免疫球蛋白产生和特应性疾病的调节的制作方法

专利名称：免疫球蛋白产生和特应性疾病的调节的制作方法
相关申请的交叉参考本申请要求2004年5月19日提交的美国申请序号60/572,407的优先权，将所述美国申请的内容通过引用引入本文。
背景对变应原刺激应答产生的IgE触发与特应性疾病有关的强烈激动剂机制。当结合到肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的高亲和性受体时，IgE可以被变应原交联，导致脱粒和释放组胺、白三烯和其他炎症介质。这些物质直接介导与早期和晚期变应性反应有关的喘鸣、支气管收缩和鼻炎的症状，而肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放的细胞因子和趋化因子促进局部炎症反应。检测到与健康对照相比，在特应性受试者中变应原特异的IgE，而且阐明IgE的中和是治疗特应性疾病的有效治疗策略，证明了IgE在这些应答中的中心作用。见，例如，Kawakami和Galli(2002)Nat Rev Immunol 2(10)；773-86；Prussin和Metcalfe(2003)J Allergy Clin Immunol 111(2 Suppl)；S486-94；Holgate(2000)Clin Exp Allergy 30 Suppl 1；28-32；Busse和Neaville，(2001)CurrOpin Allergy Clin Immunol 1(1)；105-8。
概要我们已经发现，IL-21多肽可以针对特应性反应产生保护性环境。因此，IL-21途径激动剂，如IL-21多肽和其他类似地调节IL-21途径的试剂可以用于调节应答变应原暴露产生的IgE和IgG4之间的平衡。例如，IL-21途径激动剂可用于降低受试者中IgE的水平或者产生，减轻特应性疾病的至少一种症状，和/或抑制受试者中IgE的产生。
一方面，本发明描述了减轻受试者中与特应性疾病有关的一种或多种症状的方法。该方法包括对受试者施用IL-21途径激动剂，其用量可有效减轻特应性疾病的一种或多种症状。示例性特应性疾病包括特应性皮炎、哮喘、外源性支气管哮喘、荨麻疹、湿疹、变应性鼻炎和变应性肠胃炎。
术语“IL-21途径”指介导IL-21信号传递的生物学组分。该途径包括，例如，IL-21多肽自身、IL-21受体和受受体激活调节的细胞质组分，包括STAT3和STAT5、激酶、和/或转录因子。术语“IL-21途径激动剂”指增加IL-21途径的活性的试剂，例如，增强、诱导或者加强IL-21受体多肽的一种或多种生物学活性，如本文描述的生物学活性的试剂。例如，激动剂与IL-21受体多肽相互作用，例如，结合IL-21受体多肽。在一个实施方案中，激动剂可以与IL-21受体和另一受体链，例如，γ细胞因子受体链相互作用。例如，激动剂交联IL-21受体和γ细胞因子受体链。
在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是IL-21多肽、其活性片段或者其变体。例如，IL-21多肽以每千克体重约0.1μg到约100μg，约100μg到约5mg或者约5mg到约100mg的剂量施用。IL-21多肽可以是例如人或者基本上人的IL-21多肽。IL-21多肽可以包括SEQID NO2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO2有至少85、90、92、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，IL-21途径激动剂是与IL-21受体相互作用的试剂。与IL-21受体相互作用的试剂可以活化该受体或者激动途径信号传递。例如，IL-21途径激动剂是与IL-21受体相互作用的蛋白质。该蛋白质可以包含激动性抗-IL-21受体抗体(例如，全长抗体或者抗原结合片段)，其与IL-21受体作用并将其激活。
在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是调节细胞质IL-21途径组分的试剂。调节细胞质IL-21途径组分的试剂可以例如，激活积极作用的细胞质途径组分或者抑制消极作用的细胞质组分。示例性积极作用的细胞质途径组分包括STAT激酶。该试剂还可以是积极作用组分的模拟物，例如，STAT激酶的组成性激活的形式。
在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是编码IL-21多肽的核酸、与IL-21受体相互作用(例如，结合和/或激活)的蛋白质，和调节细胞质IL-21途径组分的蛋白质。试剂可以编码积极作用的组分，例如，编码STAT激酶或者STAT激酶的组成性激活形式的核酸。
受试者可以是哺乳动物，通常是人(例如，女性或男性，和成年人或者青少年受试者)。受试者中局部或者全身的IgE水平相对于参照参数降低至少10、20、30、40、50、70、80、85、90、或95％。例如，参照参数可以是受试者治疗前的参数，或者可以是正常的或者对照受试者的参数或者受试者群体(例如，一群正常受试者，例如，具有相似年龄和性别的正常受试者)特征性统计值。
IL-21途径激动剂可以肠胃外或者局部施用。例如，激动剂可以局部递送到特应性皮炎部位。它可以递送到呼吸粘膜，例如，通过吸入例如雾化组合物递送。它可以肠胃外递送，例如，通过注射，如皮下、肌内或者静脉内注射来递送。它可以例如通过植入物或者其他医学装置递送。其他示例性方式在本文公开。
该方法可以还包括例如在施用之前、期间或者之后评价受试者中特应性疾病的一种或多种症状。此类症状的实例在本文公开。该方法可以还包括评估受试者中IL-21相关的参数，例如，与IL-21多肽、IL-21受体或者IL-21途径活性的水平相关的参数。术语“参数”指信息，包括定性的和定量的描述符，例如，值、水平、测量，等等。“IL-21相关的参数”指描述IL-21途径组分的参数，例如，这种组分(例如，IL-21多肽、IL-21受体或者其他细胞质组分)的存在、缺乏、水平、表达、稳定性、亚细胞定位、或者活性。参数还可以描述编码IL-21途径组分的mRNA。
该方法还包括评估受试者中内源免疫球蛋白(例如，IgG或者IgE)，例如，评估内源免疫球蛋白的水平。
该方法还包括本文公开的其他特征。
另一方面，本发明描述了治疗或者预防受试者中特应性疾病的方法，该方法包括对受试者施用IL-21途径激动剂，其用量可有效治疗或者预防特应性疾病。示例性特应性疾病包括特应性皮炎、哮喘、外源性支气管哮喘、荨麻疹、湿疹、变应性鼻炎和变应性肠胃炎。
在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是IL-21多肽。例如，IL-21多肽以每千克体重约0.1μg到约100μg，约100μg到约5mg或者约5mg到约100mg的剂量施用。IL-21多肽可以是例如人或者基本上人的IL-21多肽。IL-21多肽可以包括SEQ ID NO2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO2有至少85、90、92、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是与IL-21受体相互作用的试剂、调节细胞质IL-21途径组分的试剂或者编码IL-21多肽的核酸、与IL-21受体相互作用(例如，激活)的蛋白质，和调节细胞质IL-21途径组分的蛋白质。
受试者可以是哺乳动物，通常是人(例如，女性或男性，和成年人或者青少年受试者)。受试者中局部或者全身的IgE水平相对于参照参数降低至少10、20、30、40、50、70、80、85、90、或95％。例如，参照参数可以是受试者治疗前的参数，或者可以是正常的或者对照受试者的参数或者受试者群体(例如，一群正常受试者，例如，具有相似年龄和性别的正常受试者)特征性统计值。
IL-21途径激动剂可以肠胃外或者局部施用。例如，激动剂可以局部递送到特应性皮炎部位。它可以递送到呼吸粘膜，例如，通过吸入例如雾化组合物递送。它可以肠胃外递送，例如，通过注射，如皮下、肌内或者静脉内注射来递送。它可以例如通过植入物或者其他医学装置递送。其他示例性方式在本文公开。
该方法可以包括本文描述的其他特征。
一方面，本发明描述了调节细胞(例如，B细胞，例如哺乳动物，例如，人、鼠或者其他啮齿动物细胞)中IgG的产生的方法。该方法包括将IL-21途径调节剂以足够调节IgG产生(例如，从细胞表达或者分泌)的量施用于细胞。在接触步骤期间细胞可以是体外或者体内的。例如，体内接触可以在哺乳动物受试者，例如人类受试者中进行。
在一个实施方案中，IgG产生增加并且IL-21途径调节剂是IL-21途径激动剂，例如，IL-21多肽、与IL-21受体相互作用的试剂，或者调节细胞质IL-21途径组分的试剂。IgG水平可以相对于参照参数增加例如至少10、20、30、40、50、70、80、100、120或150％。例如，参照参数可以是受试者治疗前的参数，或者可以是正常的或者对照受试者的参数或者受试者群体(例如，一群正常受试者，例如，具有相似年龄和性别的正常受试者)特征性统计值。
在另一个实施方案中，IgG产生减少并且IL-21途径调节剂是IL-21途径拮抗剂。IgG水平可以相对于参照参数(例如，参照参数可以是受试者治疗前的参数，或者可以是正常的或者对照受试者的参数或者受试者群体(例如，一群正常受试者，例如，具有相似年龄和性别的正常受试者)特征性统计值)减少例如至少10、20、30、40、50、70、80、85、90或者95％。
在第一个实例中，拮抗剂是结合IL-21或者IL-21受体的试剂，如抗体或者其抗原结合片段或者包括IL-21受体的可溶形式的试剂，如其细胞外结构域(例如，仅仅细胞外结构域或者融合物，如Fc融合物)。在第二个实例中，IL-21途径拮抗剂是结合IL-21受体的组分的试剂，例如，该试剂防止IL-21受体的激活。结合IL-21受体并且防止IL-21与所述受体结合的抗体是具有这些性质的试剂。在第三个实例中，IL-21途径拮抗剂是减少IL-21、IL-21受体或者IL-21途径组分的表达的核酸(例如，反义RNA、siRNA或者核酶)。
该方法可以包括本文描述的其他特征。
另一方面，本发明描述了调节细胞中IgE产生的方法。该方法包括将IL-21途径调节剂以足够调节IgE产生的量接触细胞。术语“IL-21途径调节剂”指改变IL-21途径的活性的试剂并且包括IL-21途径激动剂和拮抗剂。
在一个实施方案中，IgE产生减少并且IL-21途径调节剂是IL-21途径激动剂，例如，本文描述的激动剂，例如，IL-21多肽。例如，IgE水平相对于参照参数(例如，受试者治疗前的参数，或者可以是正常的或者对照受试者的参数或者受试者群体(例如，一群正常受试者，例如，具有相似年龄和性别的正常受试者)特征性统计值)减少至少10、20、30、40、50、70、80、85、90或者95％。
在另一个实施方案中，IgE产生增加并且IL-21途径调节剂是IL-21途径拮抗剂，例如，本文描述的拮抗剂。例如，所述水平相对于参照参数(例如，受试者治疗前的参数，或者可以是正常的或者对照受试者的参数或者受试者群体(例如，一群正常受试者，例如，具有相似年龄和性别的正常受试者)特征性统计值)增加至少10、20、30、40、50、70、80、100、120或150％。该方法可以包括本文描述的其他特征。
另一方面，本发明描述了调节IgE和IgG的相对水平的方法，该方法包括将IL-21途径调节剂以足够调节IgE和IgG的相对水平的量接触细胞。
在一个实施方案中，IgE/IgG比率减小并且IL-21途径调节剂是IL-21途径激动剂，例如，本文描述的激动剂，例如，IL-21多肽。例如，该比率相对于参照比率(例如，受试者治疗前的比率，或者可以是正常的或者对照受试者的比率或者受试者群体(例如，一群正常受试者，例如，具有相似年龄和性别的正常受试者)特征性统计值)减少至少10、20、30、40、50、70、80、85、90或者95％。
在另一个实施方案中，IgE/IgG比率增加并且IL-21途径调节剂是IL-21途径拮抗剂，例如，本文描述的拮抗剂。例如，该比率相对于参照比率(例如，受试者治疗前的比率，或者可以是正常的或者对照受试者的比率或者受试者群体(例如，一群正常受试者，例如，具有相似年龄和性别的正常受试者)特征性统计值)增加至少10、20、30、40、50、70、80、100、120或150％。
