出；图4中，采用胞嘧啶作为起始原料，而不是采用现有技术中的苯甲酰-胞嘧啶(图5)或尿嘧啶(图6)作为起始原料，这样由于应用了更为简单及分子量更低的较廉价的化合物，提高了过程的“原子效益(atom economy)”；与现有方法中类似步骤相比，本发明中需要更少当量的胞嘧啶、SnCl4和BSA；由于反应物和试剂均少于以往的当量，带给反应双重的好处，即，反应用3到4小时即完成，且图4中的中间体(2)的纯度如此之高，而无需进一步的色谱分离和纯化步骤。
图1是本发明的一个实施方式的示意图。在该改进的方法中，由D-果糖形成核糖酸内酯(化合物1)的时间大约为40小时或少于两天，产品产率约为13.6％，其比最接近的现有技术的高30-40％。相比之，Kiliani和Scheibler的核糖酸内酯合成各需要两个月或更长时间完成，且产品产率大约为10％(Lopez-Herrera et al.，J Carbohydrate Chemistry 1994，13(5)767-775 at 768)。
出乎意料的是，氧化钙(CaO)和水能够与廉价的起始原料D-果糖反应，制备1，2，3，5-四-O-保护-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖，产率为比以前获得到高30-40％。该方法能够大量制备具有被保护的羟基的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖，其是在合成生物活性核苷以及某些维他命化合物中的重要的中间体。由此发现带来的又一好处是节约产品的制备成本，这在大规模工业化合成中是特别重要的。例如，1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖通常是由D-核糖，通过使用D-树胶醛醣作为起始原料制备的。从D-树胶醛醣的合成需要至少5步和色谱纯化。并且，每公斤D-树胶醛醣的成本是D-果糖的约250倍！通过使用本发明的改进的方法，只需要4步和廉价的试剂就可以制备出在1、2、3和5位有保护基的2-C-甲基-核糖。因此，无需进行色谱纯化即可以较低的成本有效地制得期望的产品。
同样令人吃惊的是，当使用CaO作为起始试剂时，显著减少了形成2-C-甲基-β-D-核糖酸内酯所需的时间。与Kiliani和Scheibler早期的使用Ca(OH)2作为反应试剂的工作相比，这就显著减少了合成所需的总的时间。
另外还发现，当用Red-Al(任选其乙醇溶液)作为还原剂，产生的2，3，5-三-O-苯甲酰-1-羟基-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖被酰化时，产生大量的单一端基异构产物，更容易实现有效分离。这就简化了对期望的最终产物的分离。
本发明的优势体现在如下方面选择D-果糖作为廉价的起始原料对于制备最终的保护的糖类似物而言在经济上具有优势；使用CaO提高了产物产率、降低了内酯产生的反应时间；用Red-Al还原提供了端基异构产物的区域选择混合物，最终产物能够容易地从其中通过通用方法得以分离。其他方面的优势包括，除使用廉价的起始试剂外，还使用了廉价的反应试剂、在整个过程中处理中间体所需的步骤最少、只需使用本领域公知的通常的方法和设备，而避免了复杂的步骤和昂贵的装置。
图4是本发明的另一个实施方式的示意图。该改进方法的优势体现在如下方面。采用胞嘧啶作为起始原料，而不是采用现有技术中的苯甲酰-胞嘧啶(图5)或尿嘧啶(图6)作为起始原料，这样由于应用了更为简单及分子量更低的较廉价的化合物，提高了过程的“原子效益”。此外，与现有方法中类似步骤相比，本发明中需要更少当量的胞嘧啶、SnCl4和BSA；由于反应物和试剂均少于以往的当量，带给反应双重的好处，即，反应用3到4小时即完成，且图4中的中间体(2)的纯度如此之高，而无需进一步的色谱分离和纯化步骤。
令人吃惊的发现是，在本发明的脱保护步骤中(图4，(5)→(6)，脱去苯甲酰保护基)，使用溶于MeOH的NaOMe带来了比现有方法中使用氨(图5，(5a)→(6))更为经济、安全、易用于工业升级的合成。另外的好处是出自更短的反应时间使用甲醇钠完成反应需要约1小时，而同样的反应，使用氨则需要1-2天。此外，在本发明中，通过简单的甲醇或乙醇(优选乙醇)处理，得到了高纯度的(6)，从而免去了在现有方法中甚为关键但耗时耗力的色谱纯化步骤(见图5，(5a)→(6))。
除了更为简单、成本更低、使用的反应物和试剂的安全性更高外，本发明方法的头两步的总的产品产率为85％，而图5所示的现有方法中的为24％。在产生(7)的敏感的甲脒-保护步骤(图4，(6)→(7))中，即使反应负荷(reaction loading)从现有技术的5％增加到本发明的13％，产物产率仍维持在约80+％左右。
在现有技术基础上的一个简单的改进对接下来的两步，甲硅烷-保护和BOC-酯偶联，产生了正面的影响，生成了如(8)和(9)。首先，在现有技术中作为反应溶剂的较贵且难除去的吡啶(图5，(7)→(8))被二氯甲烷代替(图4，(7)→(8))。在二氯甲烷中的甲硅烷化产生了更少的不期望的3′，5′-二甲硅烷基衍生物，因而能够更好地控制甲硅烷基副产物地形成，且从(7)转化为(8)的转化率超过99％。并且由于二氯甲烷也被用作与BOC-Val-OH偶联的溶剂，因此无需在(8)与BOC-Val-OH偶联获得(9)之前进行分离。在(8)与BOC-Val-OH偶联获得(9)之前，只需要简单的萃取进行收集即可(比较图4，(8)→(9)与现有技术图5中的相同步骤)。
进而，现有技术方法采用了N，N-二甲基甲酰胺和乙腈作为BOC-Val-OH偶联溶剂(图5，(8)→(9a))。这些试剂均很贵，使得反应的负荷率较低，仅约3％，并且，特别是N，N-二甲基甲酰胺沸点高，难从反应混合物中除去。此外，大致需要两天和过量的BOC-Val-OH、EDC和二甲基氨基吡啶(DMAP)来完成反应。一方面需要这些过量的试剂来完成反应，但另一方面它们的存在又使得后面的产物纯化变得复杂。此外，使用过量的DMAP诱发了L-缬氨酸衍生物的氨基酸部分的外消旋化。
与现有技术的方法不同的是，在本发明中使用二氯甲烷作为偶联反应的溶剂(图4，(8)→(9)使得负荷率约为11％，而仅用了现有技术中约一半量的试剂，且反应在约4-6小时即完成。反应时间上的减少和用于本发明的控制用量的DMAP将L-缬氨酸衍生物的氨基酸部分的外消旋化降低至少于0.2％，而这在现有技术中约为6％。像0.2％这样如此低的外消旋水平进一步处于药学上可接受的范围，因为这意味着一种对映体相对于另一对映体而言，具有更强的活性。
随后的对酯化的β-D-2′-C-甲基-胞苷的脱保护可使用溶于甲醇的氟化胺(NH4F)。溶于甲醇的氟化胺(NH4F)是在由(9)反应得到(10)中，用于化合物脱保护(即除去甲硅烷基和二甲基甲酰胺基)而选择的试剂(图4)。现有技术的方法(图5，(9a)→(10))采用了相同的试剂，但用了10当量的氟化胺，约3％的负荷率，需要色谱分离获得(10)，相比而言，本发明使用4当量的氟化胺，约10％的负荷率，不需要色谱分离。在改进的方法的此步中，使用更少的氟化胺及大约10摩尔当量的乙酸乙酯所带来的好处是，BOC-酯(10)水解为β-D-2′-C-甲基-胞嘧啶，也确定为4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃2-基)-lH-嘧啶-2-酮(6)被降低到最小。因此，本发明的方法在其有效的试剂使用和提高负荷率上具有优势。
另外，(10)通过简单的EtOAc/TBME/H2O处理而纯化，再次免去了色谱分离和纯化，从而再次避免了耗时耗力的色谱纯化步骤。在甲硅烷化、偶联及脱保护这3步后的纯的(10)的百分产率大约为60％-99％。
在改进方法的最后一步，(图4，(10)→(11))，用乙醇作为溶剂进行从β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-缬氨酸酯衍生物脱除BOC-保护基，负荷率从现有技术的2％增加到本方法的12％。在改进的方法中使用乙醇代替现有技术中的乙酸乙酯作为溶剂(图5，(10)→(11))，这一改变使得负荷增加。选择乙醇作为溶剂增加负荷率，进而使反应产率从现有技术的约80％提高到本发明的约95％，并避免了由乙酸乙酯产生的乙酸带来的污染。获得的最终产物(11)的＞98％的纯的形式，且L-缬氨酸外消旋化被抑制到少于0.2％。
因此，本发明从整体上改进的β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯)的原型化合物′-O-缬氨酸酯或其二盐酸盐的合成，使得总百分产率提高了约26％，周期降低了约80％。周期的减短主要归功于耗时耗力且耗费大的色谱分离和纯化步骤地避免。其他的因素包括负荷的增加，从而只需要进行更少的批次，以及使用易于处理的溶剂和试剂。使用更安全更便宜的溶剂和试剂给本发明带来了额外的好处。然而，如果产品的百分产率低于现有技术方法提供的产率，则这些好处可被忽视。本发明的方法提供了大约26％的产率的增加，因此非常有用。
定义和可选试剂在此使用的术语″基本上无端基异构体″或″基本上没有端基异构体存在″是指包括至少95％～98％(重量)，更优选为99％～100％(重量)的核苷的指定的端基异构体的核苷组合物。在一个优选的实施方式中，本发明的方法和化合物中基本上无端基异构体。
类似的，术语“被分离的”指的是包括至少85％或90％(重量)，优选95％～98％(重量)，更优选99％～100％(重量)核苷的核苷组合物，剩余部分含有其他化学物质或端基异构体。
术语″核糖酸-γ-内酯″和″核糖酸内酯″在本文中可互换使用，是指图1中的化合物1或其氧保护的衍生物。
此处使用的术语“保护的”除非特别指明，是指加到氧、氮或磷原子上的基团，以防止这些基团进一步反应或出于其他目的。大量已知的各种氧、氮或磷的保护基在有机合成中被人们所熟知。
适当的保护基的例子包括但不限于苯甲酰基；取代或未取代的烷基、取代或未取代的酰基、取代或未取代的甲硅烷基；取代或未取代的芳族或脂肪族酯、例如，芳基如苯甲酰基、甲苯酰基(例如对甲苯酰基)、硝基苯甲酰基、氯苯甲酰基；醚基如-C-O-芳烷基、-C-O-烷基、或-C-O-芳基；脂肪族基如酰基或乙酰基、包括任何取代或未取代的芳香族或脂肪族酰基、-(C＝O)-芳烷基、-(C＝O)-烷基、或-(C＝O)-芳基；其中，酰基的芳香部分或脂肪部分可以为直链或支链；所有的均可以进一步被不受含有改进的合成的反应影响的基团所取代(见Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，2ndEdition(1991))。例如，在本发明的一个实施方式中，保护基被不受选用的还原剂(优选Red-Al)影响的基团取代。对于使用醚作为保护基而言，引用Saischek等的U.S.6,229,008作为参考，其中报道了使用醚作为保护基对试剂的稳定和过程的条件带来明显的好处，特别是在戊呋喃糖苷的5′位。这就最终为分离、离析及纯化最终产物提供了便利，因此，提高了产物的百分产率。
糖羟基保护基的非限制性例子包括，甲硅烷基、苯甲酰基、对甲苯酰基、对硝基苯甲酰基、对氯苯甲酰基、酰基、乙酰基、-(C＝O)-烷基、和-(C＝O)-芳基，这些取代基都可以是未取代的或被一个或多个不受所选还原剂影响的基团所取代。在一个实施方式中，糖羟基保护基是苯甲酰基。氨基保护基优选为BOC(丁氧羰基)，-(C＝O)-芳烷基，-(C＝O)-烷基或-(C＝O)-芳基。在本发明的一个实施方式中，氨基酸保护基是BOC(丁氧羰基)。
在本申请中，术语″取代的″指由一个或多个指定的取代基进行的单一或多重取代。在公开或要求保护单一取代时，化合物可被取代基取代一次或多于一次。在公开或要求保护多重取代时，被取代的化合物可独立地被一个或多个公开的或要求保护的取代部分单次或多次取代。
这里使用的术语″烷基″除非特别指明，是指典型的C1到C10的饱和的直链、支链或环状的、一级、二级或三级烃，具体包括甲基、三氟甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、环己基甲基、甲基戊基和二甲基丁基。该术语包括取代和未取代的烷基。可在一个或多个位置取代烷基的部分选自由卤素(包括氟、氯、溴或碘)、羟基(例如CH2OH)、氨基(例如，CH2NH2、CH2NHCH3或CH2N(CH3)2)、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、叠氮基(如CH2N3)、氰基(CH2CN)、磺酸、硫酸根、磷酸、磷酸根或膦酸根)组成的组，如果需要，上述组中的任何一个或者所有的可以是未保护的或可根据现有技术教导而进一步被保护，例如，在Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，2ndEdition(1991)中所教导的那样。
术语″烷基氨基″和″芳基氨基″分别包括具有一个或多个烷基或芳基取代基的氨基。
术语″烷芳基″和″烷基芳基″包括具有芳基取代基的烷基。术语″芳烷基″和″芳基烷基″包括具有烷基取代基的芳基。
术语“卤素”包括氯、溴、碘和氟。
这里使用的术语″芳基″，除非特别指明，是指苯基、联苯基或萘基。该术语包括取代或未取代的部分。
