专利名称：从慢性淋巴细胞性白血病细胞衍生的多肽和抗体及其应用的制作方法
技术领域：
公开了从慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞衍生的细胞系及其 在CLL和其它疾病的研究和治疗中的应用。具体来说，本公开涉及了 一株被命名为"CLL-AAT"的CLL细胞系，该细胞系按照布达佩斯 公约的条款于2001年11月28日保藏于美国典型培养保藏中心 (Manassas, Virginia, USA) ， ATCC登记号为PTA-3920。
背景技术：
慢性淋巴细胞性白血病(CLL)是一种白细胞疾病，在西半球是 最常见的白血病形式。CLL代表了一组不同形式的与恶性淋巴细胞的 生长相关的疾病，这些淋巴细胞生长缓慢，但是生命期跨度延长。CLL 被分成不同的类型，包括例如典型的和混合型的B细胞慢性淋巴细胞 性白血病(B-CLL) 、 B细胞和T细胞前淋巴细胞性白血病、毛细胞 白血病和大的粒状淋巴细胞性白血病。
在所有的不同类型的CLL中，B-CLL占了所有白血病的大约 30%。尽管它在年龄在50岁以上的个体中发生得更频繁，但在较年轻 的人群中也越来越多地看见。B-CLL的特征表现为形态学上正常但生
物学上不成熟从而失去功能的B淋巴细胞的积累。淋巴细胞的正常功 能是与感染斗争。但是，在B-CLL中，淋巴细胞在血液和骨髓中积累， 导致淋巴结肿胀。正常骨髓和血细胞的生产减少，病人通常经历严重 的贫血以及低血小板计数。这可能引起危及生命的出血，以及由于白 细胞数量的减少而发展成严重的感染。
为了进一步了解象白血病这样的疾病，重要的是要具有能够用做 工具研究它们的病因学、发病机理和生物学的适当的细胞系。恶性人 B淋巴细胞类的细胞系的例子包括前B急性成淋巴细胞性白血病 (Reh)、扩散性大细胞白血病(WUS-DLCL2)和Waldenstrom巨球 蛋白血症(WUS-WM)。不幸的是，大多数现有的细胞系不能代表临 床上最常见的白血病和淋巴瘤的类型。
使用Epstein Barr病毒(EBV)在体外感染获得了一些CLL衍生 细胞系、特别是B-CLL细胞系，它们是具有代表性的恶性细胞。这些 细胞系的表现型与体内肿瘤的表现型不同，B-CLL株的特征反而倾向 于与成淋巴细胞类的细胞系的特征相似。通过EBV感染的帮助使B-CLL细胞永生的尝试很少获得成功。其原因尚不清楚，但是已知这不 是由于缺少EBV受体的表达、结合或摄取。Wells等发现B-CLL细胞 停止在细胞周期的Gl/S期，并且与转化相关的EBV DNA没有表达。 这表明EBV与B-CLL细胞的相互作用与它和正常B细胞的相互作用 不同。EBV转化的CLL细胞系更多表现为分化，具有与用EBV永生 的成淋巴细胞类的细胞系(LCL)更相似的形态。
以前已经建立了一株EBV阴性的CLL细胞系WSU-CLL (Mohammad等，(1996) Leukemia 10(1): 130-7)。但是还不知道有 其它这样的细胞系存在。
在身体对疾病状态包括癌症和CLL的反应中有多种不同的机制 发挥作用。例如，CD4+辅助性T细胞通过为效应细胞提供刺激因子，
在针对各种恶性肿瘤的有效的免疫反应中发挥重要作用。细胞毒性T
细胞据信是消除癌细胞最有效的细胞，辅助性T细胞通过分泌Thl细 胞因子例如IL-2和IFN-Y来引发细胞毒性T细胞。在各种恶性肿瘤中， 已经显示出辅助性T细胞的表现型与正常个体中发现的细胞相比有变 化。 一个显著改变的特征是Thl细胞因子的产生减少，转变成产生Th2 细胞因子。(参见例如Kiani等，Haematologica 88:754-761 (2003); Maggio等，Ann Oncol 13 Suppl 1:52-56 (2002); Ito等，Cancer 85:2359-2367 (1999); Podhorecka等，Leuk Res 26:657-660 (2002); Tatsumi等，J Exp Med 196:619-628 (2002); Agarwal等，Immunol Invest 32:17-30 (2003); Smyth等，Ann Surg Oncol 10:455-462 (2003); Contasta 等，Cancer Biother Radiopharm 18:549-557 (2003); Lauerova等， Neoplasma 49:159-166 (2002)。)已经证实将这种细胞因子的转变逆转 向Thl的情况增加了 T细胞的抗肿瘤效应(参见Winter等，Immunology 108:409-419 (2003); Inagawa等，Anticancer Res 18:3957-3964 (1998))。
肿瘤细胞驱使辅助性T细胞的细胞因子的表达从Thl变为Th2 的能力之下的机制包括细胞因子例如IL-10或TGF-(3的分泌以及与免 疫系统的细胞相互作用的表面分子的表达。OX-2/CD200为一种在树 突状细胞表面表达的与免疫球蛋白基因家族的分子具有高度同源性的 分子，已经牵涉于免疫抑制中(Gorczynski等，Transplantation 65:1106-1114 (1998))，表明表达OX-2/CD200的细胞能够抑制对Thl 细胞因子生产的刺激的证据已经提供。Gorczynski等在小鼠模型中证 实了在使用白血病肿瘤细胞的动物模型中OX-2/CD200 Fc的灌注抑制 了肿瘤细胞的排斥(Clin Exp Immunol 126:220-229 (2001))。
对治疗患有癌症或CLL的病人的方法进行改进是合乎需要的， 特别是改进它们增强T细胞活性的程度。
发明简述
在一个实施方案中，提供了不是通过用EBV永生化而建立的恶
性来源的CLL细胞系。该细胞系从初级CLL细胞衍生而来，保藏于 ATCC，登记号PTA-3920。在优选实施方案中，细胞系是CLL-AAT。 CLL-AAT是从B-CLL初级细胞衍生的B-CLL细胞系。
另一方面，CLL-AAT细胞系被用来产生单克隆抗体，用于CLL 的诊断和/或治疗。抗体的产生可以通过使用本发明的细胞作为免疫 原，在动物中引发免疫反应，再从中分离单克隆抗体。这些抗体的序 列可以被测定，抗体及其变异体可以通过重组技术生产。在这一方面 来说，"变异体"包括基于单克隆抗体序列的嵌合的、CDR-移植的、 人源化的和完全的人类抗体。
此外，可以使用本发明的细胞或从中衍生的多肽作为饵在靶特异 性的基础上分离抗体，从而筛选从重组文库衍生的抗体("噬菌体抗 体")。
另一方面，抗体的产生可以通过使用初级CLL细胞或从其衍生 的抗原来淘洗抗体文库，然后使用一株CLL细胞系例如本发明描述的 CLL细胞系进一步筛选和/或表征。因此，提供了用于表征特异于CLL 的抗体的方法，其中包括评估抗体与CLL细胞系的结合。
另一方面，提供了鉴定在CLL细胞中独特表达的蛋白的方法， 这利用了 CLL-AAT细胞系，使用本领域的专业技术人员熟知的方法， 例如免疫沉淀然后质谱分析。这些蛋白可以独特表达在CLL-AAT细 胞系中，或独特表达在来自CLL病人的初级细胞中。
可以使用CLL-AAT细胞系在基于细胞的分析中筛选小分子文库 (许多可以购买到)，以鉴定能够调节细胞的生长特性的试剂。例如， 调节CLL-AAT细胞系中的细胞凋亡、或抑制其生长和/或增殖的试剂 可以被鉴定。这样的试剂是开发治疗性化合物的侯选物。
从CLL-AAT细胞系分离的核酸可以被用于扣除杂交实验以鉴定 CLL特异性的基因，或用于微阵列分析(例如基因芯片实验)。其转 录在CLL细胞中被调节的基因可以被鉴定。以这种方式鉴定的多肽或 核酸基因产物被用做开发CLL的抗体或小分子疗法的先驱。
在优选情况下，CLL-AAT细胞系可以被用来鉴定内生的抗体， 这些抗体与被细胞内化的细胞表面成分结合。这样的抗体是治疗应用
的侯选物。特别是在细胞质中保持稳定并保留细胞内结合活性的单链 抗体可以通过这种方式进行筛选。
另一方面，描述了一种治疗方法，该方法中在病人中筛选被恶性 癌细胞上调的多肽的存在，并给病人施用与被上调的多肽的代谢途径 相互作用的抗体。
本发明还涉及了一些方法，其中根据在患者中OX-2/CD200是否 被上调而作出决定，如果是的话，给患者施用与OX-2/CD200结合的 多肽。在另一个实施方案中，多肽与OX-2/CD200受体结合。