通过抑制Iε转录物所需的转换重组，可以调节IgE和IgG的相对水平。还可以在T细胞存在下调节这些相对水平。
再一方面，本发明描述了药物组合物，其包含IL-21途径激动剂和用于治疗特应性疾病的另一种试剂。在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是IL-21多肽。例如，IL-21多肽以每千克体重约0.1μg到约100μg，约100μg到约5mg或者约5mg到约100mg的剂量施用。IL-21多肽可以是例如人或者基本上人的IL-21多肽。IL-21多肽可以包括SEQ ID NO2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO2有至少85、90、92、94、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是与IL-21受体相互作用的试剂，调节细胞质IL-21途径组分的试剂或者编码IL-21多肽的核酸，与IL-21受体相互作用(例如，激活)的蛋白质，和调节细胞质IL-21途径组分的蛋白质。
在另一方面，本发明描述了包括IL-21途径激动剂的药物组合物的一剂或者多剂和标记的容器，该标记包括施用一剂组合物用于治疗或者预防变应性疾病或者疾病的说明书。在一个实施方案中，该组合物包括用于治疗变应性疾病的第二种试剂。
本发明还包括生产药物的方法。该方法包括提供IL-21途径激动剂并将激动剂包装在容器中。该方法还包括将标记(例如，包括治疗或者预防变应性疾病或者疾病的说明书的标记)与容器结合(例如，固定)。在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是IL-21多肽。该方法可以包括重组表达IL-21多肽和至少部分纯化所述多肽。
另一方面，本发明描述了评估患有或者怀疑患有特应性疾病的受试者的方法，所述特应性疾病为例如，特应性皮炎、哮喘、外源性支气管哮喘、荨麻疹、湿疹、变应性鼻炎和变应性肠胃炎。该方法包括评估患有特应性疾病的受试者的IL-21相关的参数，将评估结果与参照参数比较，并根据比较的结果提供该疾病的治疗建议。“参照参数”指来自参照受试者或者细胞，例如，对照、正常的、或者野生型受试者或者细胞的对应信息。参照参数还可以是个体的对照组或者正常组的平均值或者中值。例如，IL-21相关的参数包括IL-21多肽丰度或者IL-21 mRNA丰度的定量或者定性值。在另一实例中，IL-21相关的参数包括IL-21受体蛋白质或者mRNA或者IL-21途径活性的定量或者定性值。推荐的疗法可以包括使用IL-21途径激动剂，例如，IL-21多肽。该方法可以包括本文描述的其他特征。
另一方面，本发明描述了评估受试者的特应性疾病风险的方法。该方法包括为受试者评估IL-21相关的参数，比较评估结果和参照参数，并根据比较结果提供特应性疾病的风险评定。例如，风险评定可以是评估的参数和参照参数之间偏差的函数。在一个实施方案中，风险评定表达为标准的标准差数。该方法包括本文描述的其他特征。
除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域技术人员通常的理解相同的含义。尽管在本发明的实践和试验中可以使用与本文描述的相似或者等同的方法和材料，但是下面描述适宜的方法和材料。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都完整通过引用引入本文。将2004年3月22日申请的美国申请序号，和US 2003-0108549完整通过引用引入本文。对于冲突的情况，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅用来阐明并且不意在限制。
附图描述

图1.IL-21加强从纯化的B细胞释放的IgE和IgG4。通过磁珠分离从人PBMC分离B细胞。将细胞用如“材料和方法”中描述的抗-CD40加上所指出的细胞因子处理。在第6天，收获细胞和上清液。(A，B)各微孔的上清液中IgE水平。(C)GAPDH、Iε无菌转录物和Iy4无菌转录物表达的PCR。(D)合并的孔中用所示细胞因子处理的IgG4水平。在仅用抗-CD40处理的细胞中没有检测到IgG4。
图2.IL-21与IL-4或者IL-13协同驱动B细胞增殖。通过磁珠分离从人PBMC分离B细胞。将细胞用抗CD40加上所示细胞因子处理48小时。在最后的24小时加入3H胸苷，并通过液体闪烁计数测定掺入。
图3.IL-21加强IgE和IgG4从抗-CD40刺激的PBMC的释放。将未分级分离的人PBMC用抗-CD40加上所示细胞因子处理，如“材料和方法”中描述。(A)在培养21天时测定的各微孔的上清液中IgE水平。仅用IL-21处理的孔中没有检测到IgE。(B)在培养21天时测定的用所指出的细胞因子处理的合并的孔中IgE水平。(C)用在培养3天时分离的细胞进行Iε和Iγ4无菌转录物的PCR。用第10天分离的细胞进行Cε成熟转录物的PCR。(D)在培养21天时测定的用所指示的细胞因子处理的合并的孔中IgG4水平。
图4.IL-21抑制IgE产生但是不抑制PHA刺激的PBMC中IgG4释放。用PHA和细胞因子处理未分级分离的人PBMC。(A)在培养21天时测定的各微孔的上清液中IgE水平。(B)在培养21天时测定的用所指出的细胞因子处理的合并的孔中IgE水平。(C)用在培养3天时分离的细胞进行Iε和Iγ4无菌转录物的PCR。(D)在培养21天时测定的用所指示的细胞因子处理的合并的孔中IgG4水平。
图5(A，B)显示了如下文描述的CD40L表达的改变。
图6.PBMC培养物中细胞因子水平。(A)将未分级分离的PBMC如用“材料和方法”中描述的PHA和所示细胞因子处理。测定培养7天时收集的合并的上清液中IL-10水平。(B)未分级分离的人PBMC用抗-CD40加上所指示的细胞因子处理48小时。在第2天和之后每4天，改变培养基并加入新鲜细胞因子。测量第7天时收集的合并的上清液中IL-10水平。(C)将PHA刺激的PBMC用所指出的细胞因子处理。测量培养6天时收集的合并的上清液中IL-12水平。(D)PHA刺激的PBMC用所指出的细胞因子处理。通过实时PCR定量培养6天时收集的细胞中IL-12Rb转录物。数据表达为相对TAQMANTM单位(RTU)。
图7显示了如下文描述的凋亡的CD19+细胞数目的改变。未分级分离的人PBMC用PHA和细胞因子处理。在培养14天时测定用所指出的细胞因子处理的合并的孔中测定IgE水平。(A)IL-21和IL-13对IL-4驱动的IgE产生的影响。(B)IL-21和IL-4对IL-13驱动的IgE产生的影响。
图9显示了在多种条件下IgE水平的改变。
图10.IL-21不降低经辐射的PBMC中IgE产生。未分级分离的PBMC为(A)经辐射的；或者(B)未辐射的。将细胞用PHA在37℃刺激2天，然后用IL-4+/-IL-21处理，如“材料和方法”中描述。测量在培养13天时收集的合并的上清液中IgE水平。数据表达为在IL-4刺激的培养物中发现的IgE水平的百分数。
发明详述IL-21是调节免疫细胞行为的细胞因子。我们已经发现IL-21可以用于调节IgE的产生。IgE导致的反应性造成多种疾病，包括特应性疾病(atopic disorders)。IL-21多肽或者类似作用的IL-21途径激动剂可以用于例如局部或者全身地降低受试者中的IgE水平，从而减轻特应性疾病。
IL-21途径激动剂在本发明的一方面，IL-21途径激动剂(pathway agonist)用于调节免疫系统，例如，以治疗、预防或者减轻特应性疾病。示例性IL-21途径激动剂包括IL-21多肽、IL-21受体、激活或者激动IL-21受体的试剂，和调节其他IL-21途径组分以激活IL-21途径信号传递的试剂(agent)。示例性激动剂以高亲和性，例如，以小于约107M-1，约108M-1，或约109M-1到1010M-1或更强的亲和常数结合IL-21多肽或者IL-21受体。
示例性IL-21途径组分包括IL-21多肽、IL-21受体、受体β链、常见的γ细胞因子链，和细胞内信号传递组分，如Jak1、Jak3、STAT1、STAT3和STAT5。
IL-21人IL-21细胞因子的成熟形式长约131个氨基酸并且与IL-2、IL-4和IL-15有序列同源性(Parrish-Novak et al.(2000)Nature 40857-63)。尽管白介素细胞因子间存在低的序列同源性，但是这些细胞因子和IL-21具有共同的折叠，该折叠包括特征性的“四螺旋束”结构。
IL-21多肽的氨基酸序列是公知的。例如，人IL-21的核苷酸序列和氨基酸序列可以在GENBANKAcc.No.X 011082获得。下面给出示例性的公开的人IL-21核苷酸序列1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc61 tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca121 caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat181 tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga241 agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa301 gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaaagctgaagag361 gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacatgcccttcatg421 tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca481 aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc541 taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg601 tattccaagt ggaggag(SEQ ID NO1)额外的核苷酸序列信息可以例如从AF254069[gi11093535]获得，其提供了编码示例性IL-21多肽的642bp mRNA序列。在一些实施方案中，使用编码成熟IL-21的核苷酸序列的区域(例如，没有编码信号序列的区域)是足够的。基于Parrish-Novak et al.(2000)Nature40857-63，下面给出示例性成熟的人IL-21多肽的氨基酸序列QDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ ID NO2)示例性人IL-21多肽的全长序列为MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS(SEQ ID NO9)提供人IL-21多肽的氨基酸序列的额外条目如下
gi|11141875|ref|NP_068575.1|白介素21[Homo sapiens]；gi|11093536|gb|AAG29348.1|白介素21[Homo sapiens]；gi|42542586|gb|AAH66259.1|白介素21[Homo sapiens]；gi|42542588|gb|AAH66260.1|白介素21[Homo sapiens]；gi|42542657|gb|AAH66261.1|白介素21[Homo sapiens]；gi|42542659|gb|AAH66258.1|白介素21[Homo sapiens]；和gi|42542807|gb|AAH66262.1|白介素21[Homo sapiens]。人IL-21多肽可以是本文描述的多肽的变体，条件是它保留功能性。