芳基可被一个或多个部分取代，其包括但不限于羟基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸根、磷酸、磷酸根或膦酸根，如果需要，上述任何一个或者所有的可以是未保护的或可根据现有技术教导而进一步被保护，例如，在Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，JohnWiley and Sons，2ndEdition(1991)中所教导的那样。
术语″酰基″包括-C(＝O)-R，其中的非羰基部分R是直链的、支链的或环状烷基或低级烷基、烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)、芳烷基(包括卞基)、芳氧基烷基如苯氧基甲基、芳基，包括任选被卤素取代的苯基、C1～C4的烷基或C1～C4的烷氧基、磺酸根，如磺酸烷基根或磺酸芳烷基根，包括甲基磺酰基、单-、二-或三-磷酸根、三苯甲游基或单甲氧基三苯甲游基、取代的卞基、三烷基甲硅烷基，如二甲基-叔丁基甲硅烷基)、或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基最好包含苯基。术语″低级酰基″指其非羰基部分是低级烷基的酰基。
术语″羧酸″和″羧酸酯″分别包括结构RC(＝O)OH和RC(＝O)O-R′。这里的非羰基部分，无论是R或R′，例如可以是直链的、支链的或环状烷基或低级烷基、烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)、芳烷基(包括卞基)、芳氧基烷基如苯氧基甲基、芳基，包括任选被卤素取代的苯基、C1～C4的烷基或C1～C4的烷氧基。磺酸根，如磺酸烷基根或磺酸芳烷基根，包括甲基磺酰基、单-、二-或三-磷酸根、三苯甲游基或单甲氧基三苯甲游基、取代的卞基、三烷基甲硅烷基，如二甲基-叔丁基甲硅烷基)、或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基最好包含苯基。在所有的情况下，R和R′可以是相同或不同的取代基。
术语氨基酸包括天然的和合成的α、β、γ和δ氨基酸，包括但不限于蛋白质中的氨基酸、如甘氨酸、丙胺酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺酸、谷酰胺、天门冬胺酸酯、谷氨酸酯、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。在优选的实施方式中，氨基酸是L-构型。在另一优选实施方式中，氨基酸是L-缬氨酸。另外，氨基酸也可以是丙氨酰、缬氨酰、亮氨酰、异亮氨酰、脯氨酰、苯基丙氨酰、色氨酰、蛋氨酰、甘氨酰、丝氨酰、苏氨酰、半胱氨酰、酪氨酰、天冬酰胺酰、谷氨酰、aspartoyl酰、glutaroyl酰、赖氨酰、精氨酰、组氨酰、β-丙胺酰、β-缬氨酰、β-亮氨酰、β-异亮氨酰、β-脯氨酰、β-苯基丙氨酰、β-色氨酰、β-蛋氨酰、β-甘氨酰、β-丝氨酰、β-苏氨酰、β-半胱氨酰、β-酪氨酰、β-天冬酰胺酰、β-谷氨酰、β-aspartoyl酰、β-glutaroyl酰、β-赖氨酰、β-精氨酰、β-组氨酰的衍生物。
术语“非天然氨基酸”指具有氨基端基但不存在于天然的羧酸。该术语还包括D-和L-氨基酸，以及它们的任何一种互变异构或立体异构形式。
术语核苷碱基，包括嘌呤或嘧啶碱基。嘌呤或嘧啶碱基的例子包括但不限于腺嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-酰基嘌呤(其中，酰基是C(O)(烷基、芳基、烷芳基或芳烷基)、N6-卞基嘌呤、N6-卤代嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-乙炔基嘌呤、N6-酰基嘌呤、N6-羟基烷基嘌呤、N6-硫代烷基嘌呤、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、6-氮嘧啶，包括6-氮胞嘧啶、2-和/或4-巯基嘧啶、尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶，包括5-氟尿嘧啶、C5-烷基嘧啶、C5-卞基嘧啶、C5-卤代嘧啶、C5-乙烯基嘧啶、C5-乙炔基嘧啶、C5-酰基嘧啶、C5-羟基烷基嘌呤、C5-氨基嘧啶、C5-氰基嘧啶、C5-硝基嘧啶、C5-氨基嘧啶、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、5-氮胞苷基、5-氮尿嘧啶基、叠氮基吡啶基、咪唑吡啶基、吡咯嘧啶基和吡唑-嘧啶基。嘌呤碱基包括但不限于鸟嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和6-氯嘌呤。碱基上的功能性氧和氮基团如果需要可被保护。适当的保护基对于本领域技术人员是已知的，包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲游基、烷基和酰基，如乙酰基和丙酰基，甲基磺酰基和对甲苯磺酸。另外，嘌呤或嘧啶碱基也可以任选被取代，形成可行的前药，能在体内分裂。合适的取代基的例子包括酰基部分，胺或环丙基(例如，2-氨基，2，6-二氨基或环丙基鸟苷)。
用于本发明的方法或现有技术中的其他试剂的定义如下BSA(二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺)，TMSCl是氯代三甲基硅烷；TFAA是三氟乙酸酐；TBDPSCl是叔丁基二苯基甲硅烷基氯；TBDMSCl是叔丁基二甲基甲硅烷基氯；DCM是二氯甲烷。
本发明的方法不限于使用核苷、保护的氨基酸酯和示例的试剂。对本发明的适合的可选试剂可用于替代上述的试剂。例如，TEA(三乙胺)可被其他适合的胺代替，其包括但不限于二异丙基乙胺、N-乙基吗啉或其他的三级脂肪胺；DME(1，2-二甲氧基乙烷)可被任何适合的极性非质子溶剂代替，例如THF(四氢呋喃)或其他的醚；Red-Al/EtOH(二(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠/乙醇)的甲苯溶液可被NaHTe、SmI2、H2+Pd-磷化氢催化剂或LiAl(OtBu)3H(三叔丁氧基氢化铝锂)代替，所有的这些都产生了化学选择和区域选择还原，唯独LiAlH4产生了开链的二醇。在加入MgSO4前后用THF洗产物浆液可以替代为在丙酮中洗。确实，在规模扩大时，丙酮是一种优选的溶剂。
此外，尽管DMF在容易处理和易于从反应混合物中除去上是优选的，但DMF(二甲基甲酰胺)可被任何极性溶剂代替，例如，DMSO(二甲亚砜)。EDC(1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基-碳二酰亚胺氯化氢)；也被称为DEC)可被任何能进行偶联的试剂代替，其包括但不限于CDI(羰基二咪唑)、BOP试剂(苯并三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)-膦六氟磷酸盐)，或已知的类似偶联试剂。尽管SnCl4是优选的，但这里可用路易斯酸代替。路易斯酸包括但不限于SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl2、TiCl4、FeCl3、SnCl2及它们的混合物。在一个实施方式中，路易斯酸是SnCl4。可用任何的有机溶剂如甲苯等替代乙腈。任何的活化剂，如甲硅烷试剂均可用于使核苷活化进行偶联。HMDS(六甲基二硅氮烷)、TMSCl或TBDPSCl等均可用于代替BSA(二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺)。氨可用于替代溶于甲醇的甲醇钠，任何极性溶剂DMSO可代替DMF。多种其他甲硅烷化试剂均可代替TBDPSCl，任何氟盐均可代替NH4F，并且其他的酸如TFA可用于代替HCl。
制备方法步骤的详细描述核糖酸内酯的制备 核糖酸内酯可通过任何发表的或未发表的方法，包括标准的氧化和取代技术制备。本发明的合成核糖酸内酯的一个实施方式是通过D-果糖，按照以下的步骤进行。
核糖酸内酯可通过D-果糖与氧化钙(CaO)的反应制得。D-果糖可与CaO以任意摩尔比例进行反应，条件是反应以能够接受的速率进行而无过多的副产物，对D-果糖，优选的摩尔比率是5∶1，更优选的摩尔比率是3∶1，最优选的摩尔比率是2.3∶1.3。CaO可以任何速率加入，条件是反应以能够接受的速率进行而不会产生过量的热或过多的副产物。在一个实施方式中，CaO在室温下5分钟内递增加入。反应可一直进行到D-果糖几乎被消耗完，例如进行6～22小时，其间，反应进程可被监控，例如定期取出一定量用于TLC分析。
反应可在任何温度下进行，条件是反应以能够接受的速率进行而不会促使分解或过量的副产物的产生。优选的温度是从室温到约23～40℃。
可利用沉淀剂来从溶液中除去钙。在一个实施方式中，向反应混合物中加入CO2和比核糖酸强的酸，在一个优选的实施方式中，加入的是有机酸，形成碳酸钙。适合的有机酸包括但不限于草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸、马来酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、丁酸、戊酸己酸或己酸。
因此，在本发明的一个实施方式中，在反应结束阶段，可在适当的时间内向混合物中鼓入CO2，例如，2～3小时，以将pH从碱性降低到中性水平。任何在中和步骤中形成的CaCO3均可被除去，例如通过真空过滤除去。
然后，水层可用酸处理，所用的酸例如为比核酸强的有机酸，例如，草酸，其摩尔比率可以为任意比例，条件是反应以能够接受的速率进行而不会产生过多的副产物。在一个实施方式中，添加的酸(例如草酸)与D-果糖的摩尔比率为1∶2。
反应可进行到几乎所有的钙都发生沉积的程度，这里包括在任何温度下，以可接受的速度从溶液中沉积出，而不会促使分解或形成过量的副产物。例如，在室温或25℃左右搅拌溶液约30分钟，至出现白色的桨液。然后在约45～50℃搅拌该桨液过夜。
完成后，可蒸发溶液，例如在减压下进行，以除去决大部分的水但仍留下液体混合物。产物可用已知方法从液体混合物中分离出。例如，可在室温下约30分钟内向桨液中加入NaCl和有机溶剂，如THF。分离形成的各层，向水层中加入THF等新鲜的溶剂，再搅拌约10分钟。加入溶剂、搅拌和分离所得水层的步骤可根据需要而重复多次，例如可重复3次。最后，可合并有机溶液，并加入MgSO4等干燥剂后搅拌约30分钟，然后过滤，再用溶剂如THF洗。滤液可蒸发，例如在40℃下减压蒸发，然后可收集粗产物，其为深橙色的半固体物质。
另外，为纯化产物，也可向粗产物中加入丙酮等第二种溶剂，混合物在20℃搅拌3小时。可通过真空过滤收集白色结晶的核糖酸内酯产物，并用如丙酮之类的第二种溶剂洗，并真空干燥(见图1，化合物1)。
该反应的产品产率可达到约13.6％，比现有技术的大约提高了4％。
核糖酸内酯的自由羟基可继续被适当的保护基选择性地保护，优选的保护基是酰基或甲硅烷基，保护方法可采用本领域公知的方法，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，Second Edition，1991中教导的方法。例如，可在室温下使氯代叔丁基二苯基硅烷与核糖酸内酯在无水吡啶中反应。也可以用酰氯，如苯甲酰氯与核糖酸内酯优选在碱存在下在DME中回流的条件下反应。
例如，核糖酸内酯产物可与如DMAP等碱以任意摩尔比率混合，条件是反应以能够接受的速率进行而不会产生过多的副产物。在一个实施方式中，核糖酸内酯∶碱(例如DMAP)的摩尔比率约为5∶1。任选通过使用额外的碱来促进反应，例如，以任意的比率使用TEA，但条件是反应以能够接受到速的率进行而不会产生过多的副产物。在本发明的一个实施方式中，使用过量的额外的碱(例如TEA)。在足够长的时间后，以任意的摩尔比率加入苯甲酰氯等酰氯，使得反应以可接受的速率进行，而不会产生过量的副产物。与核糖酸内酯的摩尔比率大约为5∶1。
核糖酸内酯可在任意的溶剂中制备，只要该溶剂满足温度和反应试剂的溶解度的要求即可。溶剂可由任意的非质子溶剂构成，其包括但不限于烷基溶剂，如己烷和环己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF、二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、DME、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或其任意组合，但优选使用DME。
反应可在任意温度下以能够接受的速率完成，但条件是不会产生过多的副产物。优选的温度范围是从室温到约5℃。
然后，可向反应混合物中加入冰水，其后收集粗产物，在叔丁基甲醚等合适的溶剂中搅拌、过滤、洗涤，并通过真空等进行干燥。