另一方面，本发明的方法被用来治疗OX-2/CD200被上调的患者 中的疾病状态，这是通过给患病的病人施用能够结合OX-2/CD200或 OX-2/CD200受体的多肽来进行的。在一个实施方案中，用这些方法 治疗的疾病状态包括癌症，在其它实施方案中具体指CLL。
附图简述
图1简要图示了通过磁活化细胞分类方法(MACS)进行抗体文 库的细胞表面淘洗中包括的典型步骤。
图2显示了全细胞ELISA的结果，证实了选定的scFv克隆与初 级B-CLL细胞的结合以及与正常的人类PBMC的不结合。在本图和 其它图中的符号2°+3°是指只用小鼠抗HA染色和只检测抗小鼠抗体的 阴性对照孔。在本图和其它图中的符号RSC-S文库是指从原始的兔
scFv未淘洗文库中制备的可溶性抗体。在本图和其它图中的符号 R3/RSC-S库是指从第三轮淘洗获得的完整的scFv抗体库中制备的可 溶性抗体。抗CD5抗体被用做阳性对照以证实在每个孔中放置了相等 数量的B-CLL和PBMC细胞。
图3a和3b显示了全细胞ELISA的结果，比较了选定的scFv抗 体与初级B-CLL细胞及正常的初级人B细胞的结合。抗CD19抗体被 用做阳性对照以证实在每个孔中放置了相等数量的B-CLL和正常B 细胞。其它的对照与图2的图例中描述的相同。
图4a和4b显示了全细胞ELISA的结果，用于确定scFv克隆是 与病人特异性(即独特型)抗原结合还是与血液特异性(即HLA)抗 原结合。每个克隆被测试与从3个不同的B-CLL病人分离的PBMC 的结合。与1个病人样品结合的克隆被认为是病人或血液特异性类型 的。
图5a和5b显示了全细胞ELISA的结果，比较了 scFv克隆与初 级B-CLL细胞和三个人类白血病细胞系的结合。Ramos是从Burkitt 氏淋巴瘤衍生的成熟B细胞系。RL是从非Hodgkin氏淋巴瘤衍生的 成熟的B细胞系。TF-1是从红白血病衍生的类成红细胞细胞系。
图6a、 6b和6c显示了全细胞ELISA的结果，比较了 scFv克隆 与初级B-CLL细胞和从B-CLL病人衍生的细胞系CLL-AAT的结合。 包含了 TF-1细胞作为阴性对照。
图7显示了本发明的scFv抗体的结合特异性，用3色流式细胞 计量术进行分析。在正常的外周血单核细胞中，被scFv-9识别的抗原 在B淋巴细胞上中度表达，在T淋巴细胞亚群中表达较弱。使用抗 CD5-FITC、抗CD19-PerCP和scFv-9/抗HA-生物素/链亲和素-PE通 过3色流式细胞计量术对来自正常供体的PBMC进行了分析。
图8a、 8b和8c显示了被本发明的scFv抗体所识别的抗原的表 达水平。被scFv-3和scFv-9识别的抗原在衍生出CLL-AAT细胞系的 初级CLL肿瘤上过量表达。来自CLL病人用于建立CLL-AAT细胞 系的初级PBMC或来自正常供体的PBMC用scFv抗体染色并通过流 式细胞计量术进行分析。当用中等的荧光强度进行测量时，scFv-3和
scFv-9对CLL细胞的染色比对正常细胞的染色更亮。
图9a和9b提供了选定的scFv抗体的CDR序列和结合特异性的 概要。
图10是显示了流式细胞计量术分析结果概要的表，比较了图8a-8c中描述的初级CLL细胞与正常PBMC上scFv抗原的表达水平。
图11是显示了流式细胞计量术分析结果概要的表，比较了 scFv-9抗原的表达水平与从10个CLL病人分离的外周血单核细胞中CD38+ 细胞的百分数。
图12显示了通过免疫沉淀和质谱对scFv抗原的鉴定。CLL-AAT 细胞用溶于pH8.0的PBS的0.5mg/ml sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce) 溶液标记30分钟。在用过量的PBS清洗除去未反应的生物素后，细 胞用氮气空化作用破碎，通过差速离心分离微粒体级份。微粒体级份 重新悬浮于NP40裂解缓冲液中，用正常的兔血清和蛋白A Sepharose 进行过量的预先澄清。抗原用HA标记的scFv抗体偶联大鼠抗HA琼 脂糖珠(Roche)进行免疫沉淀。免疫沉淀后，抗原用SDS-PAGE分 离，通过Western杂交使用链亲和素-碱性磷酸酶(AP)或使用考马 斯亮兰G-250染色来检测。不与CLL-AAT细胞结合的抗体scFv-7被 用做阴性对照。抗原条带从考马斯亮兰染色的凝胶中切下，通过质谱 (MS)进行鉴定。MALDI-MS在Scripps研究所的蛋白质组学核心实 验室(La Jolla， CA)进行。LC/MS/MS在哈弗微化学实验室(Cambridge, MA)进行。
图13显示了三个scFv抗体与用人OX-2/CD200 cDNA克隆瞬间 转染的293-EBNA细胞的特异性结合。OX-2/CD200 cDNA从CLL细 胞通过RT-PCR克隆，插入到哺乳动物表达载体pCEP4 (Invitrogen) 中。使用Polyfect试齐U (QIAGEN)将pCEP4-CD200质粒或相应的空 载体pCEP4转染到293-EBNA细胞中。转染2天后，通过细胞计量术 分析细胞与scFv抗体的结合。
图14显示了 OX-2/CD200转染细胞的存在导致了对Thl细胞因 子例如IL-2和IFN-Y的负调控。加入30貼/ml的抗OX-2/CD200抗体 完全恢复了 Thl反应。
图15显示了在混合的淋巴细胞反应中CLL细胞的存在导致了对 IL-2的Thl反应的负调控。
图16显示了在混合的淋巴细胞反应中CLL细胞的存在导致了对 IFN-y的Thl反应的负调控。
图17A和B显示了所有NOD/SCID小鼠组中肿瘤体积的平均值 +/-SD,这些小鼠在存在或不存在人的情况下用4X106 RAJI细胞进行 了皮下注射。
图18显示了使用两个参数检验(Student's t-test和Welch's test) 和一个无参数检验Wilcox test进行的统计学分析结果。
发明详述
根据本发明，提供了方法以确定患者中的OX-2/CD200是否被上 调，如果是的话，给患者施用与OX-2/CD200结合的多肽。 一般来说， 本发明中使用的多肽可以使用本领域的专业技术人员所熟知的各种不 同技术来构建。在一个实施方案中，多肽通过化学合成获得。在其它 实施方案中，多肽是抗体，或从一种或多种抗体的一个片段或几个片 段构建而成。
在优选情况下，在本发明的方法中使用的多肽从CLL细胞系获 得。此处使用的"CLL"是指涉及任何淋巴细胞的慢性淋巴细胞性白 血病，这些淋巴细胞包括但不限于各种发育阶段的B细胞和T细胞， 包括但不限于B细胞CLL ( "B-CLL")。此处使用的B-CLL是指 一种白血病，其B细胞具有成熟B细胞的表现型CD5+、CD23+、CD20dim+ 和sIgdim+，但终止于细胞周期的G0/G1期。另一方面，CLL细胞系被 用于产生多肽、包括抗体，以用于其中OX-2/CD200被上调的疾病状 态包括癌症和CLL的诊断和/或治疗。
本文使用的术语"抗体"是指能够与选定的靶结合的完整抗体或 抗体片段。包括Fv、 scFv、 Fab'和F(ab')2、单克隆和多克隆抗体、工 程抗体(包括嵌合、CDR-移植和人源化及完全的人类抗体，以及人工
选择的抗体)和使用噬菌体展示或其它技术生产的合成或半合成的抗
体。小的片段例如Fv和scFv，因为它们小的尺寸及较优越的组织分 布性，在诊断和治疗应用中具有有利的性质。
本发明使用的多肽和/或抗体被特别指明用于诊断和治疗应用。 因此它们可以用效应蛋白例如毒素或标记物来改建。特别优选的是允 许对多肽或抗体在体内的分布进行成像的标记物。这样的标记物可以 是放射性标记物或射线不能透过的标记物例如金属微粒，以便在病人 体内可以容易地被看见。此外，标记物可以是荧光标记物或其它在从 病人中取出的组织样品中可以被看见的标记物。
抗体的产生可以使用本发明的细胞作为免疫原，在动物中引发免 疫反应，再从中分离单克隆抗体。这些抗体的序列可以被测定，抗体 及其变异体可以通过重组技术生产。在这一方面来说，"变异体"包 括基于单克隆抗体以及能够结合OX-2/CD200的多肽的序列的嵌合 的、CDR-移植的、人源化的和完全的人类抗体。
此外，可以使用本文描述的细胞或从中衍生的多肽作为饵在靶特 异性的基础上分离抗体或多肽，从而筛选从重组文库衍生的抗体("噬 菌体抗体")。
另一方面，抗体和多肽的产生可以通过使用初级CLL细胞或从 其衍生的抗原来淘洗抗体文库，然后使用一株CLL细胞系例如本发明 描述的CLL细胞系进一步筛选和/或表征。因此，提供了用于表征特 异于CLL的抗体或多肽的方法，其中包括评估抗体或多肽与CLL细 胞系的结合。
细胞系的制备