来自其他物种的示例性IL-21多肽包括下面的鹿鼠(Peromyscus maniculatus)的白介素-21VVIFLGTVAHKTSPQRPDRLLIRLRHLVDNVEQLKIYVNDLDPELLPAPQDVKEHCAHSAFACFQKAKLKPANTGSNKTIISDLVTQLRRRLPATKAEKKQQSLVKCPSCDSYEKKTPKEFLE(SEQ IDNO10)小鼠(Mus musculus)的白介素-21PDRLLIRLRHLIDIVEQLKIYENDLDPELLSAPQDVKGHCEHAAFACFQKAKLKPSNPGNNKTFIIDLVAQLRRRLPARRGGKKQKHIAKCPSCDSYEKRTPKEFLERLK WLLQKMIHQHLS(SEQ ID NO4，成熟形式)，MERTLVCLVVIFLGTVAHKSSPQGPDRLLIRLRHLIDIVEQLKIYENDLDPELLSAPQDVKGHCEHAAFACFQKAKLKPSNPGNNKTFIIDLVAQLRRRLPARRGGKKQKHIAKCPSCDSYEKRTPKEFLERLKWLLQKMIHQHLS(SEQ ID NO11，全长)牛(Bos taurus)的白介素-21MRWPGNMERIVICLMVIFSGTVAHKSSSQGQDRLFIRLRQLIDIVDQLKNYVNDLDPEFLPAPEDVKRHCERSAFSCFQKVQLKSANNGDNEKIINILTKQLKRKLPATNTGRRQKHEVTCPSCDSYEKKPPKEYLERLKSLIQKMIHQHLS(SEQ ID NO12)
术语“白介素-21”、“IL-21”和“IL-21多肽”指一种蛋白质(例如，哺乳动物，例如，鼠或者人蛋白质)，其能够与IL-21受体(例如，哺乳动物，例如，鼠或者人蛋白质)相互作用(例如，结合)并且具有下列特征之一(i)天然发生的哺乳动物IL-21的氨基酸序列或者其片段，例如，如SEQ ID NO2(人，成熟的)、SEQ ID NO9(人，全长)、SEQID NO10(鹿鼠)、SEQ ID NO12(牛)、SEQ ID NO4(鼠，成熟的)或SEQ ID NO11(鼠，全长)所示的氨基酸序列或者其片段；(ii)与SEQ IDNO2(人，成熟的)、SEQ ID NO9(人，全长)、SEQ ID NO10(鹿鼠)、SEQ ID NO12(牛)、SEQ ID NO4(鼠，成熟的)或SEQ ID NO11(鼠，全长)所示的氨基酸序列或者其片段基本上同源，例如，至少85％、90％、95％、98％、99％同源的氨基酸序列；(iii)天然发生的哺乳动物IL-21多核苷酸序列或者其片段(例如，SEQ ID NO1(人)或者SEQID NO3(鼠)，或者其片段，例如，编码成熟形式的区域)编码的氨基酸序列；(iv)与SEQ ID NO1(人)或者SEQ ID NO3(鼠)所示核苷酸序列，或者其片段(例如，编码成熟形式的区域)基本上同源，例如，至少85％、90％、95％、98％、99％同源的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(v)天然发生的IL-21核苷酸序列或者其片段，例如，SEQ IDNO1(人)或者SEQ ID NO3(鼠)，或者其片段(例如，编码成熟形式的区域)的简并核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者(vi)在严格条件，例如，高严格条件下与前面的核苷酸序列之一的互补序列杂交的核苷酸序列(例如，该核苷酸序列在编码成熟IL-21蛋白质的区域杂交)编码的至少115个氨基酸的氨基酸序列。IL-21结合IL-21受体可以导致STAT5或者STAT3信号传递(Ozaki et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711439-11444)。可以将IL-21多肽从包括信号序列的初生蛋白加工成已经除去信号序列的成熟蛋白质。
类似或者同源于(例如，至少约85％序列同一性)本文公开的序列的序列是本申请的部分。在一些实施方案中，序列同一性可以为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高。备选地，当在选择性杂交条件(例如，高度严格的杂交条件)下，核酸片段与链的互补序列杂交时，存在基本上的同一性(substantialidentity)。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或者以部分纯化的或者基本上纯的形式存在。
如下进行两种序列之间“同源性”或者“序列同一性”的计算(本文的这两个术语可以互换使用)。为了最佳比较目的对序列进行比对(例如，为了最佳比对，可以在第一个和第二个氨基酸或者核酸序列的一个或两个序列中引入缺口，并且为了比较目的，可以不考虑非同源序列)。在优选实施方案中，为了比较目的排列的参照序列的长度为该参照序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后比较对应的氨基酸位置或者核苷酸位置上的氨基酸残基或者核苷酸。当第一条序列中的一个位置被第二条序列中对应位置上相同的氨基酸残基或者核苷酸占据时，这两种分子在那个位置上是同一的(如本文所用的氨基酸或者核酸“同一性”等同于氨基酸或者核酸“同源性”)。两条序列之间的同一性百分数是这两条序列共有的相同位置数目的函数，考虑缺口的数目及每个缺口的长度，需要导入所述缺口用于最佳地比对两条序列。
可以用数学算法完成两条序列之间序列的比较和同一性百分数的确定。该比较使用GCG软件包(www.gcg.com)的GAP程序和参数，其包括Blossum 62打分矩阵，缺口罚分为12，缺口延伸罚分为4，移码缺口罚分为5。
本文所用术语“在严格条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。严格条件是本领域技术人员已知的并且可以参见Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。水性和非水性方法在该参考文献中描述并且可以使用任一种方法。严格杂交条件的优选的实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下杂交，然后在0.2X SSC，0.1％SDS，50℃下洗涤一次或多次。严格杂交条件的另一实例是在6XSSC中约45℃下杂交，然后在0.2X SSC，0.1％SDS，55℃下洗涤一次或多次。严格杂交条件的另一实例是在6XSSC中约45℃下杂交，然后在0.2X SSC，0.1％SDS中60℃下洗涤一次或多次。优选地，严格杂交条件是在6XSSC中约45℃下杂交，然后在0.2X SSC，0.1％SDS，65℃下洗涤一次或多次。尤其优选的高严格条件(以及，如果实验人员不确定应用什么条件来确定分子是否在杂交界限内时，应该使用的条件)是0.5M磷酸钠，7％SDS，65℃下，然后在0.2X SSC，1％SDS，65℃下洗涤一次或多次。
IL-21多肽可以有额外的保守或者非必需氨基酸替代，其对它们的功能没有实质影响。“保守氨基酸替代”是其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸替代。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分枝侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在一个实施方案中，IL-21多肽是基本上人的。“基本上人的”IL-21多肽是这样的IL-21多肽，其包括足够数目的人氨基酸位置，从而该多肽在正常人体中不引起免疫原性应答并且从而IL-21多肽与人IL-21受体相互作用。
本文描述的方法和组合物中可以使用小于全长的IL-21多肽形式，条件是这种形式保留结合IL-21受体的能力。在一个实施方案中，所述形式是有功能的IL-21多肽，例如，可激活IL-21途径信号传递的形式。
例如，通过在宿主细胞中表达编码全长IL-21蛋白质的多核苷酸的对应片段，或者通过表达编码经修饰的蛋白质的多核苷酸(例如，如果除去一个或多个内部氨基酸)，可以产生小于全长的IL-21多肽。小于全长的IL-21多肽的一种形式是成熟IL-21，例如，SEQ ID NO2的IL-21。另一种形式是小于全长、成熟IL-21的多肽，例如，长度小于131、130、129、128或125个氨基酸，例如，115到130个氨基酸。例如，衍生自SEQ ID NO2的IL-21多肽可以缺少最后的8个氨基酸，或者其子集，例如，IL-21多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸1-122。对应的多核苷酸片段也可以用于本文描述的方法和组合物中。上述修饰的多核苷酸可以通过标准分子生物学技术制备，所述技术包括构建合适的所希望的缺失突变体、定点诱变方法或者通过使用合适的寡核苷酸引物进行聚合酶链式反应。
可以标记IL-21多肽。例如，当施用于受试者时，经标记的多肽可以用于监视受试者中该多肽的水平。类似地，经标记的多肽可以用于监视受试者中该多肽的分布，例如，通过对受试者成像。多肽可以放射性标记或者用MRI-可检测的标记物标记。示例性放射标记物包括131I、111In、123I、99mTc、32p、125I、3H、14C和188Rh。示例性MRI-可检测的标记物包括造影剂，如磁性剂、顺磁剂(其主要改变T1)和铁磁或者超顺磁剂(其主要改变T2应答)。可以用螯合剂(例如，EDTA、DTPA和NTA螯合剂)来附着某些顺磁物质(例如，Fe+3、Mn+2、Gd+3)(和减小其毒性)。还可以附着NMR活性原子，如19F原子。
在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是融合蛋白，其包括(i)成熟IL-21多肽，例如，人或者鼠IL-21多肽，或者其片段和(ii)第二个部分，例如，多肽，如Fc结构域或者纯化标签。本文所用的“融合蛋白”是指含有两个或多个可操作地结合，如连接，的部分，例如，蛋白质部分的蛋白质。优选地，所述部分是共价结合的。所述部分可以直接结合，或者通过间隔臂或者连接体连接。IL-21融合蛋白的额外描述见2004年3月22日申请的美国申请序号10/806,611。
IL-21受体多数细胞因子结合I类或者II类细胞因子受体。II类细胞因子受体包括IL-10和干扰素的受体，而I类细胞因子受体包括IL-2、IL-7、IL-9、IL-11-13和IL-15的受体，以及造血生长因子、凝集素和生长激素的受体(Cosman(1993)CYtokine 595-106)。
人IL-21受体是淋巴样细胞，尤其NK细胞、B细胞和T细胞表达的I类细胞因子受体(Parrish-Novak et al.(2000)上文)。编码人白介素-21(IL-21)和其受体(IL-21R)的示例性核酸序列以及对应的氨基酸序列描述于WO 00/53761，WO 01/85792，Parrish-Novak et al.(2000)上文，和Ozaki et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711439-11444。IL-21受体显示出与IL-21受体β链和IL-4受体α链的高度序列同源性(Ozaki et al.(2000)上文)。当配体结合时，IL-21受体结合IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13和IL-15的受体共有的共同γ细胞因子受体链(γc)(Ozaki et al.(2000)上文；Asao et al.(2001)J.Immunol.1671-5)。