为了进行比较，图2中给出了现有技术中Kiliani的制备核糖酸内酯的方法。Kiliani方法的详细描述在Sowden的Adv.In Carbohydrate Chem.1957，1243中给出，其中教导到，加入Ca(OH)2后14天再次加入，然后混合物放置1～2个月，期间偶尔摇动摇动。然后，过滤混合物，滤液用CO2饱和。接着，通过加入完全等当量的草酸，使钙离子沉淀，过滤溶液，浓缩成桨液，再在低温条件下待该桨液结晶几天。最后，将母液从结晶体中分离，再用水溶解结晶体并进行重结晶。
保护的核糖酸内酯的还原 由前述步骤得到的任选保护的2-C-甲基-D-核糖酸-γ内酯可用任何适当的还原剂进行还原，所用还原剂的摩尔比率任选，但条件是反应以能够接受的速率进行而不会产生过多的副产物。适当的还原剂包括但不限于Red-Al/EtOH(二(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠/乙醇)、NaHTe、SmI2、H2+Pd-磷化氢催化剂或LiAl(OtBu)3H(三叔丁氧基氢化铝锂)代替，所有的这些都产生了化学选择和区域选择还原。在本发明的一个实施方式中，还原剂是Red-Al/乙醇。例如，Red-Al溶液可被加入到任选保护的2-C-甲基-D-核糖酸-γ内酯溶液中，其中，Red-Al与2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ内酯的摩尔比率约为2∶1。
有趣的是，发现了某些试剂并不理想，在用于本发明方法的过程中产生了期望的和不期望的产物的混合物。例如，当用LiAI(Ot-Bu)3H代替Red-Al的乙醇溶液时，LiAI(Ot-Bu)3H使得反应变慢，并形成了多种不期望的产物。类似的，9-硼二环-[3.3.1]-壬烷、9-BBN和二异丁基氢氧化铝、DIBALH不发生反应，或者只产生非常少量的期望的产品。
反应可在任何温度下完成，但条件是反应以能够接受的速率进行而不会产生过多的副产物。优选的温度是从约0℃～5℃。
呋喃核糖可在任何满足温度和试剂溶解性要求的溶剂中制备。溶剂可包括任意的有机溶剂，包括但不限于烷基溶剂，如戊烷、己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、DME、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺、醇类溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、戊醇和辛醇，或它们的组合，但优选的是无水甲苯和无水乙醇溶液。
可用合适的质子源，如丙酮、水和1NHCl使反应结束。混合物可用有机溶剂如乙酸乙酯萃取，用盐水洗、干燥、在减压约40℃下除去溶剂。
然后，呋喃核糖的自由羟基可用合适的保护基进行选择性保护，优选的保护基是酰基或甲硅烷基，保护方法可采用本领域公知的方法，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，Second Edition，1991中教导的方法。例如可在室温下使氯代叔丁基二苯基硅烷与呋喃核糖在无水吡啶中反应。也可以用酰氯，如苯甲酰氯与呋喃核糖优选在碱存在下在DME中回流的条件下反应。
图3是Harry-O′kuru et al，J.Org.Chem.，(1997)，62(6)1754-59中提供的可替换方法。该方法缺少内酯中间体，但用于获得与本发明相同的产物。Harry-O′kuru的方法利用了除C2位外的所有的羟基均在形成酮之前被保护了的D-树胶醛醣或D-核糖(图3)。被保护了的糖与Dess-Martin periodinane试剂在CH2Cl2和MgSO4中反应，得到2，4-二-O-苯甲酰-5-甲基-O-苯甲酰-二氢呋喃-3-酮，然后再用MeTiCl3，MeMgBr/TiCl4(或RCeCl2，其中，R将是核糖C2上的取代基)进行还原。化合物(3)和4(4a)与BzCl/DMAP/Et3N的反应产生了最终产物(4b)，1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-R-核糖呋喃糖苷。需要注意的是，在第一步中，目标产物的水合物大量产生，需要与过量的MgSO4反应以制备基本上完全干燥的酮产物。并且，已观察到，在关键中间体2-酮与有机钛试剂反应中，产生了期望的1，3，5-苯甲酰-保护的-2-烷基核糖呋喃糖苷和其酯交换的2，3，5-苯甲酰-保护的核糖呋喃糖苷的α-和β异构体的混合物。由于三种产物对于该作者均有用，所以这对他们而言无关紧要。这样的合成就需要额外的分离步骤来获得单一定异构体(J.Org.Chem.，1997，62(6)1754-9，at 1755)。无论是D-树胶醛醣或D-核糖均可用作此目的的起始原料，但使用D-树胶醛醣时不得不考虑到其经济性，其费用大约为使用D-果糖的250倍！图3中的现有技术的方法与本发明的区别在于，除C2位外，D-树胶醛醣或D-核糖的所有的羟基均在形成酮之前被保护。然后，通过与Dess-Martinperiodinane(见图3，化合物3)试剂反应，在起始化合物的C2上形成了酮，接着被MeTiCl3或RCeCl2还原，其中的R是将要取代核糖C2上的第二取代基。(见图3，化合物3和4)。最终产物1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-烷基-核糖呋喃糖苷的产率约为79％。
相比而言，本发明的方法更为有效，其提供的内酯形成于呋喃核糖的C1，对C2，C3和C5进行羟基保护，优选用Red-Al在乙醇内还原内酯，产生区域选择的易于分离的端基异构产物，然后对位于呋喃核糖的C1的单独的剩余自由羟基进行保护。
呋喃核糖与活化的胞嘧啶的缩合反应 由前步得到的或由其他已知方法得到的任选保护的2-C-甲基-D-核糖酸呋喃糖可用任何公知的方法与核苷碱偶联，这些方法包括采用活化碱的标准偶联技术。
本发明的一个实施方式包括按照以下步骤进行的合成β-D-2′-C-甲基-胞苷的方法。
β-D-2′-C-甲基-胞苷可通过使2-C-甲基-D-核糖酸呋喃糖与活化的未保护的(如未苯甲酰化的)胞嘧啶反应而得到，这样的胞嘧啶可以是如用活化剂活化的胞嘧啶，例如甲硅烷化试剂，其包括但不限于BSA((N，O-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺)、HMDS、TMSCl或TBDPSCl。在一个实施方式中，甲硅烷化试剂是BSA。
反应可任选在如SnCl4这样的路易斯酸存在下进行，所用路易斯酸的摩尔比率任选，但条件是反应以能够接受的速率进行而不会产生过多的副产物。合适当路易斯酸包括但不限于SnCl4、BF3、AlCl3，TiCl2，TiCl4，FeCl3，SnCl2及它们的混合物。在一个实施方式中，路易斯酸是SnCl4。
β-D-2′-C-甲基-胞苷可在任何满足温度和试剂溶解性要求的溶剂中制备。溶剂可包括任意的非质子溶剂，包括但不限于烷基溶剂，如己烷和环己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它们的组合，但优选的是乙腈。
该反应可在任何温度下完成，但条件是反应以能够接受的速率进行而不会促使分解或过多的副产物。优选的温度是约20℃～80℃。
然后，核苷可用已知道方法进行脱保护，脱保护的方法可采用本领域公知的方法，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley andSons，Second Edition，1991中教导的方法。例如，苯甲酰保护的羟基部分可用NaOMe的MeOH溶液在约室温下脱去保护。
图5中表示的现有技术的方法包括使苯甲酰胞嘧啶、BSA和SnCl4/乙腈与1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)反应，形成4-苯甲酰氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧基-5-苯甲酰氧基甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-lH-嘧啶-2-酮(5a)；使(5a)与NH3在甲醇中反应并用色谱分离产物，4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-lH-嘧啶-2-酮(6)，也称为β-D-2′-C-甲基-胞苷；使(6)与Me2NCH(OMe)2在DMF中室温下反应1.5小时，形成N[1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氢嘧啶-4-基]-N，N-二甲基-甲脒(7)，使(7)与TBDPSCl和吡啶在室温下反应6小时形成N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羟基-3-甲基-四氢呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氢嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒(8)；使(8)与N-Boc-L-缬氨酸、DEC和DMAP在THF/DMF中于室温下反应2天，并将由该反应得到的产物通过HPLC获得2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基亚甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羟基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯(9a)；将(9a)与NH4F在MeOH中回流约3小时，以除去甲硅烷基和氨基保护基，并将产物进行色谱纯化，得到2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸-5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟基甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯(10)；最后，使(10)与HCl在EtOAc中于室温下反应得到2-氨基-3-甲基-丁酸-5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟基甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯，二盐酸盐(11)作为最终产物。÷图6在这里是作为现有技术中用于制备β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)的另一供选方法。该现有技术方法利用了尿嘧啶作为起始原料，并包含使尿嘧啶与BSA在乙腈中与1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)反应约30分钟，在乙腈种加入路易斯酸SnCl4，将所得溶液回流约4小时，色谱分离产物1-(3，4-二卞氧基-5-卞氧基-甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(12)；使(12)与NaOMe在甲醇种反应约4.5小时，以除去苯甲酰保护基，然后分离和结晶产物1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(13)，也被称为β-D-2′-C-甲基-尿苷；最有，使(13)顺次与TMSCl和N-甲基吡咯烷在CH3CN中反应约3.5小时，冷却并在约30分钟内加入三氟乙酸酐(TFAA)，在0℃加入4-硝基苯酚，搅拌约3小时，加入NH4OH的二噁烷并加热到50℃，过夜后，通过色谱方法和结晶分离最终产β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的酯化由前述步骤或任何已知方法获得的任选保护的β-D-2′-C-甲基-胞苷可通过已知道任何方法进行酯化。
本发明的一个实施方式包括合成β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-酯的方法，特别是以下的β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-缬氨酸酯的方法。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-酯可通过采用任何已知的方法任选保护β-D-2′-C-甲基-胞苷的氨基而制得。例如在Greene，et al.，Protective Groups in OrganicSynthesis，John Wiley and Sons，Second Edition，1991中教导的方法。在本发明的一个实施方式中，β-D-2′-C-甲基-胞苷可与Me2NCH(OMe)2在DMF中反应，产生N[1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲脒。