细胞系可以按照本领域专业人员所熟知的现有的方法来产生。一 般来说，细胞系的产生是通过对来自病人的初级细胞进行培养直到在
培养物中自发产生了永生的细胞。然后分离这些细胞并进一步培养以 产生对细胞凋亡显示出抗性的克隆细胞群或细胞。
例如，可以从患有CLL的病人抽取的外周血中分离CLL细胞。 可以清洗这些细胞并进行适当的免疫分型以确定存在的细胞类型。然 后可以将细胞在培养基例如含有IL-4的培养基中进行培养。在优选情 况下，在培养过程中将全部或部分培养基替换一次或多次。然后可以 分离细胞系，并通过在培养中生长增加来鉴定。
在一个实施方案中，提供了一个不是通过EBV永生来建立的恶 性来源的CLL细胞系。"恶性来源"是指细胞系是从恶性的CLL初 级细胞衍生的，而不是从例如用EBV转化的非增殖性细胞衍生的。 本发明中使用的细胞系在表现型上可以是它们原来的恶性，也可以不 是。CLL细胞具有的"恶性"表现型包括在重复的细胞生长周期中细 胞生长不依赖于底物培养基，并对细胞凋亡表现出抗性。该从初级CLL 细胞衍生的细胞系被保藏于ATCC，登记号为PTA-3920。在优选实施 方案中，细胞系是CLL-AAT。 CLL-AAT是从B-CLL初级细胞衍生的 B-CLL细胞系。
在一个实施方案中，利用CLL-AAT细胞系，使用本领域的专业 技术人员熟知的方法、例如免疫沉淀然后质谱分析的方法，鉴定了在 CLL细胞中独特表达的蛋白。这些蛋白可以独特表达在CLL-AAT细 胞系中，或独特表达在来自CLL病人的初级细胞中。
可以使用CLL-AAT细胞系在基于细胞的分析中筛选小分子文库 (许多可以购买到)，以鉴定能够调节细胞的生长特性的试剂。例如， 调节CLL-AAT细胞系中的细胞凋亡、或抑制其生长和/或增殖的试剂 可以被鉴定。这样的试剂是开发治疗性化合物的侯选物。
从CLL-AAT细胞系分离的核酸可以被用于扣除杂交实验以鉴定CLL特异性的基因，或用于微阵列分析(例如基因芯片实验)。其转 录在CLL细胞中被调节的基因可以被鉴定。以这种方式鉴定的多肽或 核酸基因产物被用做开发CLL的抗体或小分子疗法的先驱。
在一个实施方案中，CLL-AAT细胞系可以被用来鉴定内生的抗 体，这些抗体与被细胞内化的细胞表面成分结合。这样的抗体是治疗 应用的侯选物。特别是在细胞质中保持稳定并保留细胞内结合活性的 单链抗体可以通过这种方式进行筛选。
单克隆抗体的制备
重组DNA技术可以被用来改进本发明产生的抗体。因此，可以 构建嵌合抗体以减少其在诊断或治疗应用中的免疫原性。此外，还可 以通过CDR移植和任选框架修饰使抗体人源化以最小化免疫原性。 参见美国专利No.5225539，其内容在此引为参考。
抗体可以可以从动物血清中获得，或对单克隆抗体或其片段来说 在细胞培养中产生。重组DNA技术可以被用来按照现有的步骤，在 细菌或优选的哺乳动物细胞培养中生产抗体。优选情况下选定的细胞 培养系统可以分泌抗体产物。
在另一个实施方案中，生产本发明的抗体的过程包括对已经用杂 合载体转化的宿主、例如大肠杆菌或哺乳动物细胞、进行培养。载体 包含了一个或多个表达元件。其中包括一个启动子，它与编码信号肽 的第一个DNA序列可操作地连接，该信号肽以适当的阅读框架与编 码抗体蛋白的第二个DNA序列连接。然后收集抗体蛋白并进行分离。 或者，表达元件可以包括与多顺反子例如双顺反子可操作地连接的启 动子，该多顺反子中编码抗体蛋白的DNA序列各自以适当的阅读框 架分别与信号肽可操作地连接。
杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞的体外增殖在适当的培养基中进
行，其中包括常规的标准培养基(例如Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)或RPMI 1640培养基)，可以添补哺乳动物血清 (例如胎牛血清)或微量元素和生长维持补充物(例如词养细胞如正 常的小鼠腹膜渗出液细胞、脾细胞、骨髓巨嗜细胞、2-氨基乙醇、胰 岛素、转铁蛋白、低密度脂蛋白、油酸等)。宿主细胞为细菌或酵母 细胞的增殖同样也是在本领域所熟知的适当的培养基中进行的。例如 对细菌来说适当的培养基包括LE、 NZCYM、 NZM、 Terrific Broth、 SOB、 SOC、 2x YT或M9基本培养基。对于酵母来说适当的培养基 包括YPD、 YEPD、基本培养基或完全基本缺陷培养基(Dropout Medium)。
体外生产提供了相对纯的抗体制备物，并允许放大以产生大量所 需抗体。细菌细胞、酵母、植物或哺乳动物细胞培养技术在本技术领 域是熟知的，包括均质悬浮培养(例如在气升式反应器或在连续搅拌 反应器中)和固定化或捕捉细胞培养(例如在中空纤维、微囊中、在 琼脂糖微珠或陶瓷筒上)。
大量的所需抗体也可以通过在体内增殖哺乳动物细胞而获得。为 了这个目的，产生所需抗体的杂交瘤细胞被注射到组织相容的哺乳动 物中，引起能产生抗体的肿瘤的生长。另外，在注射前，动物也可以 用碳氢化合物特别是矿物油例如鲨肝油垸(四甲基十五烷)引发。在 1到3周后，从那些动物的体液中分离抗体。例如，通过将适当的骨 髓瘤细胞与来自Balb/c小鼠的产生抗体的脾细胞或从杂交瘤细胞系 Sp2/0衍生的产生所需抗体的被转染的细胞进行融合获得的杂交瘤细 胞，通过腹膜内注射到任选用鲨肝油垸进行预处理后的Balb/c小鼠中。 在1到2周后，从动物中取得腹水。
上述的和其它的技术在例如Kohler和Milstein ( 1975) Nature 256:495-497;美国专利No. 4376110; Harlow禾卩Lane，抗体实验指南 (1988)冷泉港出版社，中有讨论，它们在此都引为参考。制备重组
抗体分子的技术在上述的参考文献以及例如WO97/08320;美国专利 No.5427908;美国专利No.5508717; Smith, 1985, Science, Vol. 225， pp 1315-1317; Parmley和Smith 1988， Gene 73， pp305-318; De La Cruz 等，1988， Journal of Biological Chemistry, 263 pp4318-4322;美国专利 No.5，403,484，美国专利No.5223409; WO88/06630; W092/15679; 美国专利No.5780279;美国专利No.5571698;美国专利No.6040136; Davis等，Cancer Metastasis Rev.， 1999， 18(4):421-5; Taylor等，Nucleic Acids Research 20(1992):6287-6295; Tomizuka等，Proc. Nat. Academy of Science USA 97(2) (2000):722-727中有描述。所有这些参考文献的内 容在此引为参考。
在细胞培养上清液中筛选所需抗体，在优选情况下通过CLL细 胞的免疫荧光染色、通过免疫杂交、通过酶联免疫分析例如夹心分析 或斑点分析、或通过放射免疫分析来进行。
为了分离抗体，培养上清液或腹水液中的免疫球蛋白可以通过例 如用硫酸铵沉淀、对吸湿材料如聚乙二醇透析、用选择性膜进行过滤 等方法来浓縮。如果必需和/或需要，抗体可以通过常规的层析方法来 纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE纤维素层析和/或(免疫) 亲和层析，例如用从本发明的CLL细胞系衍生的一个或多个表面多肽 或用蛋白A或G进行亲和层析。
另一个实施方案提供了制备细菌细胞系的方法，该细菌细胞系分 泌直接针对细胞系的抗体，该方法的特点在于用收集的CLL病人样品 免疫适当的哺乳动物，例如兔。从被免疫的兔产生的噬菌体展示文库 被构建并使用本领域所熟知的方法(例如本文引为参考的各种参考文 献中公布的方法)从中淘洗所需的抗体。
分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞也被考虑到了。优选的杂交瘤细胞 应该在遗传上稳定、分泌具有所需的特异性的本发明的单克隆抗体、
并且可以从深冻的培养物中通过融化和再克隆得到活化。
在另一个实施方案中，提供了制备杂交瘤细胞系的方法，该杂交