术语“MU-1”、“MU-1蛋白质”、“白介素-21受体”或者“IL-21R”指这样的受体(例如，哺乳动物，例如，鼠或者人来源的)，其能够与IL-21(例如，哺乳动物的，例如，鼠或者人IL-21)相互作用，例如，结合，并且具有如下特征之一(i)天然发生的哺乳动物IL-21受体的氨基酸序列或者其片段，例如，如SEQ ID NO6(人)或SEQ ID NO8(鼠)所示的氨基酸序列或者其片段(例如，成熟区)；(ii)与SEQ ID NO6(人)或SEQ ID NO8(鼠)所示的氨基酸序列或者其片段(例如，成熟区)基本上同源，例如，至少85％、90％、95％、98％、99％同源的氨基酸序列；(iii)天然发生的哺乳动物IL-21受体核苷酸序列(例如，SEQ IDNO5(人)或者SEQ ID NO7(鼠))或者其片段(例如，成熟区)编码的氨基酸序列；(iv)与SEQ ID NO5(人)或者SEQ ID NO7(鼠)所示核苷酸序列基本上同源，例如，至少85％、90％、95％、98％、99％同源的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或者其片段(例如，成熟区)；(v)天然发生的IL-21受体核苷酸序列或者其片段，例如，SEQ ID NO5(人)或者SEQ ID NO7(鼠)，或者其片段(例如，成熟区)的简并核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者(vi)在严格条件，例如，高严格条件下与前面的核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列编码的至少450个氨基酸的氨基酸序列。SEQ ID NO6中列出的人IL-21受体的成熟区为约氨基酸20-538。可以使用的示例性胞外域片段包括约氨基酸20-218或者20-232。
下面是人IL-21受体的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO6)MPRGWAAPLL LLLLQGGWGC PDLVCYTDYL QTVICILEMWNLHPSTLTLT WQDQYEELKD 60EATSCSLHRS AHNATHATYT CHMDVFHFMA DDIFSVNITDQSGNYSQECG SFLLAESIKP 120APPFNVTVTF SGQYNISWRS DYEDPAFYML KGKLQYELQYRNRGDPWAVS PRRKLISVDS 180RSVSLLPLEF RKDSSYELQV RAGPMPGSSY QGTWSEWSDPVIFQTQSEEL KEGWNPHLLL 240LLLLVIVFIP AFWSLKTHPL WRLWKKIWAV PSPERFFMPLYKGCSGDFKK WVGAPFTGSS 300LELGPWSPEV PSTLEVYSCH PPRSPAKRLQ LTELQEPAELVESDGVPKPS FWPTAQNSGG 360SAYSEERDRP YGLVSIDTVT VLDAEGPCTW PCSCEDDGYPALDLDAGLEP SPGLEDPLLD 420AGTTVLSCGC VSAGSPGLGG PLGSLLDRLK PPLADGEDWAGGLPWGGRSP GGVSESEAGS 480PLAGLDMDTF DSGFVGSDCS SPVECDFTSP GDEGPPRSYLRQWVVIPPPL SSPGPQAS 538下面是鼠IL-21受体的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO8)MPRGPVAALL LLILHGAWSC LDLTCYTDYL WTITCVLETRSPNPSILSLT WQDEYEELQD 60QETFCSLHRS GHNTTHIWYT CHMRLSQFLS DEVFIVNVTDQSGNNSQECG SFVLAESIKP 120APPLNVTVAF SGRYDISWDS AYDEPSNYVL RGKLQYELQYRNLRDPYAVR PVTKLISVDS 180RNVSLLPEEF HKDSSYQLQV RAAPQPGTSF RGTWSEWSDPVIFQTQAGEP EAGWDPHMLL 240LLAVLIIVLV FMGLKIHLPW RLWKKIWAPV PTPESFFQPLYREHSGNFKK WVNTPFTASS 300IELVPQSSTT TSALHLSLYP AKEKKFPGLP GLEEQLECDGMSEPGHWCII PLAAGQAVSA 360YSEERDRPYG LVSIDTVTVG DAEGLCVWPC SCEDDGYPAMNLDAGRESGP NSEDLLLVTD 420PAFLSCGCVS GSGLRLGGSP GSLLDRLRLS FAKEGDWTADPTWRTGSPGG GSESEAGSPP 480GLDMDTFDSG FAGSDCGSPV ETDEGPPRSY LRQWVVRTPPPVDSGAQSS 529示例性IL-21R/MU-1cDNA在1998年3月10日保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC 98687。IL-21受体可以有额外的保守或者非必需氨基酸替代，其对它们的功能无实质性影响，例如，本文描述的替代。
IL-21受体是I类细胞因子家族受体，也称作NILR(WO 01/85792；Parrish-Novak et al.(2000)Nature 40857-63；Ozaki et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711439-11444)。IL-21受体在淋巴组织中表达。IL-21受体与IL-2和IL-15受体共有的β链，以及IL-4受体α链同源(Ozaki et al.(2000)上文)。当配体结合时，IL-21R/MU-1能够与共有的γ细胞因子受体链(γc)相互作用(Asao et al.(2001)J.Immunol.1671-5)，并且诱导STAT1和STAT3的磷酸化(Asao et al.(2001)J.Immunol.1671-5或者STAT5的磷酸化(Ozaki et al.(2000)。术语“IL-21受体复合体”指蛋白质复合体，其包括IL-21受体和至少一种额外的细胞结合的蛋白质组分，例如，β链或者共有的γ细胞因子受体链。通常，IL-21受体复合体包括IL-21受体、β链和共有的γ细胞因子受体链(commonγcytokine receptor chain)。
短语IL-21受体的“生物活性”指对应的成熟IL-21受体的一种或多种生物活性，包括，但不限于，(1)与IL-21多肽(例如，人IL-21多肽)相互作用，例如结合；(2)结合信号转导分子，例如，γc，jak1；(3)刺激STAT蛋白质，例如，STAT5和/或STAT3的磷酸化和/或活化；和/或(4)调节，例如，刺激或者减小免疫细胞，例如，T细胞(CD8+、CD4+T细胞)、NK细胞、B细胞、巨噬细胞和巨核细胞)的增殖、分化、激动细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子分泌和/或存活。
额外的示例性IL-21途径激动剂在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是与IL-21受体相互作用但是不同于IL-21多肽的试剂。例如，该试剂可以是免疫球蛋白，例如，全长抗体或者抗体片段，其与IL-21受体相互作用并且激活IL-21途径信号传递活性，例如，通过激动该受体来激活。
在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是与IL-21受体和另一种受体亚基，例如，γc相互作用的试剂。例如，试剂可以是与IL-21受体和另一种受体亚基，例如，γc相互作用的蛋白质。该蛋白质可以是例如，双特异性抗体，其包括与IL-21受体相互作用的一个抗原结合位点和与γc相互作用的另一抗原结合位点。此类蛋白质的结合可以用于交联和激动受体，例如，激活或增加STAT3或者STAT5信号传递。
在一个实施方案中，IL-21途径激动剂是例如通过结合IL-21和IL-21受体之一或者两者，稳定IL-21/IL-21R相互作用的试剂(例如，免疫球蛋白)。
例如，用本领域已知的方法，通过筛选蛋白质文库、化学文库、工程化和设计，或者评估受试化合物例如对IL-21受体的结合和/或激活，可以鉴定IL-21途径激动剂。使用所希望的固定化或未固定化的结合蛋白质进行结合测定是本领域已知的并且可以使用本文描述的IL-21受体蛋白质用于该目的。基于纯化的细胞或者基于蛋白质(无细胞)的筛选测定法可以用于鉴定此类激动剂。例如，IL-21受体蛋白质可以以纯化形式固定在载体上，并且可以测量纯化的IL-21受体蛋白质的结合配体或潜在配体。用于评估IL-21受体活性和STAT(例如，STAT1、STAT3或STAT5)信号传递的基于细胞的测定法是已知的。实例在本文和Asao et al.(2001)J.Immunol.1671-5，Ozaki et a1.(2000)上文，2004年3月22日申请的USSN 10/806,611和US 2003-0108549中描述。
IL-21途径拮抗剂在本发明的另一方面，IL-21途径拮抗剂可以用于增加IgE产生和/或减少IgG产生。“IL-21途径拮抗剂”是减小IL-21途径信号传递的试剂。例如，这种试剂可以减小IL-21受体活性。
示例性IL-21途径拮抗剂包括结合IL-21或者IL-21受体的试剂。结合IL-21的抗体可以防止IL-21与IL-21受体作用或者防止激活IL-21受体。另一种结合IL-21并且可以作为途径拮抗剂的试剂是IL-21受体的可溶形式，例如，IL-21受体胞外域，或者足够与IL-21相互作用的受体的其他区域。在一个实施方案中，所述试剂是Fc融合蛋白，其包括Fc结构域和足够与IL-21相互作用的受体的区域。结合IL-21受体的抗体还可以作为途径拮抗剂。这种抗体可以防止IL-21与所述受体相互作用或激活该受体。
其他途径拮抗剂包括细胞质信号传递组分的小分子抑制剂，例如，STAT3和STAT5的小分子抑制剂。下文描述了可以作为途径拮抗剂的核酸分子。
免疫球蛋白免疫球蛋白分子可以用于调节IL-21途径活性。例如，一类免疫球蛋白分子包括结合IL-21受体并增加IL-21途径活性的分子。另一个代表性类别的免疫球蛋白分子包括结合IL-21多肽或者IL-21受体并减小IL-21途径活性的分子。
典型的免疫球蛋白是抗体。本文所用术语“抗体”指包含至少一个，优选两个重(H)链可变结构域(简写为VH)，和至少一个并且优选两个轻(L)链可变结构域(简写为VL)的蛋白质。VH和VL结构域可以进一步细分为高变区，称作“互补性决定区域”(“CDR”)，其散布着更保守的区域，称作“构架区”(FR)。构架区和CDR的范围已经精确定义(见，Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242，和Chothia，C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196901-917，将它们通过引用引入本文)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。Camelid抗体可以包括单个可变免疫球蛋白结构域。
抗体可以还包括重链和轻链恒定区，从而分别形成重和轻免疫球蛋白链。在一个实施方案中，抗体是两条重免疫球蛋白链和两条轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重和轻免疫球蛋白链通过例如二硫键互联。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包含一个结构域CL。重链和轻链的可变结构域含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或者因子的结合，所述宿主组织或者因子包括免疫系统的多种细胞(例如，激动剂细胞)和经典补体系统的第一种组分(Clq)。
本文所用术语“免疫球蛋白”指一种蛋白质，其包括具有形成免疫球蛋白折叠的结构域的一种或多种多肽。免疫球蛋白结构域大致为圆柱体(约4×2.5×2.5nm)，具有两个延伸的蛋白质层一层含有三股多肽链，另一层含有四股多肽链。在每层中，相邻链是反平行的并且形成β-片层。两层大致平行并且通常通过一个链内二硫键连接。