在一个具体的实施方式中，化合物可进一步用TBDPSCl和咪唑进行保护，提供5′-甲硅烷基-保护的化合物，N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羟基-3-甲基-四氢呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基甲脒，反应可在任意溶剂中进行，条件是其与温度和试剂的溶解性相适合。溶剂可包括任何非质子溶剂，包括但不限烷基溶剂，如己烷和环己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它们的任意组合，但优选DCM。
然后，任选保护的β-D-2′-C-甲基-胞苷可与任何适合的结构偶联得到药学上可接受的β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-前药，偶联可使用已知的任何方法进行，包括标准缩合反应。被偶联的部分可以是磷酸根(包括单-、二-或三-磷酸根以及稳定的磷酸根)；直链的、支链的或环状烷基(包括低级烷基)；酰基(包括低级酰基)；CO-烷基、CO-酰基、CO-烷氧基烷基、CO-烷氧基烷基、CO-取代的芳基、磺酸酯(包括磺酸烷基酯或磺酸芳烷基酯，包括甲基磺酰基)；卞基，其中的苯基被一个或多个在芳基定义中描述的取代基任选取代；烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺酰基、脂质(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；胆固醇或药学上可接受的离去基团，当体内施用时，其能提供自由羟基(或磷酸根)。
在本发明的一个实施方式中，期望的3′-前药是β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-缬氨酸酯，可通过以下步骤制备。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-缬氨酸酯可通过使任选保护的β-D-2′-C-甲基-胞苷(例如5′-和N-保护的β-D-2′-C-甲基-胞苷)与N-Boc-L-缬氨酸优选在偶联剂，如EDC及碱如DMAP存在下反应，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基-甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亚甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羟基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯而制备。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-缬氨酸酯可在任何满足温度和试剂溶解性要求的溶剂中制备。溶剂可包括任意的非质子溶剂，包括但不限于烷基溶剂，如己烷和环己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它们的任意组合，但优选的是DCM。
该反应可在任何温度下完成，但条件是反应以能够接受的速率进行而不会促使分解或过多的副产物。优选的温度是在室温附近。
然后，β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-缬氨酸酯可用已知的方法脱去保护，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，SecondEdition，1991中教导的方法。在本发明的一个具体实施方式
中，叔丁基二苯基甲硅烷基保护的5′-OH和N Boc-保护的L-缬氨酸可用NH4F在MeOH中，在大约10摩尔当量的乙酸乙酯存在下(为防止析出的氨切断′-O-缬氨酸酯)，回流混合物得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯，从而脱去保护。
3′-缬氨酸酯可用已知的方法转化为盐，这些方法包括使β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-缬氨酸酯与HCl在EtOH中反应，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯，二盐酸盐，作为最终产物。
优选实施方式本发明的一个优选定实施方式在图1中示出，其包括使D-果糖在CaO/水存在下于23-40℃反应6-22小时，然后向反应混合物中加入CO2和草酸，使反应进行8-12小时，形成2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯(1)；使2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯(1)与4-二甲基氨基吡啶(DMAP)与三乙胺(TEA)在1，2-二甲氧基乙烷(DME)中于5-25℃反应约30分钟，冷却混合物至约5℃。加入苯甲酰氯，得到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯(2)；使2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯(2)与Red-Al/乙醇在甲苯中于-5～0℃下反应约40分钟，得到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(3)，最后在DMAP和DME存在下，向2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(3)的冷溶液中，加入苯甲酰氯/TEA，在约5～50℃下使反应进行约4小时到约12小时，得到最终产物(4)，2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
具体而言，D-果糖的水溶液在室温下调制，加入到其中的CaO的优选摩尔比率为5∶1，更优选为3∶1，最优选为2.3∶1.3，加入方式为5分钟内渐增加入。反应于23～40℃下进行6～22小时，定期取出反应液进行TLC分析。
在反应周期结束之际，可在适当的时间内向混合物中鼓入CO2约2～3小时，以将pH从碱性降低到中性水平。任何在中和步骤中形成的CaCO3均可被除去，例如通过真空过滤除去。合并水层，并用草酸(或其他有机酸)和D-果糖以1∶2的摩尔比率处理，在25℃搅拌约30分钟直到出现白色浆液。然后，于45-50℃搅拌该浆液过夜，减压下蒸馏除去绝大部分的水，得到仍为液体状态的混合物。室温下向浆液中加入NaCl和THF，搅拌约30分钟。分离所得的层，将水层加入到新鲜的THF中，另搅拌10分钟。加入THF、搅拌和分离所得液体层的过程重复3次。最后，合并所有的THF溶液，与无水MgSO4一同搅拌30分钟，过滤混合物，用THF洗MgSO4滤饼。滤液在约40℃下减压蒸馏，收集粗产物，为深橙色半固体状。
然后，向粗产物中加入丙酮，混合物在20℃下搅拌3小时。真空过滤收集白色结晶的核糖酸内酯产物，用丙酮洗并真空干燥(见图1，化合物1，流程1)。该反应的产物产率约为13.6％，与现有技术相比较而言，提高了近4％。
然后，获得的核糖酸内酯产物与DMAP以摩尔比率约5∶1(核糖酸内酯∶DMAP)、过量的TEA和DME混合，室温下搅拌约30分钟。所得的悬浮液冷却到5℃，以与核糖酸内酯约5∶1的比率加入苯甲酰氯。室温下搅拌混合物约4小时，直到通过TLC确认起始原料已消耗完。然后，向反应混合物中加入冰水并搅拌约30分钟，接着，收集粗产物，与叔丁基甲基醚搅拌、过滤、洗涤并真空干燥。收集到的白色固体是2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ内酯，产率为83.4％，纯度接近98％(见图1，化合物2)。
由先前步骤获得的2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ内酯被冷却到约-5℃，向其中加入事先在0℃混合的Red-Al的无水甲苯和无水乙醇的溶液。Red-Al与2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ内酯的摩尔比率约为2∶1。混合物保持在-5℃搅拌约40分钟。从混合物取出样液用于TLC和/或HPLC分析，以确认起始原料是否消耗完，然后用丙酮、水和1N HCl使反应结束，恢复至室温。最后，混合物用乙酸乙酯萃取，用盐水洗、干燥，在约40℃下减压除去溶剂。所得产物2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-呋喃核糖的产率是以在该步骤开始时使用的2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ内酯的量为基准的定量产率。(见图1，化合物3)。
呋喃核糖C-1的保护基紧接着在下一步形成。苯甲酰氯以大约2∶1的摩尔比率加入到5℃的2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-呋喃核糖的溶液中，同时加入的还有溶于无水DME的DMAP和TEA。搅拌反应并过夜，然后，用冰水和碳酸钠水溶液使反应结束。然后，除去THF，混合物用乙酸乙酯萃取。洗涤、干燥和去除溶剂后产生稠的油状产物。向其中加入叔丁基甲醚、庚烷和水，在约20℃搅拌约2小时。洗涤和真空干燥后，最终产物1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖的产率为52％，纯度大于98％(见图1，化合物4，流程1)。
本发明的另一优选实施方式示于图4，包括使胞嘧啶、BSA和SnCl4/乙腈与本发明第一实施方式中的1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)反应，得到4-氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧基-5-苯甲酰氧基甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(5)；使(5)与NaOMe/MeOH反应，得到(4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-C-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(6)，也被称为β-D-2′-C-甲基-胞苷。使用胞嘧啶作为起始原料而不是苯甲酰-胞嘧啶，提高了过程的“原子效益”，并简化了后续步骤中的纯化。
合成可以(6)的形成而终结，产物通过已知的方法进行分离。另外，还可进一步进行合成，制备β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-4-C-甲基-2-羟甲基-四氢呋喃-3-基酯)的3′-O-缬氨酸酯，或者其优选的盐酸盐形式，本发明的第四优选实施方式。
在本发明的另一优选实施方式中，化合物(6)与Me2NCH(OMe)2在DMF中反应，形成(7)，N-[1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲脒，其是(6)的氨基酸-保护形式；使(7)与TBDPSCl和咪唑在DCM中反应，得到(7)的5′-甲硅烷基-保护的形式，即N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羟基-3-甲基-四氢呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒(8)，其中，使用DCM的好处是对二甲硅烷副产物的形成有更佳的控制；使(8)与N-Boc-L-缬氨酸、EDC和DMAP在DCM中于室温下反应，形成2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基-甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亚甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羟基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯(9)；通过使(9)与NH4F在MeOH中在大约10摩尔当量的乙酸乙酯(为防止析出的氨切断3′-O-缬氨酸酯)存在下反应，除去甲硅烷基和氨基-保护基，并回流混合物，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯(10)；最后，使(10)与HCl在EtOH中反应，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯，二盐酸盐(11)作为最终产品。
本发明进一步示例于以下的非限制性实施例中。这里给出的这些实例是为了帮助对发明的理解。它们对本发明方法和产品的描述不应理解为对权利要求中限定的本发明构成任何限制。在不脱离本发明精神的前提下，等同物、类似或适合的溶剂、试剂或反应条件可被替换为此处描述的那些特定的溶剂、试剂和/或反应条件。