瘤细胞系分泌针对本发明的CLL细胞系的单克隆抗体。在该方法中， 使用从本发明描述的细胞衍生的一个或多个多肽或其抗原性片段、细 胞系本身、或含有纯化的多肽的抗原性载体来免疫适当的哺乳动物， 例如Balb/c小鼠。被免疫的哺乳动物中产生抗体的细胞被简单地培养 或与适当的骨髓瘤细胞系的细胞进行融合。在融合中获得的杂交细胞 被克隆，并筛选分泌所需抗体的细胞克隆。例如用本发明细胞系免疫 的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Agl4的细胞进行融合，获得的杂交细胞被筛选对所需抗体的分泌， 阳性的杂交瘤细胞被克隆。
优选的制备杂交瘤细胞系的方法，其特点为通过皮下和/或腹膜 内的方式，将106到107之间的本发明的细胞系的细胞，在几个月的 时间例如2至lj 4个月内，通过几次例如4到6次注射到Balb/c小鼠中。 在最后一次注射后2到4天从被免疫的小鼠取得脾细胞，在存在融合 促进剂优选为聚乙二醇的情况下与骨髓瘤细胞系PAI的细胞进行融 合。优选情况下，骨髓瘤细胞与3到20倍过量的被免疫小鼠的脾细 胞在含有大约30%到大约50%分子量为大约4000的聚乙二醇的溶液 中进行融合。融合后，细胞被平铺在前面描述的适当的培养基上，以 规定的时间间隔添加选择培养基例如HAT培养基，以便防止正常的 骨髓瘤细胞的生长超过所需的杂交瘤细胞。
在另一个实施方案中，生产了重组的DNA，它含有插入片段， 为针对前述的细胞系的抗体的重链可变区和/或轻链可变区编码。术语 DNA包括编码的单链DNAs、含有该编码DNAs和与其互补的DNAs 的双链DNAs、或这些互补的(单链)DNAs本身。
此外，为针对本发明的细胞系的抗体的重链可变区和/或轻链可
变区编码的DNA，可以是酶法或化学合成的具有为重链可变区和/或 轻链可变区编码的真实的DNA序列的DNA，也可以是其突变体。真 实的DNA的突变体是编码上述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的 DNA，其中的一个或多个氨基酸被删除了或被一个或多个其它的氨基 酸所替代。优选情况下在人源化和表达最适化应用中，该修饰位于抗 体的重链可变区和/或轻链可变区的CDRs之外。术语突变体DNA也 包括沉默突变，其中一个或多个核苷酸被其它的核苷酸所代替，产生 的新密码子编码同样的氨基酸。术语突变序列也包括简并的序列。简 并序列是指遗传密码意义上的简并，其中不限数量的核苷酸被其它核 苷酸所替代，而不导致最初编码的氨基酸序列的改变。这样的简并序 列可能是有用的，因为它们具有不同的限制性位点以及/或被特定的宿 主特别是大肠杆菌所优选的特定的密码子频率，以便获得重链鼠可变 区和/或轻链鼠可变区的最适的表达。
术语突变体包括按照本技术领域所熟知的方法对真实的DNA进 行体外突变而获得的DNA突变体。
为了装配完整的四聚体免疫球蛋白分子以及表达嵌合的抗体，为 重链和轻链可变区编码的重组DNA插入片段与相应的编码重链和轻 链恒定区的DNA融合，然后在例如并入杂交载体中后，转移到适当 的宿主细胞中。
此外还提供了重组DNA，包含了为针对本发明的细胞系的抗体 的重链鼠可变区编码的插入片段与人类的恒定区g、例如yl、 y2、 y3 和l4、优选为yl或y4的融合。也提供了重组DNA，包含了为针对本 发明的细胞系的抗体的轻链鼠可变区编码的插入片段与人类的恒定区
K或入、优选为K的融合。
另一个实施方案涉及为重组多肽编码的重组DNAs，其中的重链 可变区和轻链可变区通过间隔物连接，也可以包含信号序列以便于抗
体在宿主细胞中的加工，和/或包含编码肽的DNA以便于抗体的纯化， 和/或水解位点和/或肽间隔物和/或效应分子。
为效应分子编码的DNA是指为可用于诊断或治疗应用的效应分 子编码的DNA。因此特别指出效应分子可以是毒素或酶、特别是能够 催化药物前体的活化的酶。为这样的效应分子编码的DNA具有为天 然存在的酶或毒素的序列编码的DNA或其突变体，可以通过本技术 领域所熟知的方法来制备。
本发明的抗体和抗体片段在诊断和治疗中是有用的。因此，提供 了包含本发明的抗体的治疗或诊断组合物。
在诊断组合物中，优选情况下抗体与检测抗体的方法一起被提 供，这可以是酶学的、荧光的、放射性同位素的或其它的方法。在用 于诊断目的的诊断试剂盒中，抗体和检测方法可以提供成同时，分开 或顺序的使用。
虽然上面公开的内容针对抗体，但是在某些实施方案中从这些抗 体衍生的多肽也可以用于本发明。
CLL细胞系的使用
发展CLL细胞系有许多优点，因为它为CLL、癌症和其它以 OX-2/CD200的水平被上调为特征的疾病状态例如黑素瘤的诊断和治 疗的发展提供了重要的工具。
本发明的细胞系可以用于CLL和其它以OX-2/CD200的水平被 上调为特征的疾病状态的病因学、发病机理和生物学体外研究。这帮 助鉴定了在这些疾病的治疗中有用的适当的试剂。
如上所述，细胞系也可以用于产生多肽和/或单克隆抗体，用于
CLL、癌症和其它以OX-2/CD200的水平被上调为特征的疾病状态例 如黑素瘤的体外和体内诊断，以及用于通过其它方法产生的抗体的筛 选和/或定性，例如通过用来自CLL病人的初级细胞和/或抗原淘洗抗 体文库的方法。
细胞系可以这样使用，或者可以从其衍生出抗原。有利的是这样 的抗原是对CLL特异的细胞表面抗原。它们可以直接从本发明的细胞 系中分离。此外，从本发明描述的细胞系制成的cDNA表达文库也可 以用于表达CLL特异性抗原，用于抗CLL抗体的筛选和定性以及新 的CLL特异性抗原的鉴定。
在本技术领域中已经提出了用单克隆抗体疗法来治疗CLL。最 近，Hainsworth (Oncologist 5(5) (2000) 376-384)已经描述了目前从 单克隆抗体衍生的治疗方法。特别是淋巴细胞性白血病被认为是这种 疗法的理想候选者，这是因为在淋巴细胞肿瘤上存在多淋巴细胞特异 性的抗原。
现有的抗体疗法(例如Rituximab TM，它针对B淋巴细胞表面 表达的CD20抗原)已经被成功地用于治疗某些淋巴细胞疾病。但是， 在CLL中在B淋巴细胞表面表达的是较低密度的CD20抗原(Almasri 等，Am. J.Hematol.， 40(4) (1992) 259-263)。
因此本发明的CLL细胞系允许发展新的抗CLL抗体和多肽，它 们对本CLL细胞系的一个或多个抗原决定簇具有特异性，它们可以用 于CLL、癌症和其它以OX-2/CD200的水平被上调为特征的疾病状态 的治疗和诊断。
抗体或多肽可以结合到正常情况下与OX-2/CD200相互作用的受 体上，从而阻止或抑制了 OX-2/CD200与受体的结合。另一种可选择 的方案是，抗体可以与调节OX-2/CD200表达的抗原结合，从而阻止
或抑制了 OX-2/CD200的正常或增加的表达。由于OX-2/CD200的存 在与减少的免疫反应相关，因此值得考虑对OX-2/CD200的代谢途径 进行干扰以便病人的免疫系统能够更有效地抵御疾病状态，例如癌症 或CIX。
在一个特别有用的实施方案中，多肽与OX-2/CD200结合。在一 个实施方案中，多肽可以是与OX-2/CD200结合的抗体，并阻止或抑 制OX-2/CD200与其它的分子或受体相互作用。因为CLL细胞和其它 过量表达OX-2/CD200的细胞极大地减少了 Thl细胞因子的生产，给 OX-2/CD200的水平被上调的病人使用抗CD200抗体或与OX-2/CD200 结合的多肽恢复了 Thl细胞因子谱。因此，这些多肽和/或抗体在CLL 和其它癌症或过量表达OX-2/CD200的疾病的治疗中可能是有用的治 疗试剂。
因此，在另一个实施方案中，本发明的方法包括筛选存在OX-2/CD200的患者以及使用与OX-2/CD200结合的多肽的步骤。在一个 特别有用的实施方案中，筛选OX-2/CD200过量表达的CLL病人，并 且给病人使用与OX-2/CD200结合的抗体。正如下面将详细描述的那 样， 一个这样的抗体是与OX-2/CD200结合的scFv-9 (参见图9B)。
为了本领域的专业技术人员能够更好地实践本文描述的组合物和 方法，为说明的目的给出了下面的实施例。
实施例1
CLL-AAT细胞系的分离 细胞系的建立
从被诊断为CLL的病人获得外周血。白细胞数量是1.6xlOVml。 通过Histopaque-1077密度梯度离心(Sigma Diagnostics, St. Louis， MO)分离单核细胞。用添加了 10。/。热失活的胎牛血清(FBS)的Iscove，s Modified Dulbecco，s培养基(IMDM)将细胞清洗两次，重悬浮在5ml