免疫球蛋白可以包括免疫球蛋白基因编码的区域。公认的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白基因和基因节段。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或者214个氨基酸)由NH2末端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH末端的κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或者446个氨基酸)由可变区基因(约116个氨基酸)和其他前述恒定区基因之一，例如γ(编码约330个氨基酸)类似地编码。本文所用的“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。
本文所用术语抗体的“抗原结合片段”(或者简称为“抗体部分”或者“片段”)指全长抗体的一个或多个片段，其保留特异结合抗原(例如，IL-21受体)的能力。术语抗体的“抗原结合片段”包括的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，其是包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Wardet al.，(1989)Nature 341544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补性决定区域(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是它们可以用重组方法通过合成的连接体连接，所述连接体使得VL和VH成为单个蛋白质链，其中VL和VH结构域配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；见例如，Bird et al.(1988)Science 242423-426；和Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。此类单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合片段”内。用本领域技术人员已知的常规技术得到这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。“基本上人的”免疫球蛋白可变结构域是包括足够数目的人构架氨基酸位置从而该免疫球蛋白可变结构域不在正常人体引起免疫原性应答的免疫球蛋白可变结构域。“基本上人的”抗体是包括足够数目的人氨基酸位置从而该抗体不在正常人体引起免疫原性应答的抗体。可以使用人的或者基本上人的免疫球蛋白可变结构域和抗体。
IL-21多肽和IL-21受体蛋白质可以用于免疫动物(例如，非人动物和包括人免疫球蛋白基因的非人动物)，得到多克隆和单克隆抗体，其与L-21多肽或IL-21受体蛋白质特异反应并且可以激活IL-21受体。此类抗体可以用完整成熟的蛋白质作为免疫原，或者通过使用IL-21/IL-21R的片段(例如，可溶性片段和小肽)获得。肽免疫原可以额外含有羧基末端的半胱氨酸残基，并且缀合半抗原如匙孔血蓝蛋白(KLH)。通过用硫酸化的酪氨酸残基替代酪氨酸残基，可以产生额外的肽免疫原。合成此类肽的方法是本领域已知的，例如见R.P.Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85，2149-2154(1963)；J.L.Krstenansky，et al.，FEBS Lett.211，10(1987)。
用携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠而不是小鼠系统可以产生针对IL-21或者IL-21受体的人单克隆抗体(mAbs)。来自用目的抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞用于产生杂交瘤，其分泌对人蛋白质表位有特异亲和性的人mAb(见，例如，WO 91/00906，WO 91/10741；WO 92/03918；WO 92/03917；Lonberg，N.et al.1994 Nature 368856-859；Green，L.L.et al.1994 Nature Genet.713-21；Morrison，S.L.et al.1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855Bruggeman et al.1993Year Immunol 733-40；Tuaillon et al.1993 PNAS 903720-3724；Bruggeman et al.1991 Eur J Immunol 211323-1326)。
通过重组DNA技术领域技术人员已知的其他方法也可以产生单克隆抗体。已经开发了一种备选方法，称作“组合抗体展示”方法，用来鉴定和分离具有特定抗原特异性的抗体片段，并且可以用于产生单克隆抗体(关于组合抗体展示的描述，见例如，Sastry et al.1989 PNAS865728；Huse et al.1989 Science 2461275；and Orlandi et al.1989PNAS 863833)。用上述免疫原免疫动物后，克隆所得B细胞库的抗体所有组成成分。一般已知通过使用寡聚体引物混合物和PCR，得到免疫球蛋白分子的不同群体的可变结构域的DNA序列的方法。例如，对应于5’前导序列(信号肽)和/或构架1(FRl)序列的混合的寡核苷酸引物，以及对应于保守的3’恒定区引物的引物可以用于从许多鼠抗体中通过PCR扩增重链和轻链的可变结构域(Larrick et al.，1991，Biotechniques 11152-156)。类似的策略还可以用于从人抗体扩增人重链的和轻链的可变结构域(Larrick et al.，1991，MethodsCompanion toMethods in Enzymology 2106-110)。
通过本领域已知的重组DNA技术可以产生嵌合抗体，包括嵌合的免疫球蛋白链。例如，将编码鼠(或者其他物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因用限制酶消化除去编码鼠Fc的区域，并将编码人Fc恒定区的基因的等同部分替代(见Robinson et al.，国际专利公布PCT/US86/02269；Akira，et al.，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison et al.，欧洲专利申请173,494；Neuberger et al.，国际申请WO 86/01533；Cabilly et al.美国专利号4,816,567；Cabilly et al.，欧洲专利申请125,023；Better et al.(1988Science 2401041-1043)；Liu et al.(1987)PNAS 843439-3443；Liu etal.，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun et al.(1987)PNAS 84214-218；Nishimura et al.，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood et al.(1985)Nature 314446-449；和Shaw et al.，1988，J.Natl Cancer Inst.801553-1559)。
抗体或者免疫球蛋白链可以用本领域已知的方法人源化。将不直接参与抗原结合的Fv可变结构域的序列用来自人Fv可变结构域的等同序列替换，可以产生人源化抗体，包括人源化的免疫球蛋白链。产生人源化抗体的一般方法由Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207，Oi et al.，1986，BioTechniques 4214，和Queen et al.US5,585,089，US 5,693,761和US 5,693,762提供，将它们的内容都通过引用引入本文。那些方法包括分离、操作，和表达核酸序列，其编码至少一条重链或者轻链的所有或者部分免疫球蛋白Fv可变结构域。此类核酸的来源是本领域技术人员公知的并且例如，可以从产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤得到。编码人源化抗体或者其片段的重组DNA然后可以克隆到合适的表达载体中。
可以通过CDR嫁接或者CDR置换产生人源化或者CDR嫁接的抗体分子或者免疫球蛋白，其中可以置换免疫球蛋白链的一个、两个或者所有CDR。见，例如，美国专利5,225,539；Jones et al.1986 Nature321552-525；Verhoeyan et al.1988 Science 2391534；Beidler et al.1988 J.Immunol.1414053-4060；Winter US 5,225,539,将它们的内容特别通过引用引入本文。Winter描述了CDR嫁接方法，其可以用于制备人源化抗体(英国专利申请GB 2188638A，1987年3月26日申请，Winter US 5,225,539)，将其内容特别通过引用引入本文。特定人抗体的所有CDR可以用非人CDR的至少一部分置换或者仅一些CDR可以用非人CDR置换。仅仅有必要将人源化抗体结合预定抗原所需数目的CDR进行置换。
在一些实现方式中，例如，通过缺失、加入或者替代抗体的其他部分，例如，恒定区，可以修饰单克隆的、嵌合的和人源化抗体。例如，可以如下修饰抗体(i)通过缺失恒定区；(ii)通过将恒定区用另一恒定区，例如，意在增加抗体的半寿期、稳定性或者亲和性的恒定区，或者来自另一物种或抗体类别的恒定区置换；或者(iii)通过修饰恒定区中的一个或多个氨基酸以改变例如，糖基化位点数、主动肌细胞功能，Fc受体(FcR)结合，补体固定，等等。
用于改变抗体恒定区的方法是已知的。将抗体的恒定部分中的至少一个氨基酸残基用不同残基替换，可以产生具有改变的功能，例如，对激动剂配体(如细胞上的FcR或者补体的C1组分)具有改变的亲和力的抗体(见，例如，EP 388,151 A1，US 5,624,821和US 5,648,260)。可以描述类似类型的改变，其如果应用于鼠，或者其他物种的免疫球蛋白，将减小或者消除这些功能。
IL-21途径的核酸拮抗剂在某些实现方式中，核酸拮抗剂用于减小IL-21途径活性，例如，减小IgG的产生。在一个实施方案中，核酸拮抗剂是siRNA，其靶定编码IL-21多肽或者IL-21受体的mRNA，或者可以用其他积极作用的IL-21途径组分来减小IL-21途径活性。其他类型的拮抗剂核酸也可以使用，例如，核酸适体、dsRNA、核酶、三螺旋形成物，或者反义核酸。
siRNA是小双链RNA(dsRNA)，其任选包括突出端(overhangs)。例如，siRNA的双链体区长约18到25个核苷酸，例如，长约19、20、21、22、23或24个核苷酸。通常，siRNA序列与目标mRNA精确互补。dsRNA和siRNA尤其可用于沉默哺乳动物细胞(例如，人细胞)中的基因表达。见，例如，Clemens，J.C.et al.(2000)Proc.Natl.Sci.USA97，6499-6503；Billy，E.et al.(2001)Proc.Natl.Sci.USA 98，14428-14433；Elbashir et al.(2001)Nature.411(6836)494-8；Yang，D.et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，9942-9947，U.S.20030166282，20030143204，20040038278，和20030224432。
也可以得到其他类型的核酸试剂的描述。见，例如，美国专利号4,987,071；美国专利号5,116,742；美国专利号5,093,246；Woolf et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA；Antisense RNA and DNA，D.A.Melton，Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)；897305-9；Haselhoff and Gerlach(1988)Nature 334585-59；Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6569-84；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays14807-15。