实施例实施例12-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯在配备了悬挂式搅拌器、搅拌轴、数字温度读出装置和氩气通道的250mL的3口圆底烧瓶中，搅拌去离子水(100mL)。鼓入氩气30分钟，加入D-果糖(20.0g，0.111mol)，溶液在几分钟内变得清澈。在5分钟内分批加入氧化钙(12.5g，0.223mol)，剧烈搅拌混合物。观察到放热，从加入氧化钙起10分钟后反应温度升至39.6℃。大约15分钟后，反应混合物变为黄色，且颜色随时间而加深。3小时后，取出部分反应混合物进行TLC分析。取出的部分用饱和草酸水溶液酸化到pH 2。所得到白色悬浮液在减压下蒸馏除去水。向残液中加入甲苯(2mL)，混合物在减压下蒸馏(在45-50℃)，除去所有残留的水。残余固体再次加入到2mL的1∶1的四氢呋喃∶甲醇混合物中。充分混合后，使悬浮液静置，用上清液点TLC(硅胶板，用含2％甲醇的乙酸乙酯展开，浸在1％碱性高锰酸钾中染色。然后，使用热枪加热板，直到在粉色背景中出现黄色的点)。在上述条件下，期望的内酯通常出现在Rf值为0.33处。更多的极性副产物和未反应的原料在Rf值为0.0～0.2处检测到。
尽管3小时后观察到产物的形成，反应仍继续进行22小时。其间，反应混合物在25℃搅拌。在该期间最后，混合物的pH是13.06。向反应混合物中鼓入二氧化碳气体约2.5小时(pH为7.25)。形成的碳酸钙固体通过真空过滤除去，滤饼用50mL去离子水洗。合并水层并用草酸(5.0g，0.056mol)处理，在25℃下对混合物剧烈搅拌30分钟(最初的深色基本上消失，混合物变为乳白色浆液)。此阶段的混合物的pH通常为2-3。浆液混合物在45-50℃下搅拌过夜。然后，在45-50℃下减压蒸馏混合物，除去75mL水。向水性浆液(约75mL)中加入氯化钠(30g)和四氢呋喃(100mL)，在25℃剧烈搅拌混合物30分钟。分离各层，用75mL的新鲜四氢呋喃搅拌水层10分钟。该过程重复3次，合并四氢呋喃溶液并与10g的无水硫酸镁搅拌30分钟。过滤混合物，硫酸镁滤饼用60mL四氢呋喃洗。滤液在40℃下减压蒸馏，得到10.86g粗产物，其为深橙色半固体。(对于更大规模的合成，用丙酮代替四氢呋喃取代蒸馏粗产物至干燥)。在20℃下，将粗产物在丙酮(20mL)中搅拌3小时。真空过滤收集产物，用12mL丙酮洗滤饼，得到白色结晶固体的期望产物1。真空干燥得到2.45g(13.6％产率)。化合物1的熔点158-162℃(文献报道熔点160-161℃)。1H NMR(DMSO-d6)δppm 5.69(s，1H，用D2O交换)，5.41(d，1H，用D2O交换)，5.00(t，1H，用D2O交换)，4.15(m，1H)，3.73(m，2H)，3.52(m，1H)，1.22(s，3H)。13C NMR(DMSO-d6)δppm 176.44，82.95，72.17，72.02，59.63，20.95。(C6H10O5计算值C，44.45；H，6.22。实测值C，44.34；H，6.30)。
实施例22，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-内酯在25℃氩气氛围中搅拌丙酮1(3.0g，18.50mmol.)、4-二甲基氨基吡啶(0.45g，3.72mmol.)和三乙胺(25.27g，249.72mmol.)在1，2-二甲氧基乙烷(50mL)中的混合物30分钟。将该白色悬浮液冷却到5℃，在15分钟内加入苯甲酰氯(11.7g，83.23mmol.)。在25℃搅拌混合物两小时。TLC分析(硅胶，2％甲醇的乙酸乙酯溶液)表明起始原料完全消耗。向反应混合物中加入冰水(100g)，继续搅拌30分钟。形成的白色固体通过真空过滤收集，用冷水(50mL)洗滤饼。在20℃将该粗产物与叔丁基甲醚(60mL)一同搅拌，然后过滤，滤饼用叔丁基甲醚(25mL)洗，并真空干燥，得到7.33g化合物2(83.4％产率)，其为白色固体，纯度为97.74％(HPLC/AUC)。化合物2的熔点137-140℃(文献值141-142℃)。1H NMR(CDCl3)δppm 8.04(d，2H)，7.92(d，2H)，7.73(d，2H)，7.59(t，1H)，7.45(m，4H)，7.32(t，2H)，7.17(t，2H)，5.51(d，1H)，5.17(m，1H)，4.82-4.66(d of an ABquartet，2H)1.95，(s，3H)。13C NMR(CDCl3)δppm 172.87，166.17，166.08，165.58，134.06，133.91，133.72，130.09，129.85，129.80，129.37，128.78，128.60，128.49，127.96，127.89，79.67，75.49，72.60，63.29，23.80。TOF MS ES+(M+1475)。
实施例32，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖对Red-Al(65wt.％溶于甲苯，2.0mL，6.56mmol)在无水甲苯(2.0mL)中的溶液在0℃氩气氛围下搅拌。无水乙醇(0.38mL，6.56mmol)在无水甲苯(1.6mL)中的溶液在5分钟内被加入到上述甲苯溶液中。所得混合物在0℃搅拌15分钟，将该Red-Al/乙醇试剂中的2mL(2.18mmol)在10分钟内加入到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸内酯2(475mg，1.0mmol)的无水甲苯(10mL)的冷溶液(-5℃)中。TLC分析(硅胶板，35％乙酸乙酯的庚烷溶液)表明起始原料完全消耗。HPLC分析表明仅残余0.1％的起始原料。用丙酮(0.2mL)，水(15mL)和1NHCl(15mL)在0℃使反应结束，并加热到室温。加入1N HCl(5mL)溶解无机盐(pH2-3)。用乙酸乙酯(3×25mL)萃取混合物，用盐水(25mL)洗有机溶液，干燥(无水硫酸钠，10g)，40℃减压下除去溶剂，得到期望的产物3，定量产率(480mg)。该材料被用于以下的步骤。
实施例41，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖向冷的化合物3(480mg，1.0mmol)、3，4-二甲基氨基吡啶(12.3mg，0.1mmol)和三乙胺(506mg，5.0mmol)的无水四氢呋喃(5mL)溶液中，于5分钟内加入苯甲酰氯(283mg，2.0mmol)。室温下氩气氛围中搅拌反应混合物过夜。HPLC分析表明有0.25％未反应的起始物质。反应通过加入冰水(10g)和碳酸氢钠饱和溶液而结束。减压下除去四氢呋喃，用乙酸乙酯(50mL)萃取混合物。用水(25mL)、盐水(25mL)洗有机溶液，干燥(无水硫酸钠，12g)，减压下除去溶剂，得到650mg稠厚的油状物。该粗产物与5mL的叔丁基甲醚一同搅拌5分钟，加入庚烷(5mL)和水(0.1mL)，继续在20℃搅拌2小时。真空过滤收集固体，滤饼用1∶1的庚烷∶叔丁基甲醚溶液(6mL)和叔丁基甲醚(2mL)洗。真空干燥固体，得到300mg(52％)期望产物4(纯度98.43％，由HPLC/AUC纯化)，其为白色固体，熔点154-156.3℃(文献值155-156℃)。1H NMR(CDCl3)δppm 8.13(m，4H)，8.07(d，2H)，7.89(d，2H)，7.63(m，3H)，7.48(m，6H)，7.15(m，3H)，7.06(s，1H)，5.86(dd，1H)，4.79(m，1H)，4.70-4.52(d of an AB quartet，2H)，1.95，(s，3H)。13CNMR(CDCl3)8ppm 166.31，165.83，165.01，164.77，134.01，133.86，133.70，133.17，130.44，130.13，129.97，129.81，129.59，129.39，129.07，128.84，128.76，128.37，98.01，86.87，78.77，76.35，64.05，17.07。(C34H28O9计算值C，70.34；H，4.86。实测值C，70.20；H，4.95)。
实施例54-氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧基-5-苯甲酰氧基甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(化合物2，图4)在配备了回流冷凝器、悬挂式搅拌器和氩气入口转接器的12L圆底烧瓶中，将胞嘧啶(89g，0.80mol)悬浮于乙腈(900ml)中。在20℃的氩气氛围下搅拌混合物，加入一部分N，O-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(537ml，2.2mol)。所得溶液加热到80℃并在相同温度下搅拌1小时。1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(425.0g，0.73mol)被悬浮于乙腈(4000ml)中，并加入到反应混合物中。几分钟后，反应混合物变得清澈，温度降到ca.50℃。15分钟内加入氯化锡(IV)(154ml，1.31mol)，在80℃继续搅拌。1小时后，加入碳酸氢钠溶液使部分反应混合物结束反应，用乙酸乙酯萃取液层。用TLC(硅胶，20％乙酸乙酯的庚烷溶液，糖衍生物的Rf0.40)检测乙酸乙酯层。TLC分析表明糖衍生物完全消耗。使用10％甲醇的二氯甲烷溶液，由TLC检测到期望的产物(Rf0.37)。反应也由HPLC进行监控(方法#2)。反应混合物冷却到20℃，30分钟内加入饱和碳酸氢钠溶液(3000mL)结束反应(当加入最初的几毫升碳酸氢钠溶液时观察到放热)。分次加入固体碳酸氢钠(1350g)以避免发泡。检测混合物以确保其pH≥7。停止搅动，使各层分离20分钟。排除水层，与乙酸乙酯(1500ml)一同搅拌，使混合物分离(30分钟)。分离有机层，与乙腈溶液合并。有机溶液用盐水(500ml)洗，然后除去溶剂，体积达到ca.750ml。产物可用于随后的反应。也可进一步除去溶剂得到定量产率的白色沫状固体。化合物(2)的结构由1H NMR分析确认。
实施例64-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-lH-嘧啶-2-酮(化合物3)向化合物(2)(416g，0.73mol)的甲醇(2000ml)溶液中，加入甲醇钠(13.8g，0.26mol)。反应混合物在室温下搅拌，并由TLC(硅胶，10％甲醇的二氯甲烷溶液，化合物1的Rf0.53)以及(硅胶，30％甲醇的二氯甲烷溶液，化合物3的Rf0.21)监控。30分钟后，产物开始沉淀，TLC表明两小时后反应完成。反应也由HPLC进行监控(方法#2)。减压下除去甲醇至体积ca.500ml，再使用乙醇驱赶(2×500ml)，使体积达到ca.500ml。残余的稠厚浆液用750ml乙醇稀释，混合物在20℃搅拌1小时。过滤收集产物，滤饼用乙醇(100ml)和叔丁基甲醚(100ml)洗，干燥后得到168g(两步的产率为90％)产物(3)，纯＞97％(HPLC/AUC)。产物也经过了1H和13C NMR的分析。
实施例7N-[1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基-甲脒(化合物4)向化合物3(19g，0.0738mol)在无水N，N-二甲基甲酰胺(150ml)的悬浮液中，加入N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(98ml，0.7385mol)，在20-22℃搅拌混合物。一小时后，TLC(硅胶，30％甲醇的二氯甲烷溶液，化合物3的Rf是0.21，产物4的Rf是0.55)表明反应完成。减压下除去溶剂和试剂(保持温度在40℃以下)。向得到的油状残渣中加入乙醇(50ml)，减压下除去溶剂。该过程重复两次，粗产物得以固化。粗产物与190ml乙醇在20℃下一同搅拌1小时，在5℃保持12小时。过滤收集固体，滤饼用30ml的冷乙醇和30ml的冷叔丁基甲基醚洗。减压干燥固体，得到14.7g(64％)化合物(4)，作为第一产物。TLC(硅胶，30％甲醇的二氯甲烷溶液，产物(4)的Rf是0.55)以及(硅胶，10％甲醇的二氯甲烷溶液，产物(4)的Rf是0.1)只显示出化合物(4)的一个点。乙醇提纯后的母液被蒸发干燥，残渣与乙醇(80ml)在20℃下搅拌1小时，并在5℃保持12小时。过滤收集固体，滤饼用15ml的冷的乙醇和15ml的冷的叔丁基甲醚洗。真空干燥固体后，获得3.5g(15％)固体，作为第二产物。TLC(硅胶，30％甲醇的二氯甲烷溶液，产物(4)的Rf是0.55)以及(硅胶，10％甲醇的二氯甲烷溶液，产物(4)的Rf是0.1)只显示出化合物(4)的一个点；m.p.201-209℃；1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.62(s，1H，N＝CH)，8.17(d，1H，H-6，J5-6＝7.3Hz)，5.91(m，2H，H-1′，H-5)，5.16(t，1H，OH-5′，D2O可交换)，5.06(s，1H，OH-2′，D2O可交换)，3.8-3.5(m，4H，H-3′，H-4′，H-5′和H-5″)，3.15和3.02(2s，6H，N(CH3)2)，0.92(s，3H，CH3)；FAB＞0(GT)625(2M+H)+，313(M+H)+，167(B+2H)+；FAB＜0，(GT)m/z 419(M+T-H)-，403(M+G-H)-，311(M-H)-，165(B)-。