冰冷的IMDM/10%FBS中。活细胞通过锥虫蓝染色进行计数。细胞与 等体积的85%FBS/15%DMSO混合，分成1ml的等份试样冷冻，储存 在液氮中。
免疫表现型分析显示90%以上的CD45+淋巴细胞群表达IgD、 k 轻链、CD5、 CD19和CD23。该群也表达低水平的IgM和CD20。大 约50%的细胞表达高水平的CD38。细胞是入轻链、CD10和CD138阴性。
细胞的一个等份试样被融化，清洗，以107/mL的密度重新悬浮 在添加了 20。/。热失活的FBS、 2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、 100pg/ml链霉素、50pM 2-巯基乙醇和5ng/ml重组人IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN)的IMDM中。细胞在增湿的含5% C02的 气氛中于37°C培养。每4天更换部分培养基直到观察到稳定的生长。 5周后，培养液中的细胞的数量开始大约每4天翻番。该细胞系被命 名为CLL-AAT。
细胞系的性质
通过流式细胞计量术对细胞系的免疫表现型分析显示，IgM、 k 轻链、CD23、 CD38和CD138高表达，CD19和CD20中度表达，IgD 和CD5弱表达。细胞系是人轻链、CD4、 CD8和CD10阴性。
细胞系的免疫表现型分析也通过全细胞ELISA进行，使用了一 组已经被筛选为与初级B-CLL细胞特异性结合的兔scFv抗体。所有 这些CLL特异性scFv抗体也识别CLL-AAT细胞系。相反，大部分 的scFvs不与从B细胞淋巴瘤衍生的两个细胞系结合，它们是Ramos、 Burkitt氏淋巴瘤细胞系和RL、非Hodgkin氏淋巴瘤细胞系。
实施例2
使用抗体噬菌体展示和细胞表面淘洗筛选针对B-CLL特异性细胞表面 抗原的scFv抗体
免疫和scFv抗体文库的构建
从Scripps临床医院(La Jolla, CA)的CLL病人抽取的血液中分 离外周血单核细胞(PBMC)。用从10个不同的患有CLL的供体收 集的2xl07个PBMC免疫2只兔子。以3周的时间间隔进行3次免疫， 两次通过皮下注射然后一次通过静脉内注射。使用流式细胞计量术通 过测量血清IgG与初级CLL细胞的结合来检查血清的滴度。在最后一 次免疫后5天，从动物收集脾脏、骨髓和PBMC。从这些组织中使用 Tri-Reagent (Molecular Research Center, Inc)分离总RNA。如以前所 描述的那样构建单链Fv(scFv)抗体噬菌体展示文库(Barbas等(2001) 噬菌体显示实验指南，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。为了 进行细胞淘洗，从再次扩增的文库产生的噬粒颗粒用聚乙二醇(PEG) 沉淀，重新悬浮在含有1。/。牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS) 中，对PBS透析过夜。
通过细胞表面淘洗筛选抗体
象Siegel等描述的那样(1997， J. Immunol. Methods 206:73-85) 使用磁激活的细胞分类器(MACS)通过阳性-阴性筛选富集了 CLL 细胞表面特异性抗体的文库。简单来说，来自scFv抗体文库的噬粒颗 粒在MPBS (2%脱脂奶粉和0.02%叠氮化钠溶于pH7.4的PBS)中于 25。C预先保温1小时以封闭非特异性的结合位点。大约1(^个初级CLL 细胞用与顺磁微珠(Miltenyi Biotec， Sunnyvale, CA)连接的小鼠抗CD5 IgG和小鼠抗CD19 IgG标记。通过清洗将未结合的微珠除去。标记 的CLL细胞("靶细胞")与过量的"抗原阴性吸附细胞"混合，沉 淀，重新悬浮在50nl (10^-10"cfu)噬菌体颗粒中。吸附细胞用于吸 收非特异性黏附在细胞表面的噬菌体和对出现在靶细胞和吸附细胞上 的"常见"抗原具有特异性的噬菌体。使用的吸附细胞是从外周血通 过免疫磁性阴性筛选(StemSep System, StemCell Technologies, Vancouver, Canada)分离的TF-1细胞(人红白血病细胞系)或正常的 人B细胞。吸附细胞与耙细胞的比率按体积来说大约是10倍。在25。C
保温30分钟后，细胞/噬菌体混合物被转移到MiniMACS MS+分离柱 中。柱用0.5ml MPBS洗两次，用0.5ml PBS洗一次，以除去未结合 的噬菌体和吸附细胞。靶细胞用lml PBS从柱上洗脱下来，在微量离 心机中以最大速度离心15秒沉淀下来。被捕获的噬菌体颗粒通过将 靶细胞重新悬浮在20(Hxl酸性洗脱缓冲液(0.1N HC1，用甘氨酸将pH 调整到2.2，加入lpg/ml BSA)中而洗脱下来。在25°C保温10分钟 后，缓冲液用12^1 pH10.5的2M的Tris碱中和，洗脱下来的噬菌体 在大肠杆菌中扩增以进行下一轮淘洗。对于每一轮淘洗，测定进入和 输出的噬菌体的滴度。进入的滴度是加到靶细胞/吸附细胞混合物中的 再次扩增的噬菌体颗粒的数量，输出的滴度是从靶细胞上被洗脱的捕 获的噬菌体的数量。富集因子(E)使用公式E= (Rn输出/Rn输入)/ (R,输出/R,输入)来计算。在大多数情况下，到第三或第四轮富集 因子应该达到102國103倍。
淘洗后富集的抗体库的分析
在3-5轮淘洗后，通过流式细胞计量术和/或全细胞ELISA分析 被捕获的噬菌体库与CLL细胞的结合
1、 为了产生HA标记的可溶性抗体的完整的库，用1^1 (109-101()cfu)噬粒颗粒感染2ml无抑制基因的大肠杆菌菌株(例如 TOP10F')。原始的未淘洗的文库作为阴性对照。加入羧苄青霉素到 终浓度为10pM，将培养液在37°C保温1小时，以250rpm振荡。加 入含有50ng/ml羧苄青霉素的SB培养基8ml，将培养物生长到OD600 大约为0.8。加入IPTG至终浓度为lmM以诱导scFv从Lac启动子的 表达，在37°C继续振荡4小时。培养物在3000xg离心15分钟。含 有可溶性抗体的上清液被过滤，分为lml的等份试样储存在-20。C。
2、 scFv抗体库与靶细胞和吸附细胞的结合通过流式细胞计量术 测定，使用高亲和性的大鼠抗HA (克隆3F10， Roche Molecular Biochemicals)作为第二抗体，PE-结合的驴抗大鼠抗体作为第三抗体。
3、 抗体库与靶细胞和吸附细胞的结合也通过下述的全细胞 ELISA来测定。 在淘洗后对单个scFv克隆进行筛选
为了在淘洗后筛选单个的scFv克隆，如上所述用噬菌体库感染 TOP10F，，铺在含有羧苄青霉素和四环素的LB平板上，在37。C保温 过夜。单个克隆被接种到深的96孔板中，每个孔含有0.6-1.0ml SB-羧节青霉素培养基。培养物在HiGro摇床(GeneMachines, San Carlos, CA)上于37。C和520rpm生长6-8小时。此时，从每个孔中取出9(Hd 试样转移到含有10nl DMSO的深的96孔板中。该复制的板被储存在-80°C。在原始平板上加入IPTG到终浓度为lmM，继续振荡3小时。 板在3000xg离心15分钟。含有可溶性scFv抗体的上清液被转移到另 一个深的96孔板中，于-20。C储存。
开发了一种筛选HA标记的scFv抗体的灵敏的全细胞ELISA方
法
1、 ELISA板用伴刀豆球蛋白A包被(10mg/ml，溶于0.1M NaHC03， pH8.6， 0.1MCaCl2)。
2、 用PBS洗板后，在每个孔中加入0.5-1^05个靶细胞或吸附 细胞的50plPBS，板在250xg离心10分钟。
3、 加入5(^1溶于PBS的0.02%的戊二醛，细胞在4°C固定过夜。
4、 用PBS洗后，非特异性结合的位点用含有4%脱脂奶粉的PBS 在室温封闭3小时。
5、 细胞与50pl可溶的HA标记的scFv或Fab抗体(TOPIOF' 上清液)在室温保温2小时，然后用PBS洗6次。
6、 使用小鼠抗HA第二抗体(克隆12CA5)和碱性磷酸酶(AP) 连接的抗小鼠IgG第三抗体检测结合的抗体。使用AMDEX AP连接 的绵羊抗小鼠IgG作为第三抗体(Amersham Pharmacia Biotech)可以 获得大约扩大10倍的信号。AMDEX抗体通过葡聚糖骨架与多个AP 分子连接。使用碱性磷酸酶的底物PNPP产生颜色，使用读板器在 405nm湖lj量。