重组蛋白质的产生编码作为本文描述的方法的试剂的蛋白质的核酸可以可操作地连接载体(如Kaufman et al.，Nucleic Acids Res.19，4485-4490(1991)中公开的pMT2或pED表达载体)中的表达控制序列，以便重组产生蛋白质。许多适宜的表达控制序列是已知的。表达重组蛋白质的一般方法也是已知的并且在R.Kaufman，Methods in Enzymology 185，537-566(1990)，Sambrook & Russell，Molecular CloningA LaboratoryManual，3rdEdition，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(2001)andAusubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)中举例说明。本文定义的“可操作地连接”是指酶促或者化学连接以在编码目的蛋白质的特定多核苷酸和表达控制序列之间形成共价键，使得已经用连接的多核苷酸/表达控制序列转化(转染)的宿主细胞表达目的蛋白质(例如，IL-21或者另一IL-21途径激动剂)。
本文所用术语“载体”指能够转运或者维持其已经连接的另一核酸的保持或复制的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指环状双链DNA环，其中可以连接额外的DNA节段。另一类型的载体是病毒载体，其中可以将额外的DNA节段连接到病毒基因组。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)当导入宿主细胞时可以整合到宿主细胞的基因组，从而随着宿主基因组复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称作“重组表达载体”或者“表达载体”。示例性病毒载体包括复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。
术语“调节序列”意在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)，其控制抗体链基因的转录或翻译。此类调节序列例如在Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。调节序列的选择可以取决于此类因素，如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平，等等。哺乳动物宿主细胞表达的示例性调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白质表达的病毒元件，如衍生自FF-1a启动子和BGH poly A、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚启动子(AdMLP))和多瘤的启动子和/或增强子。关于病毒调节元件和其序列的其他示例性描述，见，例如，美国专利号5,168,062，美国专利号4,510,245和美国专利号4,968,615。
重组表达载体可以携带额外序列，如调节宿主细胞中载体复制的序列(例如，复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因方便载体所导入的宿主细胞的选择(见，例如，美国专利号4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择性标记基因赋予载体已经导入的宿主细胞对药物(如G418、潮霉素或者氨甲蝶呤)的抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞，进行氨甲蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。许多类型的细胞可以作为合适的宿主细胞表达蛋白质治疗剂。可以使用能够表达蛋白质治疗剂的任意细胞类型。示例性哺乳动物宿主细胞包括例如，猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人肾脏293细胞、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、3T3细胞、CV-1细胞、其他转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、衍生自原代组织、原代外植体的体外培养物的细胞株、HeLa细胞、小鼠L细胞、BHK、HL-60、U937、HaK、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PCI2、M1x或C2C12细胞。
蛋白质治疗剂可以通过将编码这种蛋白质的多核苷酸可操作地连接到一个或多个昆虫表达载体中合适的控制序列上，并使用昆虫表达系统来产生。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可通过商业途径获得，例如，以药盒形式从例如Invitrogen，San Diego，Calif.U.S.A.(MAXBAC药盒)获得，如Summers和Smith，Texas AgriculturalExperiment Station Bulletin No.1555(1987)中描述。使用合适的分离的多核苷酸，例如，其中编码跨膜结构域和细胞质结构域的一个或多个或足够节段的区域已经除去的形式，也可以产生IL-21受体蛋白质的可溶形式。
可以在低等真核生物例如酵母或者原核生物如细菌中产生蛋白质治疗剂。适宜的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)株系、毕赤酵母(Pichia)、假丝酵母(Candida)，或者任何能够表达异源蛋白质的酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)，或者任何能够表达异源蛋白质的细菌菌株。
在一个实施方案中，在细菌细胞中产生没有信号序列(例如，没有原核或者真核生物信号序列)的IL-21多肽。在细菌中表达可以导致形成掺入重组蛋白质的包含体。从而，可能需要重组蛋白的再折叠以便产生活性或者更具活性的物质。用于从细菌包含体得到正确折叠的异源蛋白质的一些方法是本领域已知的。这些方法一般包括溶解来自包含体的蛋白质，然后用离液剂完全变性该蛋白质。
当在蛋白质的一级氨基酸序列中存在半胱氨酸残基时，该蛋白质可以在促进正确形成二硫键的环境(例如，氧化还原系统)中再折叠。再折叠的一般方法在Kohno，Meth.Enzym.，185187-195(1990)、EP0433225和U.S.5,399,677中公开。Asano et al.(2002)FEBS Lett.528(1-3)70-6描述了再折叠在细菌细胞中产生的IL-21的示例性方法。例如，rIL-21(重组IL-21)在大肠杆菌中作为不溶的包含体表达，然后溶解(例如，使用变性剂)并通过使用改良的透析方法再折叠，该方法中引入氧化还原试剂。
IL-21途径激动剂蛋白质或者其融合蛋白还可以作为转基因动物的产物而表达，例如，作为转基因奶牛、山羊、猪或者绵羊的奶的组分表达，这些动物的特征是体细胞或者生殖细胞含有编码IL-21途径激动剂蛋白质或者其融合蛋白的多核苷酸序列。
治疗在本发明的一方面，IL-21途径激动剂用于治疗或者防止特应性疾病。
本文所用的术语“治疗”定义为对受试者(例如，人受试者，例如疾病，例如特应性疾病的患者或者有风险的人)应用或者施用组合物。在一些实现方式中，治疗可以包括对来自受试者，例如，患者的分离的组织或者细胞，例如细胞系应用或者施用该试剂。通常，对患有疾病(例如，本文描述的疾病)、疾病症状、疾病的风险升高或者具有疾病倾向的受试者提供治疗，以期治愈、愈合、减轻、缓解、改变、挽救、减轻、改善或者影响所述疾病、该疾病的症状或者对该疾病的倾向。治疗可以包括单独或者与第二种试剂组合施用或者应用组合物。术语“组合”在本上下文中指基本上同时地(同时或者顺序)施用不同试剂。如果顺序施用，那么在开始施用第二种化合物时，两种试剂的第一种优选仍然可以在治疗部位以有效浓度检测到。
“治疗细胞”指将试剂与细胞，例如，免疫细胞接触，例如，以改变细胞的行为或者状态。在一个实施方案中，用IL-21途径的调节剂治疗细胞可以用于调节(例如，增加或者减少)IgG或者IgE的产生。
本文所用的有效治疗疾病的试剂的量，或者“治疗有效量”指当以单剂或者多剂施用于受试者时，有效治疗受试者，例如，治愈、减轻、缓解或者改善受试者中疾病的至少一种症状到超过不存在这种治疗时预期的程度时，该化合物的量。例如，疾病可以是特应性疾病，例如，本文描述的特应性疾病。
“局部有效量”指在可检测地调节组织，例如，特应性疾病的区域中的细胞以调节细胞活性中有效的化合物的量(例如，浓度)。调节的证据可以包括例如，IgG或者IgE的产生的调节。
本文所用的“有效预防疾病”的试剂的量或者化合物的“预防有效量”指当单剂或者多剂施用于受试者时，有效预防或者延缓疾病，例如，特应性疾病的发作或者复发的发生的试剂的量。
药物组合物可以包括“治疗有效量”或者“预防有效量”的本文描述的试剂，例如，IL-21多肽、抗体，或者IL-21受体的形式。“治疗有效量”指在必要的剂量和时间期限下有效实现所希望的治疗效果的量。组合物的治疗有效量可以根据如下因素而变，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，和化合物在个体中引起所希望的应答的能力。治疗有效量也是其中组合物的治疗有益效果胜过毒性或者有害效果的量。“治疗有效剂量”优选将可测量的参数(例如，相对于未治疗的受试者的免疫球蛋白产生或者特应性疾病的可测量的症状)调节到例如统计学显著的程度。化合物抑制可测量的参数的能力可以在预测人疾病中的功效的动物模型系统中，使用体外测定法，例如，本文描述的测定法，或者使用合适的人体试验来评估。
IL-21途径激动剂或者拮抗剂介导的特定效果可以显示出统计学显著差异(例如，P值＜0.05或者0.02)。可以通过任意本领域公知方法确定统计学显著性。示例性统计学检验包括斯氏T检验、MannWhitney U非参数检验，和Wilcoxon非参数统计学检验。一些统计学显著的关系具有小于0.05或者0.02的P值。术语“诱导”、“抑制”、“加强”、“升高”、“增加”、“减少”等等例如表示两种状态之间可区分的定性或者定量差异，并且可以表示两种状态之间的差异，例如，统计学显著差异(例如，P值＜0.05或者0.02)。
调节剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗性应答)。例如，可以施用单次快速浓注，可以随时间施用几个分份剂量，或者可以按照治疗情况的紧急性所指示地，成比例地减小或者增加剂量。可以以剂量单位形式配制肠胃外组合物，为了容易施用剂量和剂量的统一性。本文所用的剂量单位形式指适于作为待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物，计算所述预定量以与所需的药物载体结合产生所希望的治疗效果。
本文描述的试剂的治疗或者预防有效量的示例性、非限制性范围是0.1.20mg/kg，更优选地1.10mg/kg。通过以小于20、10、5或1mg/min的速度静脉内灌注来达到约1到50mg/m2或约5到20mg/m2的剂量，可以施用试剂。剂量值可以随着待减轻的病况的类型和严重性而变。对于任何个体受试者，可以根据个体需要和施用或者监视组合物施用的人员的专业判断，调节特定给药方案。因此，本文给出的剂量范围仅仅是示例性的。
本文所用的术语“受试者”意在包括人和非人动物。本发明的术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，非哺乳动物(如鸡、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，如非人灵长类动物、小鼠、绵羊、狗、奶牛、猪，等等。