实施例8N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羟基-3-甲基-四氢呋喃-2-基]2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒(化合物5)化合物(4)(42.9g，0.137mol)通过悬挂式搅拌器搅拌30分钟而分散到无水二氯甲烷(200ml)中。然后，使用旋转蒸发器将混合物蒸发至干燥，在ca.30℃)。将该干燥的化合物(4)、咪唑(37.4g，0.55mol)和无水二氯甲烷(800ml)在氩气氛围下加入到2L的4-口圆底烧瓶中，叔丁基二苯基氯硅烷(43.1g，0.156mol，分为若干次加入)被转移到连接于反应烧瓶的附加通道中。反应混合物冷却到10℃，在20分钟内从附加通道加入叔丁基二苯基氯硅烷(13.74g，0.05mol)，边搅拌边维持反应温度在10～12℃。反应通过HPLC监控(方法#2)。1.5小时后，在20分钟内加入第二部分的叔丁基二苯基氯硅烷(14.76g，0.053mol)，边搅拌边维持反应温度在10～12℃。再过1小时候，在20分钟内加入剩余的叔丁基二苯基氯硅烷(14.8g，0.053mol)，边搅拌边维持反应温度在10～12℃。然后，在12-15℃再搅拌1.5小时。HPLC表明有95.40％的产物，3.00％的二-甲硅烷基衍生物以及未反应的原料。加入饱和碳酸氢钠溶液(150ml)结束反应，并在15℃搅拌15分钟(pH在8附近)。分离水层和二氯甲烷层。用水(2×150ml)和盐水(1×200ml)洗二氯甲烷层，用无水硫酸钠干燥(60.0g，30分钟)。然后，减压下过滤除去溶剂。残余的沫状固体用于下步的反应。
实施例92-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-5[-4(二甲基氨基-亚甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羟基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯(化合物6)25℃下氩气氛围中搅拌化合物(5)(58g，0.1053mol)的二氯甲烷(500ml)溶液。加入N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(29.7g，0.1367mol)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二酰亚胺氯化氢(26.2g，0.1367mol)和4-(二甲基氨基)吡啶(1.3g，0.0106mol)，25℃下搅拌反应混合物，通过HPLC监控(方法#2)。4小时后，HPLC表明含7.9％的起始原料。加入N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸(4.57g，0.0210mol)和1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二酰亚胺氯化氢(4.03g，0.0210mol)，持续在25℃再搅拌2小时。然后，经HPLC检测到0.7％的起始原料。向反应混合物中加入甲醇(60ml)，减压蒸发除去溶剂(温度保持在40℃以下)，得到化合物(6)，为稠厚的油。该材料(93％纯度，HPLC/AUC)被用于下步的反应。
实施例10叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H 嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯(化合物7)将化合物(6)(0.3mol)、MeOH(1650ml)和EtOAc(265g，3.0mol)加入到3L的5-口圆底烧瓶中，搅拌混合物使化合物(6)溶解。加入氟化胺(45.0g，1.21mol)，回流下使温度达到64.5℃，搅拌4小时。HPLC(方法#2)表明反应在4小时后完成。然后，减压下于40-45℃除去溶剂，并用EtOAc(300ml)驱赶。残余泡沫与EtOAc(400ml)、水(600ml)和叔丁基甲醚(300ml)合并，室温下粉碎混合物2.5小时。过滤收集分离的白色固体，用水(200ml)、1∶1的EtOAc/叔丁基甲醚(120ml)和叔丁基甲醚(120ml)洗。然后，真空干燥固体超过20小时，得到化合物(7)，为白色固体。产率为71.54g，三步为52％。化合物(7)的纯度是99.08％(HPLC，方法#3)。1H NMR(DMSO-d6)δppm 7.99(d，1H，H-6，J6-5＝7.42Hz)，7.3-7.1(m，3H，CH和NH2，D2O可交换)，5.9(s，1H，H-1′)，5.75(d，1H，H-5，J6-5＝7.43Hz)，5.43(s，1H，OH-2′，D2O可交换)，5.24(t，1H，OH-5′)，5.04(d，1H，H-3′，J3′-4′＝9.1Hz)，4.1-4.0(m，2H，H-4′，CH)，3.8-3.4(2m，2H，H-5′，H-5″)，2.2-2.0(m，1H，CB)，1.40(s，9H，(CH3)3C)，1.0(s，3H，CH3)，0.9-0.8(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＜0，(GT)m/e 911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocValOH)-，110(B)-；FAB＞0(GT)913(2M+H)+，457(M+H)+，112(B+2H)+，57(CH3)3C)+；FAB＜0(GT)911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocVal)-，110(B)-。
实施例112-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯(二盐酸盐)(化合物8)在配备了悬挂式搅拌器、温度探头、氩气通道和氯化氢鼓泡器的圆底烧瓶中，搅拌化合物(7)(21.0g，0.046mol)的乙醇(168ml)溶液。向澄清的溶液中鼓入氯化氢气体(22g)1小时。用冰水浴使反应温度保持在30℃以下。通入氯化氢气体后几分钟开始有固体形成。4小时后，HPLC(方法#3)表明只有0.8％的起始原料。过滤收集固体，滤饼用乙醇(20ml)和二乙醚(100ml)洗。减压干燥产物16小时后，得到19.06g(96.5％)产物(8)，纯度为97.26％(HPLC，方法#3)；m.p.210℃(变为褐色)，248-250℃(熔融)；1H NMR(DMSO-d6)δppm 10.0(s，1H，1/2NH2，D2O可交换)，8.9-8.6(2 br s，4H，1/2NH2，NH3，D2O可交换)，8.42(d，1H，H-6，J5-6＝7.9Hz)，6.24(d，1H，H-5，J5-6＝7.9Hz)，5.84(s，1H，H-1′)，5.12(d，1H，H-3′，J3′-4′＝8.8Hz)，4.22(d，1H，H-4，J3′-4′＝8.7Hz)，4.0-3.9(m，1H，CH)，3.8-3.5(m，2H，H-5′，H-5″)，2.3-2.1(m，1H，CH)，1.16(s，3H，CH3)，1.0(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＞0(GT)713(2M+H)+，449(M+G+H)+，357(M+H)+，246(S)+，112(B+2H)+；FAB＜0(GT)747(2M+Cl)-，483(M+G+Cl)-，391(M+Cl)-，355(M-H)-，116(Val)-，110(B)-，35(Cl)-。
实施例12HPLC测试方法上述所有的方法均使用反向色谱柱；Waters部分编号#WAT086344；Nova-PakC18，60′孔大小，4μm颗粒大小，3.9×150mm。所有的色谱均使用Waters2695 HPLC和996 PDA监测器获得。
流动相HPLC级乙腈和水从JT Baker购得，1M的醋酸三乙胺溶液从Fluka购得。
方法#1用于测试化合物4，图4流速1.00ml/min。乙腈/水的线性梯度如下。
每次测试前系统都平衡5分钟。
波长254nm。
化合物4的保留时间＝12.8分钟。

方法#2用于测试化合物2、4、5、6和7，图4流速1.00ml/min。乙腈/20mM醋酸三乙胺缓冲液的线性梯度如下。
每次测试前系统都平衡5分钟。
波长320和272nm。

对比表化合物与保留时间，方法#2


方法#3用于测试化合物3、7和8，图4流速1.00ml/min。乙腈/20mM醋酸三乙胺缓冲液的线性梯度如下。
每次测试前系统都平衡5分钟。
波长272nm。

对比表化合物与保留时间，方法#3

现有技术方法实施例13N4-[(二甲基氨基)亚甲基]-β-D 2′-C-甲基-胞苷(4)的制备用N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(8.2ml，61.73mmol)处理β-D-2′-C-甲基-胞苷(3)(1.65g，6.43mmol)在DMF(32ml)中的溶液，室温下搅拌约1.5小时。溶液在减压下与乙醇共蒸发。从乙醇/乙醚中结晶，产生迄今未知的化合物(4)(第一产物，1.21g，60％产率，第二产物，轻微不纯，0.46g，23％产率)，为结晶状。
以下的物理-化学特性是由第一产物的结晶体获得。F＝201-209℃；1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.62(s，1H，N＝CH)，8.17(d，1H，H-6，J5-6＝7.3Hz)，5.91(m，2H，H-1′，H-5)，5.16(t，1H，OH-5′，D2O可交换)，5.06(s，1H，OH-2′，D2O可交换)，3.8-3.5(m，4H，H-3′，H-4′，H-5′和H-5″)，3.15和3.02(2s，6H，N(CH3)2)，0.92(s，3H，CH3)；FAB＞0(GT)625(2M+H)+，313(M+H)+，167(B+2H)+；FAB＜0，(GT)m/z419(M+T-H)-，403(M+G-H)-，311(M-H)-，165(B)-；室温下进行HPLC 5.96分钟(从0到50％的CH3N在20mM醋酸三乙胺中的缓冲液，程序为30分钟，流速为1ml/min)，λmax＝316.1nm。
实施例14N4-[(二甲基氨基)亚甲基]-5′-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-β-D 2′-C-甲基-胞苷(5)的制备向化合物(4)(1.167g，3.73mmol)在干吡啶(15ml)的溶液中，持续加入咪唑(760mg，11.19mmol)和叔丁基二苯基氯硅烷(0.66ml，2.53mmol)。室温下搅拌溶液。4小时后，反应混合物中补入叔丁基二苯基氯硅烷(0.40ml，2.28mmol)并在室温下搅拌2小时。接着用碳酸氢钠萃取，水洗有基层，硫酸钠干燥，减压下蒸发。将粗混合物与干乙腈(30ml)和干二甲基甲酰胺(15ml)混合。
实施例15N4-[(二甲基氨基)亚甲基]-5′-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-β-D 2′-C-甲基-胞苷的3′-O-L-N-(叔丁氧羰基)缬氨酸酯(6)的制备向前步得到的化合物(5)中持续加入N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酸(Boc-Val-OH，400mg，1.87mmol)，N′-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二酰亚胺氯化氢(DEC，715mg，3.73mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP，68mg，0.56mmol)，室温下搅拌所得混合物。反应过程由HPLC监视。反应混合物中补入3次Boc-Val-OH(400mg×3)，DEC(715mg×3)和DMAP(68mg×3)，最后再补入一次Boc-Val-OH(200mg)，DEC(357mg)和DMAP(34mg)。两天后，起始物质全部消耗，减压下除去DMF。残余物化合物(6)加入到干乙醇(70ml)中。