scFv克隆的初筛通过对初级CLL细胞和正常人类PBMC的ELISA 来进行。对CLL细胞阳性并对正常PBMC阴性的克隆通过ELISA对 正常人B细胞、人B细胞系TF-1细胞和CLL-AAT细胞系进行再次 筛选。克隆再次通过ELISA对从三个不同的病人分离的CLL细胞进 行筛选，以消除识别病人特异性或血型特异性抗原的克隆。从代表性 的ELISA获得的结果显示在图2-6中，并在图9中进行了概括。
获得的独特scFv抗体克隆的数目通过DNA指纹图谱和测序确 定。scFv DNA插入片段从质粒上通过PCR扩增，用限制性酶BstNI 消化。得到的片段在4%琼脂糖凝胶上分离，用溴化乙锭染色。具有 不同限制性片段类型的克隆一定具有不同的氨基酸序列。具有同样的 类型的克隆可能具有相似的或相同的序列。具有独特的BstNI指纹图 谱的克隆进一步通过DNA测序进行分析。发现了 25个不同的序列， 可以被分成16组具有密切关系的互补决定区的抗体(图9)。
通过流式细胞计量术对scFv抗体进行表征
通过三色流式细胞计量术对几个scFv抗体的结合特异性进行了 分析(图7)。从正常供体分离的PBMC用FITC连接的抗CD5和PerCP 连接的抗CD19抗体染色。scFv抗体的染色使用生物素连接的抗HA 作为第二抗体的PE连接的链亲和素进行染色。三个抗体scFv-2、scFv-3 和scFv-6被发现特异性地识别CD19+B淋巴细胞群(数据未显示)。 第四抗体scFv-9识别两个不同的细胞群CD19+B淋巴细胞和CD5+T 淋巴细胞的一个亚类(图7)。对T细胞亚类的进一步定性表明它是 CD4+CD8-Th細胞的一个亚群(数据未显示)。
为了确定scFv抗体识别的抗原是否在初级CLL细胞上过量表 达，来自5个CLL病人和5个正常供体的PBMC用scFv染色并通过 流式细胞计量术进行比较(图8和表2)。通过比较阳性细胞群的平 均荧光强度，可以测定CLL细胞与正常细胞上抗原的相对表达水平。
一个抗体scFv-2总是对CLL细胞的染色强度弱于对正常PBMC的染 色，而scFv-3和scFv-6则总是对CLL细胞的染色亮于对正常PBMC 的染色。第四个抗体scFV-9，对5个CLL样品中的两个的染色强于 对正常PBMC的染色，但是对其它3个CLL样品的染色仅仅稍微亮 一些(图8和表2)。这表明scFv-3和scFv-6的抗原在如果不是全部 也是大多数CLL肿瘤上过量表达了大约2倍，而scFv-9在CLL肿瘤 的一个亚类中过量表达了 3-6倍。
CLL病人可以被分成大约相等的两组预后不良的病人(平均存 活时间8年)和预后良好的病人(平均存活时间26年)。对CLL已 经鉴定了几个预后不良的信号，最显著的是存在缺少体细胞突变的VH 基因和高百分率CD38+ B细胞。因为scFv-9识别仅仅在CLL病人的 一个亚类中过量表达的抗原，我们试图确定是否scFV-9抗原的过量 表达与来自10个CLL病人的血液样品中的CD38+细胞百分率具有相 关性(图11)。结果表明scFv-9抗原的过量表达和CD38+细胞百分 率彼此之间完全独立。
通过免疫沉淀(IP)和质谱(MS)鉴定被scFv抗体识别的抗原
为了鉴定这些抗体的抗原，使用scFvs对从细胞表面生物素化的 CLL-AAT细胞的微粒体级分制备的裂解液中的抗原进行免疫沉淀(图 12)。被免疫沉淀的抗原通过SDS-PAGE纯化，并通过基质辅助激光 解析电离质谱(MALDI-MS)或毛细管反向HPLC纳喷串联质谱 ((iLC/MS/MS)进行鉴定(数据未显示)。scFv-2从RL和CLL-AAT 细胞都免疫沉淀了 110kd的抗原(图12)。该抗原被MALDI-MS鉴 定为B细胞特异性的标记CD19。 ScFv-3和scFv-6都从CLL-AAT细 胞免疫沉淀了 45kd的抗原(数据未显示)。该抗原被MALDI-MS鉴 定为CD23，这是已知的CLL和活化的B细胞的标记。ScFv-9从 CLL-AAT细胞免疫沉淀了 50kd的抗原(图12)。该抗原通过 (iLC/MS/MS鉴定为OX-2/CD200，是已知的B细胞、活化的CD4+细 胞和胸腺细胞的标记。OX-2/CD200也在一些非淋巴类细胞例如神经
元和内皮细胞上表达。
实施例3
过量表达OX-2/CD200的细胞将细胞因子反应从Thl反应(IL-2， IFN-y)转移到Th2反应(IL-4， IL-10)的能力被评估，评估在混合 的淋巴细胞反应中进行，使用来自一个供体的单核细胞衍生的巨嗜细 胞/树突状细胞和来自不同供体的血液来源的T细胞。下述的用OX-2/CD200转染的EBNA细胞或CLL病人的样品被用作OX-2/CD200表 达细胞的来源。
293-EBNA细胞的转染
在每个100mm的碟子中接种2.5x106个293-EBNA细胞 (Invitrogen)。 24小时后细胞用Polyfect试剂(QIAGEN)按照制造商 的说明进行瞬间转染。细胞用7.2pg连接在pCEP4载体(Invitrogen) 中的OX-2/CD200 cDNA禾卩0.8pg pAdVAntage载体(Promega)共转 染。用空的pCEP4载体加上pAdVAntage载体共转染的细胞作为阴性 对照。转染48小时后，通过流式细胞计量术使用scFv-9抗体测定的 结果表明大约90%的细胞在它们的表面表达了 OX-2/CD200。
来自血液单核细胞的树突状细胞/巨嗜细胞的成熟
白细胞层从San Diego血库获得，初级血液淋巴细胞(PBL)使 用Ficoll分离。细胞在含有2%人类血清的Eagles最小基本培养基 (EMEM)中吸附1小时，然后用PBS充分冲洗。细胞在存在GM-CSF、 IL-4和IFN-y或M-CSF的情况下培养5天，在3天后添加或不添加脂 多糖(LPS)。成熟的细胞被收集，使用y-放射源(Shepherd Mark I Model 30 irradiator (Cs137))在2000RAD下辐射。
混合淋巴细胞反应
混合淋巴细胞反应在24孔板中建立，使用500000个树突状细胞 /巨嗜细胞和lxl(^个反应细胞。反应细胞是从外周血中使用Ficoll纯
化的富集了 T细胞的淋巴细胞。T细胞的富集是通过将细胞在组织培 养瓶中保温1小时，然后取出不吸附的细胞级份。在加入淋巴细胞之 前2-4小时，500000个OX-2/CD200转染的EBNA细胞或CLL细胞 在存在或不存在30pg/ml抗CD200抗体(被转变为完整IgG的scFv-9) 的情况下被加入到巨嗜细胞/树突状细胞中。在48小时和68小时后收 集上清液，并分析细胞因子的存在。
ScFv-9向完整IgG的转变
scFv-9的轻链和重链可变区通过重叠PCR扩增，使用分别连接 每个基因的可变区和人 i轻链恒定区基因和人IgGl重链恒定区CH1 基因的引物。ScFv-9的轻链基因和重链基因的可变区使用特异的引物 扩增，人人轻链恒定区基因和人IgGl重链恒定区CH1基因使用特异 的引物分别扩增，使用的引物如下
R9VL-F1 QP: 5， GGC CTC TAG ACA GCC TGT GCT GAC TCA GTC GCC CTC 3 ， (SEQ ID NO 26);
R9VL/hCL2-rev: 5' CGA GGG GGC AGC CTT GGG CTG ACC TGT GAC GGT CAG CTG GGT C 3' (SEQ ID NO 27);
R9VL/hCL2-F: 5， GAC CCA GCT GAC CGT CAC AGG TCA GCC CAAGGCTGCCCCCTCG3， (SEQ ID N028);
R9VH-F1: 5， TCT AAT CTC GAG CAG CAG CAG CTG ATG GAG TCCG3， (SEQIDN0 29);
R9VH/hCG國rev: 5' GAC CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT GC 3' (SEQ ID
NO 30);
R9VH/hCG-F: 5， GCA CCC TGG TCA CCG TCT CCT CAG CCT CCA CCA AGG GCC CAT CGG TC 3' (SEQ ID NO
31);
hCL2陽rev: 5， CCA CTG TCA GAG CTC CCG GGT AGA AGT C 3， (SEQ ID NO 32);
hCG-rev: 5， GTC ACC GGT TCG GGG AAG TAG TC 3' (SEQ
ID NO 33).