施用化合物的一些示例性方法在“药物组合物”中描述。药物组合物还可以用医学装置施用。例如，在一个实施方案中，可以用无针头皮下注射装置，如美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或者4,596,556中公开的装置来施用本发明的药物组合物。可以使用的公知的植入物和模块的实例包括美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控的速率分配药物的可植入的微型灌注泵；美国专利号4,486,194，其公开了用于通过皮肤施用试剂的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了用于以精确灌注速率递送药物的药物灌注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的变速流可植入的灌注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。当然，许多其他的此类植入物、递送系统和模块也是已知的。
在一个实施方案中，配制试剂用于呼吸或者粘膜递送，例如，使用医学装置，如吸入器来递送。见例如，U.S.6,102,035(粉剂吸入器)和6,012,454(干粉吸入器)。在一个实施方案中，吸入器是定量吸入器。用于将药物局部递送到肺气通道的三种常用系统包括干粉吸入器(DPI)、定量吸入器(MDI)和雾化器。MDI是最流行的吸入施用方法，可以用于将药物以溶解的形式或者作为分散体递送。通常，MDI包含氟里昂或者其他相对高蒸气压推进剂，当激活该装置时，推进剂将气溶胶化的药物驱赶到呼吸道中。不像MDI，DPI通常完全依赖于患者的吸气作用将药物以干粉形式引入肺部。雾化器通过对液体溶液传递能量，形成将吸入的药物气溶胶。也可以在液体通气或者肺灌洗期间使用氟化学介质直接经肺递送药物。
在一个实施方案中，局部施用IL-21途径激动剂。“局部施用”指通过将制剂直接接触受试者的表面递送到受试者。局部递送的最常见形式是递送到皮肤，但是本文公开的组合物也可以直接应用于身体的其他表面，例如，应用于眼睛、粘膜、体腔的表面或者内表面。该术语还包括经皮施用途径。局部施用方式通常包括渗透皮肤的通透屏障并有效递送到靶组织或者靶层。局部施用可以用作渗透表皮和真皮并实现组合物的局部或者全身递送的方法。局部施用还可以用作向受试者的皮肤(例如，表皮或者真皮)，或者向其特定层或者下面的组织选择性递送IL-21途径激动剂的方法。本文所用的术语“皮肤”是指动物的表皮和/或真皮。
一些因素决定皮肤对所施用的试剂的通透性。这些因素包括所治疗的皮肤的特征、递送剂的特征、药物与递送剂和药物与皮肤之间的相互作用、所应用的药物的剂量、治疗形式，和后治疗方案。为了选择性靶定表皮和真皮，有时可以配制包含一种或多种渗透增强剂的组合物，所述渗透增强剂将使得药物能够渗透预选的层。
经皮递送是用于施用液态可溶性治疗剂的一种有价值的途径。真皮比表皮更可透过，因此通过受刮擦、烧伤或者裸露的皮肤吸收更快。增加向皮肤的血流的炎症和其他生理状况也增强经皮吸附。通过该途径的吸收可以通过使用油性载体(涂擦剂)或者通过使用一种或多种渗透增强剂来增强。用于通过经皮途径递送本文公开的组合物的其他有效途径包括皮肤的水化和使用控释的局部贴剂。经皮途径提供了为全身和/和局部治疗，递送本文公开的组合物的潜在有效的方法。
此外，离子电渗疗法(在电场的影响下通过生物膜转移离子溶质)(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.163)、超声透入疗法或者超声促渗(使用超声增强多种治疗剂经过生物膜，特别是皮肤和角质层的吸收)(Lee et al.，Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.166)，和相对于剂量位置的载体特征和施用部位保持的优化(Lee et al.，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.168)可以是用于增强局部应用的试剂经皮肤和粘膜部位转运的有用方法。
药物组合物IL-21途径激动剂当与药学上可接受的载体组合时可以用作药物组合物。除了IL-21途径激动剂和载体，此类组合物还可以含有多种稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域公知的其他材料。术语“药学上可接受的”指不干扰活性成分的生物学活性的有效性的无毒性材料。载体的特征通常取决于施用途径。
药物组合物可以还含有如下文详细描述的其他抗炎剂。此类额外因子和/或试剂可以包括在药物组合物中，与IL-21途径激动剂产生协同效应，或者减小IL-21途径激动剂引起的副作用。相反地，IL-21途径激动剂可以包括在特定抗炎剂的制剂中以减小抗炎剂的副作用。
药物组合物可以为脂质体的形式，其中IL-21途径激动剂除了与其他药学上可接受的载体组合外，还与两亲性物质如之类组合，所述两亲性物质在水溶液中以团聚形式如微团、不溶性单层、液体晶体或者片层存在。脂质体制剂的合适的液体包括但不限于，甘油一酯、甘油二酯、硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等等。此类脂质体制剂的制备在本领域水平之内，如美国专利号4,235,871；美国专利号4,501,728；美国专利号4,837,028；and美国专利号4,737,323中公开，将它们都通过引用引入本文。
在治疗或使用方法的实践中，对受试者，例如，哺乳动物(例如，人)施用治疗有效量的IL-21途径激动剂或拮抗剂。IL-21途径激动剂可以单独或者与其他疗法如用于特应性疾病的其他治疗组合施用。当与一种或多种治疗剂共同施用时，IL-21途径激动剂可以与第二种治疗剂同时或者顺序施用。如果顺序施用，那么主治医生可以决定与其他治疗剂组合施用IL-21途径激动剂的合适顺序。
用于治疗特应性疾病的其他示例性治疗剂包括其他的免疫调节剂(例如，他克莫司软膏(PROTOPICTM)和pimecromlimus乳膏(ELIDELTM))、皮质类固醇(局部和全身的)、抗组胺剂、免疫抑制剂(例如，环孢菌素、氨甲蝶呤或者硫唑嘌呤)。用于治疗变应性疾病的示例性额外治疗剂包括CLARITIN(氯雷他定)、苯海拉明和其他抗组胺剂，和富马酸酮替芬。
可以以多种途径进行IL-21途径激动剂的施用，所述途径包括例如，经口摄入、颅内、吸入或者经皮、皮下或者静脉内注射或者施用。例如，组合物可以递送到硬膜外或者例如，递送到脑脊液。
为了口服施用治疗有效量的IL-21途径激动剂，试剂可以为片剂、胶囊剂、粉剂、溶液剂或者酏剂的形式。当以片剂形式施用时，药物组合物可以还含有固态载体，如明胶或者佐剂。片剂、胶囊剂和粉剂含有约5到95％试剂或者约25到90％试剂。当以液态形式施用时，可以加入液态载体如水、石油、动物或者植物来源的油，如花生油、矿物油、大豆油或者芝麻油，或者合成的油。药物组合物的液态形式可以还含有生理盐水溶液、葡萄糖或者其他糖类溶液，或者二元醇，如乙二醇、丙二醇或者聚乙二醇。当以液态形式施用时，药物组合物含有按重量计约0.5到90％试剂，优选约1到50％试剂。
为了施用治疗有效量的IL-21途径激动剂，例如，通过静脉内、皮肤或者皮下注射施用，试剂可以为无致热原、肠胃外可接受的水溶液的形式。此类肠胃外可接受的、具有应有的pH、等渗性、稳定性等的蛋白质溶液是本领域技术人员能力范围之内的。用于静脉内、皮肤或者皮下注射的示例性药物组合物除了含有试剂之外，还可以含有等渗赋形剂，如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格注射液或者本领域已知的其他赋形剂。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂，或者本领域技术人员已知的其他添加剂。
本发明的药物组合物中IL-21途径激动剂的量可以取决于所治疗的状况的性质和严重性，和患者已经经历的以前的治疗的性质。主治医生可以决定用于治疗每名患者的激动剂的量。例如，最初，主治医生可以施用低剂量的试剂并观察患者的反应。可以施用更大剂量的试剂，直到为患者得到最佳的治疗效果，并且在这一点，剂量通常不进一步增加，或者通过监视免疫球蛋白水平(例如，IgG或者IgE水平)或者一种或多种症状。示例性药物组合物可以含有每千克体重约0.1μg到约100mgIL-21途径激动剂。例如，有用的剂量可以包括每千克体重约10μg-1mg、0.1-5mg和3-50mg IL-21途径激动剂。IL-21的有用剂量可以还包括每千克体重约5μg-1mg、0.1-5mg和3-20mg IL-21途径激动剂。取决于所治疗的疾病和状况的严重性和每名患者的潜在特应性应答，使用药物组合物进行的静脉内治疗的持续时间可以改变。IL-21途径激动剂的每种应用的持续时间可以例如为12到24小时的连续静脉内施用。主治医生可以决定使用本发明的药物组合物的静脉内治疗的合适的持续时间。
在一个实施方案中，将IL-21途径激动剂配制成微粒或者其他持续释放制剂。微粒可以通过喷雾干燥产生，但是也可以通过其他方法，包括冷冻干燥、蒸发、流化床干燥、真空干燥或者这些技术的组合来产生。将激动剂置于阻止其释放的结构或者物质内，可以实现控释或者持续释放。例如，激动剂可以置于多孔基质或者易蚀性基质中，它们任一种都允许随时间释放激动剂。
在一个实施方案中，包括IL-21途径激动剂的混合的微团制剂用于通过经皮膜递送试剂。例如，通过将IL-21途径激动剂的水溶液，和微团形成化合物和任选地，碱金属，例如，C8到C22烷基硫酸盐混合，可以制备制剂。示例性微团形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、羟基乙酸、乳酸、甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、甘油单油酸酯、一油酸酯、一月桂酸酯、琉璃苣、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代cholanyl甘氨酸和其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油精、聚氧乙烯醚和其类似物、polidocanol烷基醚和其类似物、鹅去氧胆酸盐、氧胆酸盐和其混合物。微团形成化合物可以在烷基硫酸碱金属盐的加入同时或者加入后加入。用基本上任何种类的成分混合将形成混合的微团，但是优选剧烈搅拌以便提供尺寸较小的微团。“微团”在本文中定义为特定类型的分子集合，其中两亲性分子以球形结构排列使得分子的所有疏水部分都朝向内部，留下亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水的，那么存在相反排列。
用关于IL-21途径激动剂所述相似的方式，可以将IL-21途径拮抗剂与药学上可接受的载体组合配制和制备成药物组合物。
对于IL-21途径激动剂和拮抗剂为蛋白质的情况，通过施用或者使用编码此类蛋白质的多核苷酸(例如，在基因疗法中或者适于导入DNA的载体中)，也可以治疗或者预防疾病或病症。编码IL-21途径激动剂(例如，IL-21多肽)的多核苷酸可以插入到载体中并用作基因疗法载体。例如，通过静脉内注射、局部施用(见美国专利5,328,470)、注射(例如，US 20040030250或者20030212022)或者stereotactic注射(例如，Chen et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057，1994)，可以向载体中插入编码IL-21途径激动剂(例如，IL-21多肽)的多核苷酸。基因治疗载体的药物制剂可以包括可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包含缓释基质，基质中包埋基因递送载体。备选地，当可以从重组细胞完整地产生完整基因递送载体，例如，逆转录病毒载体时，药物制剂可以包括产生基因递送系统的一种或多种细胞。