实施例16β-D-2′-C-甲基-胞苷(7)的3′-O-L-N-(叔丁氧羰基)缬氨酸酯(6)的制备向含残余物化合物(6)的干乙醇(70ml)中加入氟化胺(1.38g，37.30mmol)，回流混合物3小时。过滤混合物并减压除去溶剂。将残余物加入乙酸乙酯并用水萃取几次。真空蒸发有机相，在硅胶色谱柱上纯化(洗提液MeOH(20％)EtOAc(80％))。分离出期望的化合物(7)(1.37g，3步的产率为78％)，为白色泡沫。
物理-化学数据包括1H NMR(DMSO-d6)δppm 7.99(d，1H，H-6，J6-5＝7.42Hz)，7.3-7.1(m，3H，CH和NH2，D2O可交换)，5.9(s，1H，H-1′)，5.75(d，1H，H-5，J6-5＝7.43Hz)，5.43(s，1H，OH-2′，D2O可交换)，5.24(t，1H，OH-5′)，5.04(d，1H，H-3′，J3′-4′＝9.1Hz)，4.1-4.0(m，2H，H-4′，CH)，3.8-3.4(2m，2H，H-5′，H-5″)，2.2-2.0(m，1H，CH)，1.40(s，9H，(CH3)3C)，1.0(s，3H，CH3)，0.9-0.8(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＜0，(GT)m/e 911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocValOH)-，110(B-；FAB＞0(GT)913(2M+H)+，457(M+H)+，112(B+2H)+，57(CH3)3C)+；FAB＜0(GT)911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocValOH)-，110(B)-。
实施例17β-D 2′-C-甲基-胞苷(二盐酸盐，(8)的3′-O-L-缬氨酸酯的制备用20％HCl/乙酸乙酯溶液(75ml)处理化合物(7)(1.32g，2.9mmol)在干乙酸乙酯(75ml)中的溶液。室温下搅拌反应混合物2小时。标题化合物(8)从反应混合物中沉淀出，过滤并用Et2O(1.01g，81％产率)洗。物理-化学数据包括F＝210℃(发褐)，234-241℃(熔融)；1H NMR(DMSO-d6)δppm 10.0(s，1H，1/2NH2，D2O可交换)，8.9-8.6(2 br s，4H，1/2NH2，NH3，D2O可交换)，8.42(d，1H，H-6，J5-6＝7.9Hz)，6.24(d，1H，H-5，J5-6＝7.9Hz)，5.84(s，1H，H-1′)，5.12(d，1H，H-3′，J3′-4′＝8.8Hz)，4.22(d，1H，H-4，J3′-4′＝8.7Hz)，4.0-3.9(m，1H，CH)，3.8-3.5(m，2H，H-5′，H-5″)，2.3-2.1(m，1H，CH)，1.16(s，3H，CH3)，1.0(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＞0(GT)713(2M+H)+，449(M+G+H)+，357(M+H)+，246(S)+，112(B+2H)+；FAB＜0(GT)747(2M+Cl)-，483(M+G+Gl)-，391(M+Cl)-，355(M-H)-，116(Val)-，110(B)-，35(Cl)-；HPLC rt＝7.26min(从0到50％的CH3N在20mM醋酸三乙胺中的缓冲液，程序为30分钟，流速为1ml/min)，λmax＝273.5nm；UV(H2O)λmax＝271nm(ε7500)，λmin＝249nm(ε5200)，λs＝234nm(ε6200)。
实施例18β-D-2′-C-甲基-胞苷的合成(图6)制备β-D-2′-C-甲基-胞苷的另一合成路线见图3。在该方法中，加热尿嘧啶(2.1eq.)和BSA(1.1mL/mmol)在乙腈(7mL/mmol)中的混合物至回流约30分钟。所得溶液用1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(1)的乙腈(7mL/mmol)溶液以及SnCl4(3.5eq.)的溶液处理。所得溶液加热至回流约4小时。反应物的深色混合物用乙酸乙酯(2.5甲苯体积)稀释，并用与乙酸乙酯等体积的冷NaHCO3饱和溶液在室温下处理。通过寅式盐(celite)过滤全部的混合物，用乙酸乙酯洗固体材料。从滤液分离出有机层，用水及盐水洗，用Na2SO4干燥，减压下蒸发。通过使用50％乙酸乙酯的己烷溶液的硅胶柱色谱得到产率为65％的化合物(9)，β-D-2′-，3′-，5′-苯甲酰-2′-C-甲基-尿苷，为白色固体。
通过使(9)溶解在以MeONa(3.3eq.)处理的甲醇(12.5ml/mmol)中并在室温下搅拌所得黄色溶液约4.5小时，将苯甲酰保护基从β-D-2′-，3′-，5′-苯甲酰-2′-C-甲基-尿苷(9)上除去。加入预先用甲醇洗过的Dowex H+50wX4使溶液中和。过滤混合物，用热的甲醇萃取树脂几次。合并滤液并在减压下蒸发。残渣加入水中，用二氯甲烷洗3次。水层减压下蒸发。从水中结晶生成(10)，β-D-2′-C-甲基-尿苷，产率87％。
然后，由β-D-2′-C-甲基-尿苷(10)、1-甲基吡咯烷(1ml/mmol)、氯代三甲基硅烷的(3eq.)的乙腈(10ml/mmol)溶液组成的溶液在室温下搅拌约3.5小时。将溶液冷却到0℃，用三氟乙酸酐(3eq.)处理，在相同温度下搅拌30分钟。加入4-硝基苯酚(3eq.)，搅拌溶液约3小时。向溶液中加入水结束反应，减压下蒸发溶剂。将残渣加入二氯甲烷，用饱和NaHCO3溶液和水洗。减压下蒸发有机层。将粗残渣加入二噁烷(25ml/mmol)，并用28％NH4OH(5ml/mmol)水溶液处理。溶液加热到50℃过夜。然后，减压蒸发溶剂，使用梯度甲醇(5-20％，在二氯甲烷中)的色谱分离。产生了β-D-2′-C-甲基-胞苷(11)作为期望的产物，产率75％。产物进一步在EtOH中结晶。
实施例5和6中的试剂来源包括N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛，购自Fluka，编号No.40271；N，N-二甲基甲酰胺，过分子筛，购自Fluka，编号No.40248；纯乙醇，购自Carlo Erba ACS，分析用，编号No.414607；二乙醚购自Merck，编号No.1.00921.5000；叔丁基二苯基氯硅烷，购自Avocado，编号No.12721；咪唑，购自Fluka，编号No.56750；吡啶，过分子筛，购自Fluka，编号82704；碳酸氢钠，购自Fluka，编号No.71628；无水硫酸钠，购自Fluka，编号No.71960；乙腈，过分子筛，购自Fluka，编号No.00695；N，N-二甲基甲酰胺，过分子筛，购自Fluka，编号No.40248；N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨，购自Aldrich，编号No.35,972-6；4-二甲基氨基吡啶，购自Aldrich，编号No.10,770-0；N′-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二酰亚胺氯化氢，购自Aldrich，编号No.16,146-2；氟化胺，购自Fluka，编号No.09742；经钠蒸馏的甲醇；经过五氧化二磷无水氯化氢蒸馏的乙酸乙酯，购自Praxair，编号No.1741100；以及二乙醚，购自Merok，编号No.1.00921.5000。
以上仅是对本发明进行了示例性说明，并不限于公开的方法和反应条件。对于本领域技术人员而言显而易见到各种变化均包括在本发明权利要求所定义的范围和精神之内。
权利要求
1.制备3′-O-氨基酸酯核苷的方法，包括以下步骤(a)使任选保护的、任选取代的呋喃核糖与未保护的核苷碱基和甲硅烷化试剂在路易斯酸存在下偶联，形成任选保护的核苷；(b)如需要，任选使步骤(a)中的保护的核苷与脱保护试剂反应，提供未保护的核苷；(c)如果核苷有胺基，任选使保护的或未保护的核苷的胺基与胺保护试剂反应；(d)任选使保护的或未保护的核苷与甲硅烷化试剂反应，得到5′-O-甲硅烷基保护的核苷；(e)任选使保护的或未保护的核苷与保护的氨基酸衍生物在一种或多种偶联剂下反应，形成保护的3′-O-氨基酸酯；(f)如果需要，任选使步骤(e)中的产物与从5′-C除去甲硅烷基保护基和从核苷胺除去甲脒保护基的试剂反应；和(g)任选使步骤(f)中的产物与从3′-O-氨基酸酯除去保护基的试剂反应，产生取代的或未取代的3′-O-酯-取代的核苷。
2.权利要求1的方法，其中，步骤(a)中的任选保护的呋喃核糖在2′-C位包含甲基。
3.权利要求1的方法，其中，步骤(a)中的路易斯酸选自由SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl4、FeCl3和SnCl2组成的组。
4.权利要求3的方法，其中，路易斯酸是SnCl4。
5.权利要求1的方法，其中，步骤(a)中的甲硅烷化试剂选自由BSA、HMDS、TMSC1和TBDPSC1组成的组。
6.权利要求5的方法，其中，甲硅烷化试剂是BSA。
7.权利要求1的方法，其中，步骤(a)中的偶联反应在乙腈溶剂中进行。
8.权利要求1的方法，其中，步骤(b)中的脱保护试剂是NaOMe或NH3。
9.权利要求1的方法，其中，步骤(c)中的胺保护试剂选自由N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛和N-1，1-二甲基硫代亚甲基胺组成的组。
10.权利要求9的方法，其中，胺保护试剂是N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛。
11.权利要求1的方法，其中，步骤(d)中的甲硅烷化试剂选自由TBDPSC1、TMSC1、和TBDMSC1组成的组。
12.权利要求11的方法，其中，甲硅烷化试剂是TBDPSC1。
13.权利要求1的方法，其中，步骤(e)的氨基酸衍生物是缬氨酸衍生物。
14.权利要求1的方法，其中，步骤(e)的氨基酸保护基选自BOC、-(C＝O)-芳烷基、-(C＝O)-烷基或-(C＝O)-芳基。
15.权利要求14的方法，其中，氨基酸保护基是BOC。
16.权利要求1的方法，其中，步骤(e)中的偶联剂之一是EDC。
17.权利要求1的方法，其中，步骤(f)中的甲硅烷基-除去试剂是NH4F。
18.权利要求1的方法，其中，步骤(g)中的3′-O-氨基酸酯保护基除去试剂是HCl。
19.制备核苷的方法，包括以下步骤(a)使1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖与胞嘧啶在BSA和SnCl4存在下偶联，形成4-氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧基甲基-5-苯甲酰氧基甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮；(b)使由步骤(a)中得到4-氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧基甲基-5-苯甲酰氧基甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮与甲醇钠反应，除去苯甲酰保护基，得到4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮；(c)使由步骤(b)中得到的4-氨基-1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮与N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛反应，保护N4-氨基，产生N-[1-(3，4-二羟基-5-羟甲基-3-甲基-四氢呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲脒；(d)使由步骤b)或c)中得到的核苷与甲硅烷化试剂TBDPSC1反应，得到N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羟基-3-甲基-四氢呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基甲脒；(e)使N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羟基-3-甲基-四氢呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氢-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒与N-BOC-L-缬氨酸和EDC在二氯甲烷中反应，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亚甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羟基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯；(f)通过回流化合物与NH4F，除去步骤(e)中的2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亚甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羟基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯的甲硅烷基保护基和甲脒基；形成2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯，以及(g)通过使步骤(f)中的2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯与HCl反应，从3′-O-缬氨酸酯取代基上除去BOC-保护基，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羟基-2-羟甲基-4-甲基-四氢呋喃-3-基酯(二盐酸盐)。