扩增产物被纯化并进行重叠PCR。
终产物用Xba I/Sac I (轻链)和Xho I/Pin AI (重链)消化，并 克隆在人Fab表达载体PAX243hGL中。DNA克隆通过DNA测序来 分析PCR的错误。hCMV IE启动子基因被插到Not I/Xho I位点(在 重链之前)。载体用Xba I/Pin AI/EcoR I/Nhe I消化，含有轻链加hCMV IE启动子和重链基因的3472bp的片段被转移到IgGl表达载体的Xba I/Pin AI位点处。
细胞因子分析
scFv-9转变为完整的IgG对混合淋巴细胞反应中细胞因子谱的影 响被确定。
使用ELISA对在组织培养上清液中发现的IL-2、IFN-y、IL-4、IL-10 和IL-6进行了定量。每种细胞因子的匹配的捕获和检测抗体对从R+D Systems公司(Minneapolis, MN)获得，使用重组人细胞因子为每种 细胞因子制作了标准曲线。抗细胞因子捕获抗体以最适的浓度在PBS 中包被在板上。保温过夜后，洗板，并用含有P/。BSA和5%蔗糖的PBS 封闭1小时。在用含有0.05%Tween的PBS清洗3次后，加入用含有 1% BSA的PBS稀释2倍或10倍的上清液。被捕获的细胞因子用适 当的生物素化的抗细胞因子抗体然后加入碱性磷酸酶结合的链亲和素 和SigmaS底物来检测。颜色的产生用ELISA读板器(Molecular Devices)来评估。
如图14所示，OX-2/CD200转染的细胞的存在导致Thl细胞因 子例如IL-2和的IFN-y的下调，但未转染的细胞则不会。以30^g/ml 的浓度加入抗CD200抗体完全恢复了 Thl反应，表明抗体封闭了 OX-2/CD200与其受体的相互作用。
如图15和16所示，在混合淋巴细胞反应中存在CLL细胞导致 了Thl细胞因子的下调。(图15显示了对IL-2的结果；图16显示了 对IFN-Y的结果。)这不仅是在过量表达OX-2/CD200的细胞(IB、 EM、 HS、 BH)的情况中，而且也在不过量表达OX-2/CD200的细胞(JR、 JG和GB)的情况中出现(这些细胞的表达水平显示在图11中)。 但是，抗CD200抗体只能恢复过量表达OX-2/CD200的细胞中的Thl 反应，表明对于过量表达OX-2/CD200的病人来说，废止OX-2/CD200 与它在巨嗜细胞上的受体的相互作用就足够恢复Thl反应。在不过量 表达OX-2/CD200的病人中，显示出其它的机制参与了 Thl反应的下 调。
试验抗CD200抗体对肿瘤排斥的效果的动物模型
建立了一个模型，其中RAJI淋巴瘤肿瘤的生长被同时注射的 PBL's所阻止。NOD/SCID小鼠在存在或不存在lx106、 5乂106或10x106 个来自不同供体的人PBL's的情况下，通过皮下注射了 4"06个RAJI 细胞。肿瘤的长度和宽度以及体重每周测定3次。所有的组中肿瘤体 积的平均+/- SD被显示在图17A和B中。使用两个参数检验(Student's t陽test禾卩Welch's test)和一个非参数检验Wilcox test进行了统计学分 析。统计学分析的结果显示在图18中。PAJI细胞在皮下形成了肿瘤， 其偏差可以接受。排斥依赖于具体的供体和PBL细胞的数量。lxl06 个PBL's不足以阻止肿瘤的生长。5xlOS个供体2的PBL's从22到43 天和5xlOS个或lxl(^个供体3的PBL's从36天开始明显地减缓了肿 瘤的生长。供体4在48天后非常近于显著的结果。
为了试验抗CD200抗体的效果，RAJI细胞用CD200稳定转染。 象前一段描述的那样注射动物。在CD200转染的细胞存在的情况下， 肿瘤即使在存在人PBL's的情况下也可以生长。在该模型中使用抗 CD200抗体来评估肿瘤的排斥。
此外还建立了一个液体肿瘤模型。RAJI细胞通过腹膜内注射到NOD/SCID小鼠中。细胞散布到骨髓、脾脏、淋巴结和其它器官中导 致了瘫痪。同时注射人PBL's阻止或减缓了肿瘤的生长。通过评估小 鼠的运动损伤和瘫痪的情况来监测肿瘤的生长。 一旦发现这些情况， 将小鼠处死，不同器官包括骨髓、脾脏、淋巴结和血液中的肿瘤细胞 的数量通过FACS分析和PCR来评估。
与皮下注射的模型相同，CD200转染的细胞通过腹膜内注射。它 们即使在存在人PBL's的情况下也能生长。用抗CD200抗体处理导致 肿瘤的排斥或肿瘤生长的减缓。
参考文献
下面的参考文献在此引为参考以便更全面地描述本发明所属的技 术领域的状态。下面的这些著作或前面引为参考的著作与本发明的内 容之间如果有任何不一致的地方，应该朝对本发明有利的方式予以解 决。
1) Agarwal等,(2003). Disregulated expression of the Th2 cytokine gene in patients with intraoral squamous cell carcinoma.(在患有口腔内 部鳞状细胞腺癌的病人中Th2细胞因子基因不受调控的表达)Immuno1 Invest 32:17-30.
2) Almasri，画等.(1992). Am J H,to 140 259-263.
3) Contasta等,(2003). Passage from normal mucosa to adenoma and colon cancer: alteration of normal sCD30 mechanisms regulating TH1/TH2 cell functions.(从正常粘膜到腺瘤和结肠癌的过程调节 TH1/TH2细胞功能的正常sCD30机制的变化)Cancer Biother Radiopharm 18:549-557.
4) Gorczynski 等,(1998). Increased expression of the novel molecule OX-2 is involved in prolongation of murine renal allograft survival.(新分子OX-2的增加的表达与鼠肾异源移植存活期的延长有 关)Transplantation 65:1106-1114.
5) Gorczynski 等,(2001). Evidence of a role for CD200 in
regulation of immune rejection of leukaemic tumor cells in C57BL/6 mice.
(在C57BL/6小鼠中CD200在白血病肿瘤细胞的免疫排斥调控中发 挥作用的证据)Clin Exp Immunol 126:220-229.
6) Hainsworth， JD(2000). Oncologist 2000;5(5):376-84.
7) Inagawa等,(1998). Mechanisms by which chemotherapeutic agents augment the antitumor effects of tumor necrosis factor: involvement of the pattern shift of cytokines from Th2 to Thl in tumor lesions.(化学 治疗试剂增强肿瘤坏死因子的抗肿瘤效果的机理涉及了在肿瘤病灶 中细胞因子从Th2到Thl的类型转移)Anticancer Res 18:3957-3964.
8) Ito等，(1999). Lung carcinoma: analysis of T helper type 1 and 2 cells and T cytotoxic type 1 and 2 cells by intracellular cytokine detection with flow cytometry.(肺癌通过用流式细胞计量术检测细胞内细胞 因子来分析1和2型辅助性T细胞和1型和2型细胞毒性T细胞)Cancer 85:2359-2367.
9) Kiani等，(2003). Normal intrinsic Thl/Th2 balance in patients with chronic phase chronic myeloid leukemia not treated with interferon-alpha or imatinib.(在未用a-干扰素或imatinib治疗的患有慢性阶段性 慢性骨髓白血病的病人中正常的固有的Thl/Th2平衡)Haematologica 88:754-761.
10) Lauerova 等，(2002). Malignant melanoma associates with Thl/Th2 imbalance that coincides with disease progression and immunotherapy response.(恶性黑色素瘤与Thl/Th2失衡相关，这与疾 病进程和对免疫疗法的反应一致)Neoplasma 49:159-166.
11) Maggio等，(2002). Chemokines， cytokines and their receptors in Hodgkin，s lymphoma cell lines and tissues.(趋化因子、细胞因子及其 在Hodgkin，s淋巴瘤细胞系和组织中的受体)Ann Oncol 13 Suppl 1:52-56.
12) Nilsson, K(1992). Bum Cell. 5(1):25-41.
13) Podhorecka等，(2002). T type 1/type 2 subsets balance in B-cell chronic lymphocytic leukemia-the three —color flow cytometry analysis. (B
细胞慢性淋巴细胞性白血病中1型和2型T细胞因子亚类的平衡——
三色流式细胞计量分析)Leuk Res 26:657-660.
14) Pu, QQ和Bezwoda， W(2000). Anticancer Res. 20(4):2569-78.
15) Smyth等，(2003). Renal cell carcinoma induces prostaglandin E2 and T-helper type 2 cytokine production in peripheral blood mononuclear cells.(肾细胞癌在外周血单核细胞中诱导了前列腺素E2和辅助性T 细胞2型细胞因子的产生)Ann Surg Oncol 10:455-462.
16) Tatsumi等,(2002). Disease-associated bias in T helper type 1 (Thl)/Th2 CD4(+) T cell responses against MAGE-6 in HLA-DRB1040(+) patients with renal cell carcinoma or melanoma. (在患有肾细胞癌或黑 素瘤的HLA-DRB1040(+)病人中辅助性T细胞1型(Thl)与Th2 CD4(+) T细胞对MAGE-6的反应的比例的偏移与疾病相关)J Exp Med 196:619-628.
17) Walls A V等(1998)' Int. J Cancer 44846-853.
18) Winter 等，(2003). Tumour-induced polarization of tumor vaccine-draining lymph node T cells to a type 1 cytokine profile predicts inherent strong immunogenicity of the tumor and correlates with therapeutic efficacy in adoptive transfer studies.(排出肿瘤疫苗的淋巴 结T细胞受肿瘤诱导的向1型细胞因子谱的偏移预测肿瘤内在的强烈 的免疫原性并与过继性转移研究中的治疗效力相关)Immunology 108:409-419.