20.制备呋喃糖的方法，包括以下步骤(a)使CaO溶液与环醚反应，该环醚在与环上氧原子邻接的碳上具有羟基和CH2OH，从而形成呋喃基内酯；(b)如果需要，用保护基任选保护呋喃基内酯；(c)使任选保护的呋喃基内酯与还原剂反应，将内酯还原为羟基，产生呋喃糖产物化合物；以及(d)任选使呋喃糖产物化合物与保护基反应。
21.权利要求20的方法，其中，与CaO反应的环醚是D-果糖。
22.权利要求20的方法，其中，呋喃基内酯是2-C-甲基-D-核糖酸-内酯。
23.权利要求20的方法，其中，保护的呋喃基内酯是2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-内酯。
24.权利要求20的方法，其中，呋喃糖是2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
25.权利要求20的方法，其中，保护的呋喃糖是1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
26.权利要求20的方法，其中，保护基选自由甲硅烷基、苯甲酰基、p-甲苯酰基、p-硝基苯甲酰基、p-氯苯甲酰基、酰基、乙酰基、-(C＝O)-烷基和-(C＝O)-芳基组成的组，任选被一个或多个不受步骤(c)中还原剂影响的基团取代。
27.权利要求26的方法，其中，保护基是苯甲酰基。
28.权利要求26的方法，其中，保护基是-(C＝O)-烷基。
29.权利要求20的方法，其中，还原剂选自由Red-Al/乙醇、NaHTe、SmI2、H2+Pd-磷化氢催化剂和LiAI(OtBu)3H组成的组。
30.权利要求29的方法，其中，还原剂是Red-Al/乙醇。
31.权利要求20的方法，其中，反应在溶剂中进行，该溶剂选自由TEA、DMAP、DME、甲苯和乙醇组成的组。
32.权利要求20的方法，其中，对于第一产物化合物内酯，反应温度在约-5℃到约50℃间变动。
33.权利要求20的方法，其中，总的合成时间是从约5天到约14天。
34.权利要求33的方法，其中，总的合成时间是从约5天到约10天。
35.权利要求33的方法，其中，总的合成时间是约60小时。
36.一方法，包括以下步骤(a)使CaO溶液与D-果糖在温度约23℃到约40℃下反应约5小时到约25小时；(b)使步骤(a)中的产物与CO2和草酸反应约8小时到约12小时，形成2-C-甲基-D-核糖酸内酯；(c)使2-C-甲基-D-核糖酸内酯与苯甲酰氯反应约3小时到约6小时，得到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸内酯；(d)在约5℃到约0℃下，用Red-Al/乙醇还原2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸内酯约30到约60分钟，得到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖；(e)在约0℃到约50℃下，在溶剂中苯甲酰化2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖约4小时到约14小时，形成1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖；以及(f)任选分离1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
37.权利要求36的方法，其中，步骤(a)中的反应时间是从约6到约22小时。
38.权利要求36的方法，其中，步骤(a)中的反应温度是从约23到约40℃。
39.权利要求36的方法，其中，步骤(c)中的溶剂是DME。
40.权利要求36的方法，其中，步骤(c)中的反应进行约4小时。
41.权利要求36的方法，其中，步骤(d)中的还原进行约40分钟。
42.权利要求36的方法，其中，步骤(d)中的溶剂包括甲苯。
43.权利要求36的方法，其中，步骤(e)中的溶剂包括DME。
44.权利要求36的方法，其中，步骤(e)中的温度是从约5到约50℃，反应进行约4到约12小时。
45.权利要求36的方法，其中，步骤(f)中的分离是通过现有技术中已知的方法进行。
46.权利要求1的方法，其中，苯甲酰保护的、任选取代的呋喃核糖是通过权利要求20的方法制备的。
47.权利要求1的方法，其中，苯甲酰保护的、任选取代的呋喃核糖是通过权利要求36的方法制备的。
48.制备呋喃基内酯的方法，包括(a)使CaO溶液与环醚反应，该环醚在与环上氧原子邻接的碳上具有羟基和CH2OH，形成呋喃基内酯。
49.制备2-C-甲基-D-核糖酸内酯的方法，包括以下步骤(a)在温度为约23℃到约40℃下，使CaO溶液与D-果糖反应约5小时到约25小时；(b)使步骤(a)的产物与CO2和草酸反应约8小时到约12小时，形成2-C-甲基-D-核糖酸内酯。
50.制备任选保护的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖化合物的方法，包括(a)用Red-Al/乙醇还原任选保护的2-C-甲基-D-核糖酸内酯，得到任选保护的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
51.制备任选保护的核苷的方法，包括(a)使任选保护的、任选取代的呋喃核糖与未保护的核苷碱基和甲硅烷化试剂在路易斯酸存在下偶联，形成任选保护的核苷。
52.制备任选保护的β-D-2′-C-甲基-胞苷的方法，包括以下步骤(a)使任选保护的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖与胞嘧啶在BSA和SnCl4存在下偶联，形成任选保护的β-D-2′-C-甲基-胞苷。
53.制备2′-C-甲基-胞苷的方法，包括以下步骤(a)使胞嘧啶与活化剂、任选在路易斯酸存在下与任选保护的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖反应，形成任选保护的2′-C-甲基-胞苷 其中，各P1、P2、P3和P4独立地为氢或适当的氧保护基；然后，(b)如需要，任选脱去前步反应中的的任选保护的2′-C-甲基-胞苷的保护，形成2′-C-甲基-胞苷(VI)。
54.权利要求53的方法，其中，各P1、P2、P3和P4独立地为氢或酰基。
55.权利要求53的方法，其中，各P1、P2、P3和P4独立地为氢或苯甲酰基。
56.权利要求53的方法，其中，活化剂是甲硅烷化试剂。
57.权利要求56的方法，其中，甲硅烷化试剂是BSA、HMDS、TMSC1或TBDPSC1。
58.权利要求56的方法，其中，甲硅烷化试剂是BSA。
59.权利要求53的方法，其中，反应步骤(a)在路易斯酸下完成，路易斯酸选自由SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl2、TiCl4、FeCl3和SnCl2组成的组，或它们的任意混合物。
60.权利要求53的方法，其中，路易斯酸是SnCl4。
61.权利要求53的方法，其中，该方法进一步包括用酯部分对2′-C-甲基-胞苷的3′-位进行酯化的步骤。
62.权利要求61的方法，其中，酯部分为氨基酸。
63.权利要求62的方法，其中，氨基酸是L-缬氨酸。
64.制备任选保护的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖的方法，包括以下步骤(a)使任选保护的2-C-甲基-D-核糖酸内酯与还原剂反应 其中，各P1、P2和P3独立地为氢或适当的氧保护基；然后，(b)选择性地保护前步反应中的呋喃核糖衍生化合物，形成任选保护的-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4独立地为氢或适当的氧保护基。
65.权利要求64的方法，其中，各P1、P2、P3和P4独立地为氢或酰基。
66.权利要求64的方法，其中，各P1、P2、P3和P4独立地为氢或苯甲酰基。
67.权利要求64的方法，其中，还原剂是二(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠(Red-Al)，任选在溶剂中。
68.权利要求67的方法，其中，溶剂是乙醇。
69.制备任选保护的2-C-甲基-D-核糖酸内酯的方法，包括以下步骤(a)使D-果糖与CaO反应； 然后，(b)任选保护内酯，形成任选保护的2-C-甲基-D-核糖酸内酯 其中，各P1、P2和P3独立地为氢或适当的氧保护基。
70.权利要求69的方法，其中，各P1、P2和P3独立地为氢或酰基。
71.权利要求69的方法，其中，各P1、P2和P3独立地为氢或苯甲酰基。
72.权利要求69的方法，其中，利用沉淀剂来除去在步骤(a)中产生的钙。
73.权利要求72的方法，其中，沉淀剂是比核糖酸强的有机酸。
74.权利要求73的方法，其中，有机酸选自由草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸、马来酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、丁酸、戊酸己酸或己酸组成的组。
75.权利要求73的方法，其中，有机酸是草酸。
76.从D-果糖制备任选保护的2′-C-甲基-D-胞苷的方法，包括以下步骤(a)使D-果糖与CaO反应得到2-C-甲基-D-核糖酸-γ-内酯； (b)如果需要，任选保护内酯，形成任选保护的2-C-甲基-D-核糖酸内酯； 其中，各P1、P2和P3独立地为氢或适当的氧保护基；(c)使任选保护的2-C-甲基-D-核糖酸内酯与还原剂反应， 其中，各P1、P2和P3独立地为氢或适当的氧保护基；(d)如果需要，任选保护前步反应中的呋喃核糖衍生化合物，形成任选保护的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4独立地为氢或适当的氧保护基；(e)使任选保护的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖与胞嘧啶和活化剂任选在路易斯酸存在下反应，形成任选保护的2′-C-甲基胞苷 其中，各P1、P2、P3和P4独立地为氢或适当的氧保护基；然后，(f)如果需要，任选脱去任选保护的2′-C-甲基胞苷的保护，形成任选保护的2′-C-甲基胞苷
77.权利要求76的方法，其中，各P1、P2、P3和P4独立地为氢或酰基。
78.权利要求76的方法，其中，各P1、P2、P3和P4独立地为氢或苯甲酰基。
79.权利要求76的方法，其中，活化剂是甲硅烷化试剂。
80.权利要求79的方法，其中，甲硅烷化试剂是BSA、HMDS、TMSC1或TBDPSC1。
81.权利要求79的方法，其中，甲硅烷化试剂是BSA。
82.权利要求76的方法，其中，反应步骤(e)在路易斯酸下完成，路易斯酸选自由SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl2、TiCl4、FeCl3和SnCl2组成的组，或它们的任意混合物。
83.权利要求82的方法，其中，路易斯酸是SnCl4。
84.权利要求76的方法，其中，还原剂是二(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠(Red-Al)，任选在溶剂中。
85.权利要求84的方法，其中，溶剂是乙醇。
86.权利要求76的方法，其中，该方法进一步包括用酯部分对2′-C-甲基-胞苷的3′-位进行酯化的步骤。
87.权利要求86的方法，其中，酯部分为氨基酸。
88.权利要求87的方法，其中，氨基酸L-缬氨酸。
全文摘要
本发明提供制备β－D和β－L 2’－C－甲基－核苷和2’－C－甲基－3’－O－酯核苷的改进方法。
文档编号C07H19/00GK1744903SQ200380109576
公开日2006年3月8日 申请日期2003年12月12日 优先权日2002年12月12日
发明者理查德·斯托勒, 阿德尔·穆萨, 纳拉扬·乔杜里, 弗兰克·瓦利戈拉 申请人:埃迪尼克斯(开曼)有限公司