应该理解，对于本文描述的实施方案可以进行各种不同的修饰。 例如，本领域的专业技术人员将会认识到，本文描述的具体的序列可 以被轻微地改变而不一定严重地影响被用来结合OX-2/CD200的多 肽、抗体或抗体片段的功能性。例如，通常可以对抗体序列中一个或 多个氨基酸进行取代而不破坏抗体或片段的功能性。因此，应该理解， 与本发明的具体的抗体具有70%以上程度同源性的多肽或抗体都被包 含在本发明的范围之内。在特别有用的实施方案中，与本发明的具体 的抗体具有80%以上同源性的抗体是在本发明的设想之中。在其它有 用的实施方案中，与本发明的具体的抗体具有90%以上同源性的抗体 是在本发明的设想之中。因此，上面的描述将不构成一种限制，而仅 仅是优选实施方案的示例。本领域的专业技术人员将可以在本发明的 范围和精神之内想象出其它的修改方案。
权利要求
1. 一种方法，包括确定在患者中OX-2/CD200是否被上调；以及给患者施用能够与OX-2/CD200或OX-2/CD200受体结合的多肽。
2. 权利要求1中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施用 与OX-2/CD200结合的抗体。
3. 权利要求1中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施用 与OX-2/CD200结合的单克隆抗体。
4. 权利要求1中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施用 与OX-2/CD200受体结合的抗体。
5. 权利要求1中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施用 与OX-2/CD200受体结合的单克隆抗体。
6. 权利要求1中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施用 包含一种或多种选自下列氨基酸序列的多肽SEQ.ID.NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ. ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID.NO:7、 SEQ. ID.NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID.NO:10、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID. NO:15、 SEQ. ID. NO:16、 SEQ. ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID, NO:21 、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
7. —种治疗其中OX-2/CD200被上调的疾病状态的方法，包括给 患有该其中OX-2/CD200被上调的疾病的患者施用能够与OX-2/CD200 或OX-2/CD200受体结合的多肽。
8. 权利要求7中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施用 与OX-2/CD200结合的抗体。
9. 权利要求7中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施用 与OX-2/CD200结合的单克隆抗体。
10. 权利要求7中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施用 与OX-2/CD200受体结合的抗体。
11. 权利要求7中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施用 与OX-2/CD200受体结合的单克隆抗体。
12. 权利要求7中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施用 包含一种或多种选自下列氨基酸序列的多肽SEQ.ID.NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ. ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID. NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID. NO:10、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID.NO:15、 SEQ. ID.NO:16、 SEQ, ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID. NO:21 、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
13. —种治疗癌症的方法，包括确定在患有癌症的患者中OX-2/CD200是否被上调；以及 给患者施用能够与OX-2/CD200或OX-2/CD200受体结合的多肽。
14. 权利要求13中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施 用与OX-2/CD200结合的抗体。
15. 权利要求13中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施 用与OX-2/CD200结合的单克隆抗体。
16. 权利要求13中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施 用与OX-2/CD200受体结合的抗体。
17. 权利要求13中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施 用与OX-2/CD200受体结合的单克隆抗体。
18. 权利要求13中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施 用包含一种或多种选自下列氨基酸序列的多肽SEQ. ID. NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ.ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ.ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID. NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID. NO:IO、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID. NO:15、 SEQ. ID. NO:16、 SEQ.ID. NO: 17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID. NO:21、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
19. 一种治疗CLL的方法，包括确定在患有CLL的患者中OX-2/CD200是否被上调；以及 给患者施用能够与OX-2/CD200或OX-2/CD200受体结合的多肽。
20. 权利要求19中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施 用与OX-2/CD200结合的抗体。
21. 权利要求19中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施 用与OX-2/CD200结合的单克隆抗体。
22. 权利要求19中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施 用与OX-2/CD200受体结合的抗体。
23. 权利要求19中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施 用与OX-2/CD200受体结合的单克隆抗体。
24. 权利要求19中的方法，其中施用多肽的步骤包括给患者施 用包含一种或多种选自下列氨基酸序列的多肽SEQ. ID. NO:l、 SEQ. ID.NO:2、 SEQ. ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID, NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID. NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID. NO:IO、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO: 13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID. NO:15、 SEQ. ID. NO:16、 SEQ. ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID. NO:21 、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
25. —种鉴定抗体所结合的抗原的方法，包括 使用从CLL病人收集的组织制备衍生的抗体的文库； 将文库的一个或多个成员与保藏在ATCC登记号为PTA-3920的细胞系CLL-AAT的裂解液相接触；以及对与文库的至少一个成员结合的抗原进行表征。
26. 权利要求25中的方法， 其中制备文库的步骤包括用CLL细胞或其部分免疫一个生物体。
27. 权利要求25中的方法， 其中制备文库的步骤包括用CLL细胞或细胞系淘洗合成的抗体文库。
28. 权利要求27中的方法， 其中的文库通过噬菌体展示进行筛选以分离文库的成员。
29. 权利要求27中的方法，其中的文库用从一个或多个患有CLL 的病人分离的的初级CLL细胞进行淘洗。
30. 权利要求25中的方法，还包括鉴定抗体文库中与CLL细胞 中被上调的抗原结合的成员的步骤。
31. 权利要求30中的方法，其中抗体文库的成员与OX-2/CD200
32. —种与CLL细胞所上调的抗原结合的抗体。
33. 权利要求32中的抗体，其中的抗原是OX-2/CD200。
34. 权利要求32中的抗体，含有的氨基酸序列与选自下列的序 列具有至少70%的同源性SEQ. ID. NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ. ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID. NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID. NO:IO、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ, ID. NO:15、 SEQ. ID.NO:16、 SEQ.ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID.NO:20、 SEQ. ID. NO:21、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
35. —种鉴定与抗体结合的抗原的方法，包括 使用从保藏在ATCC登记号为PTA-3920的细胞系中的细胞制备衍生的抗体文库；将文库的一个或多个成员与从CLL病人收集的组织中的细胞的 裂解液相接触；以及对与文库的至少一个成员结合的抗原进行表征。
36. —种鉴定与抗体结合的抗原的方法，包括 用从CLL病人收集的组织中的CLL细胞的至少一部分免疫生物体；基于被免疫的动物的免疫反应产生抗体文库； 将文库的一个或多个成员与CLL细胞相接触；以及 对与文库的至少一个成员结合的抗原进行表征。
37. 权利要求36中的方法，其中将文库的一个或多个成员与CLL 细胞相接触的步骤包括将文库的一个或多个成员与从CLL病人收集的 组织中的细胞的裂解液相接触。
38. —种鉴定抗体所结合的抗原的方法，包括 用CLL细胞的至少一部分免疫生物体； 基于被免疫的动物的免疫反应产生抗体文库； 将文库的一个或多个成员与保藏在ATCC登记号为PTA-3920的细胞系CLL-AAT的裂解液相接触；以及对与文库的至少一个成员结合的抗原进行表征。
39. —种治疗癌症的方法，包括施用能够干扰被恶性癌细胞上调 的多肽的代谢途径的抗体。
40. 权利要求39中的方法，其中的抗体与被上调的多肽结合。
41. 权利要求39中的方法，其中的抗体与同被上调的多肽相互 作用的受体结合。
42. 权利要求39中的方法，其中的抗体与调节多肽表达的抗原
43. 权利要求39中的方法，其中的多肽是OX-2/CD200。
44. 权利要求39中的方法，其中的抗体含有的氨基酸序列与选 自下列序列具有至少70%的同源性SEQ.ID.NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ.ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID.NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID. NO:10、 SEQ. ID. NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID. NO:15、 SEQ. ID. NO:16、 SEQ. ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID. NO:21、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
45. —种方法，包括筛选癌症病人以鉴定出那些其中多肽的表达被恶性癌细胞上调的病人；以及给那些被发现有上调的病人施用能够干扰被上调的多肽的代谢途 径的抗体。
46. 权利要求45中的方法，其中筛选病人的步骤包括筛选CLL 病人。
47. 权利要求45中的方法，其中筛选病人的步骤检测OX-2/CD200的上调。
48. 权利要求45中的方法，其中施用抗体的步骤包括施用与 OX-2/CD200结合的抗体。
49. 权利要求45中的方法，其中施用抗体的步骤包括施用与同 OX-2/CD200相互作用的受体结合的抗体。
50. 权利要求45中的方法，其中施用抗体的步骤包括施用与调 节OX-2/CD200的表达的抗原结合的抗体。
51.权利要求45中的方法，其中施用抗体的步骤包括施用的抗 体含有的氨基酸序列与选自下列序列具有至少70%的同源性SEQ. ID. NO:l、 SEQ. ID. NO:2、 SEQ. ID. NO:3、 SEQ. ID. NO:4、 SEQ. ID. NO:5、 SEQ. ID. NO:6、 SEQ. ID. NO:7、 SEQ. ID. NO:8、 SEQ. ID. NO:9、 SEQ. ID.NO:IO、 SEQ. ID.NO:ll、 SEQ. ID. NO:12、 SEQ. ID. NO:13、 SEQ. ID. NO:14、 SEQ. ID. NO:15、 SEQ. ID. NO:16、 SEQ. ID. NO:17、 SEQ. ID. NO:18、 SEQ. ID. NO:19、 SEQ. ID. NO:20、 SEQ. ID. NO:21 、 SEQ. ID. NO:22、 SEQ. ID. NO:23、 SEQ. ID. NO:24和SEQ. ID. NO:25。
全文摘要
本文公开了能够与OX-2/CD200和/或OX-2/CD200受体结合的多肽、包括抗体的使用方法。这些多肽被用于治疗其特征表现为OX-2/CD200水平升高的疾病，包括癌症和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
文档编号C07K16/00GK101384280SQ200480005993
公开日2009年3月11日 申请日期2004年3月4日 优先权日2003年3月4日
发明者凯瑟琳·S·鲍迪什, 安克·克雷茨罗梅尔, 约翰·麦克沃特 申请人:阿莱克森制药公司