药盒可以在药盒中提供本文描述的IL-21途径激动剂，例如，IL-21多肽或者结合IL-21受体的抗体。药盒包括(a)IL-21途径激动剂，例如，包括IL-21途径激动剂的组合物，和任选地(b)信息材料。信息材料可以是描述性的、指导性的、销售或者其他材料，其涉及本文描述的方法和/或IL-21途径激动剂用于本文描述的方法的用途。
药盒的信息材料不限于它的形式。在一个实施方案中，信息材料可以包括关于生产化合物(即IL-21途径激动剂)、化合物的分子量、浓度、过期日期、批或者生产地点信息等等的信息。在一个实施方案中，信息材料涉及化合物的施用以治疗或者预防特应性疾病。
在一个实施方案中，信息材料可以包括以合适的方式，例如，以合适的剂量、剂型或者施用方式(例如，本文描述的剂量、剂型或者施用方式)施用IL-21途径激动剂以进行本文描述的方法的说明书。示例性剂量、剂型或者施用方式为每千克体重约10μg-1mg、0.1-5mg和3-50mg IL-21多肽。在另一实施方案中，信息材料可以包括对适宜的受试者，例如，人，例如，患有或者有风险患特应性疾病的人施用IL-21途径激动剂的说明书。例如，材料可以包括施用IL-21途径激动剂以减轻特应性疾病(如哮喘、特应性皮炎或者变应性鼻炎)的至少一个系统的说明书。
药盒的信息材料不限于其形式。在许多情况中，信息材料，例如，说明书可以以印刷品，例如，印制文本、图和/或照片，例如，标签或者印制片提供。然而，信息材料还可以以其他形式，如以计算机可读的材料、图像记录或者声音记录的形式提供。在另一实施方案中，药盒的信息材料是联系信息，例如，物理地址、email地址、网站或者电话号码，其中药盒的使用者可以得到关于IL-21途径激动剂和/或其在本文描述的方法中的用途的详细信息。当然，信息材料还可以以多种形式的任意组合提供。
除了IL-21途径激动剂，药盒的组合物可以包括其他成分，如溶剂或缓冲剂、稳定剂、防腐剂、调味剂(例如，苦味拮抗剂或者增甜剂)、芳香剂或者其他化妆品成分，和/或用于治疗本文描述的状况或者疾病，例如，特应性疾病，如哮喘、特应性皮炎或者变应性鼻炎的第二种试剂。备选地，药盒中可以包括其他成分，但是这些成分处于与IL-21途径激动剂不同的组合物或者容器中。在此类实施方案中，药盒可以包括混合IL-21途径激动剂和其他成分或者使用IL-21途径激动剂以及其他成分的使用说明书。
IL-21途径激动剂可以以任意形式，例如，以液体、干燥或者冻干的形式提供。优选IL-21途径激动剂基本上纯和/或无菌。当以液体溶液提供IL-21途径激动剂时，液体溶液优选为水性溶液，优选无菌水性溶液。当IL-21途径激动剂以干燥形式提供时，通常通过加入合适的溶剂重构。溶剂，例如，无菌水或者缓冲剂可以任选在药盒中提供。
药盒可以包括含有IL-21途径激动剂的组合物的一个或多个容器。在一些实施方案中，药盒含有组合物的分离容器、分配器或者隔室和信息材料。例如，组合物可以包含在瓶子、小瓶或者注射器中，并且信息材料可以包含在塑料套或者盒中。在其他实施方案中，药盒的分离成分包含在一个、未分开的容器中。例如，组合物包含在瓶子、小瓶或者注射器中，其附着标签形式的信息材料。在一些实施方案中，药盒包括许多(例如，一包)单独容器，每个容器含有一个或多个单位剂型(例如，本文描述的剂型)的IL-21途径激动剂。例如，药盒包括许多注射器、安瓿、箔包装或者泡罩包装，每个含有单个单位剂量的IL-21途径激动剂。药盒的容器可以是气密的、防水(例如，对水分或者蒸发改变不渗透)，和/或不透光的。
药盒任选包括适于施用组合物的装置，例如，注射器、吸入器、吸量管、镊子、测量匙、滴管(例如，滴眼管)、拭子(例如，棉花拭子或者木制拭子)，或者任何此类递送装置。在优选实施方案中，该装置是吸入器或者植入泵。
特应性疾病和症状“特应性”指一组疾病，其中通常有发生变应性反应的遗传倾向。特应性疾病的实例包括变态反应、变应性鼻炎、特应性皮炎、哮喘和花粉热。
哮喘是与间歇性呼吸症状，如支气管高反应性和可逆气流阻塞有关的表型异质疾病。哮喘的免疫组织病理学特征包括例如，气道上皮的剥蚀、基底膜下面的胶原沉积、水肿、肥大细胞激活，和炎症细胞浸润(例如，中性粒细胞、嗜酸性细胞，和淋巴细胞)。气道炎症可以还促进支气管高反应性、气流限制、急性支气管收缩、粘液栓形成、气道壁重塑，和其他呼吸症状。可以施用IL-21途径激动剂来减轻一种或多种这些症状。
变应性鼻炎(枯草热)的症状包括瘁、流鼻涕、喷嚏或者鼻子不通气，和眼睛瘁。可以施用IL-21途径激动剂来减轻一种或多种这些症状。
特应性皮炎是影响皮肤的慢性(长期)疾病。关于特应性皮炎的信息可以例如从NIH Publication No.03-4272得到。在特应性皮炎中，皮肤可以变得非常痒，导致发红、肿胀、破裂、流清液、和最后结痂和脱皮。在许多情况中，一定时间内疾病恶化(称作加重或者潮红)，接着是皮肤改善或者完全好转(称作缓和)。
特应性皮炎通常称作“湿疹”，其是几种类型的皮肤炎症的通用术语。特应性皮炎是许多类型湿疹的最常见的形式。特应性皮炎的实例包括变应性接触性湿疹(皮炎红肿、发瘁、流液反应，其中皮肤已经接触免疫系统识别为外来物的物质，如野葛或者乳膏和洗剂中的某些防腐剂)；接触性湿疹(一种局部反应，其包括红肿、发瘁，和刺激，其中皮肤已经接触了变应原(导致变态反应的物质)或者接触了刺激物，如酸、清洁剂或者其他化学品)；汗疱(手掌和足底上皮肤的刺激，其特征是发痒和刺激的澄清、深的水疱)；神经性皮炎(头、下腿、手腕或者前臂上皮肤的鳞状斑，由局部化发瘁(如昆虫叮咬)导致，该局部化发痒当抓伤时变得非常刺激)；钱币状湿疹(受刺激皮肤的钱币形斑块——手臂、背、臀部和下腿上最常见-可以结痂、脱皮和非常瘁)；面游风(头皮、脸和偶然在身体的其他部分上皮肤的淡黄色、油性、鳞状斑块)。额外的特定症状包括停滞性皮炎、特应性褶状物(丹-摩二氏皱襞，Dennie-Morgan fold)、唇炎、掌纹增多、色素沉着过度眼睑、由于炎症或者枯草热导致眼睑颜色变暗、鱼鳞病、毛发角化病、苔癣形成、丘疹和荨麻疹。可以施用IL-21途径激动剂来减轻一种或多种这些症状。
用于评估候选试剂的测定法多种测定法可以用于评估候选试剂，例如，是否可用作IL-21途径激动剂或者IL-21途径拮抗剂。用于IL-21多肽和IL-21受体蛋白质的示例性活性测定法例如在Kasaian et al.(2002)Immunity 161-20中描述。这些测定法可以用于评估IL-21多肽或者其他试剂的功能性。例如，IL-21多肽可以在Kasaian et al.(2002)，上文的一种或者多种如下测定中有活性(例如，野生型的至少25、50、75、80或95％比活性)T细胞增殖测定法(例如，如前述参考文献中图7A)，和NK细胞毒性测定法(例如，如前述参考文献中图4，在IL-15存在下)。
胸腺细胞或者哈脾细胞细胞毒性的适宜的测定法包括但不限于，那些在Current Protocols in Immunology，Ed by J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober，Pub.GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3，In Vitroassays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19；Chapter 7，Immunologic studies in Humans)；Herrmann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.782488-2492，1981；Herrmann et al.，J.Immunol.1281968-1974，1982；Handa et al.，J.Immunol.1351564-1572，1985；Takai et al.，J.Immunol.1373494-3500，1986；Takai et al.，J.Immunol.140508-512，1988；Herrmann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.782488-2492，1981；Herrmann et al.，J.Immunol.1281968-1974，1982；Handa et al.，J.Immunol.1351564-1572，1985；Takai et al.，J.Immunol.1373494-3500，1986；Bowmanet al.，J.Virology 611992-1998；Takai et al.，J.Immunol.140508-512，1988；Bertagnolli et al.，Cellular Immunology 133327-341，1991；Brown et al.，J.Immunol.1533079-3092，1994中描述的测定法。
用于依赖T细胞的免疫球蛋白应答和同种型转换(其将鉴定调节依赖T细胞抗体应答和影响Th1/Th2图谱的蛋白质)的测定法包括但不限于，在Maliszewski，J.Immunol.1443028-3033，1990；and Assaysfor B cell functionIn vitro antibody production，Mond，J.J.andBrunswick.M.In Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coliganeds.Vol 1 pp.3.8.1-3.8.16，John Wiley and Sons，Toronto.1994中描述的那些测定法。
混合的淋巴细胞反应(MLR)测定法(其将鉴定主要产生Th1和CTL应答的蛋白质)包括，但不限于，在Current Protocols inImmunology，Ed by J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober，Pub.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(Chapter 3，In Vitro assays for Mouse LymphocyteFunction 3.1-3.19；Chapter 7，Immunologic studies in Humans)；Takaiet al.，J.Immunol.1373494-3500，1986；Takai et al.，J.Immunol.140508-512，1988；Bertagnolli et al.，J.Immunol.1493778-3783，1992中描述的那些测定法。
依赖树突细胞的测定法(其将鉴定激活幼稚T细胞的树突细胞表达的蛋白质)包括，但不限于，Guery et al.，J.Immunol.134536-544，1995；Inaba et al.，Journal of Experimental Medicine 173549-559，1991；Macatonia et al.，Journal of Immunology 1545071-5079，1995；Porgador et al.，Journal of Experimental Medicine 182255-260，1995；Nair et al.，Journal of Virology 674062-4069，1993；Huang et al.，Science 264961-965，1994；Macatonia et al.，Journal of ExperimentalMedicine 1691255-1264，1989；Bhardwaj et al.，Journal of ClinicalInvestigation 94797-807，1994；和Inaba et al.，Journal ofExperimental Medicine 172631-640，1990描述的测定法。
用于淋巴细胞幸存/凋亡的测定法(其将鉴定防止超抗原诱导后的细胞凋亡的蛋白质和调节淋巴细胞内环境稳定的蛋白质)包括但不限于，Darzynkiewicz et al.，Cytometry 13795-808，1992；Gorczyca et al.，Leukemia 7659-670，1993；Gorczyca et al.，Cancer Research 531945-1951，1993；Itoh et al.，Cell 66233-243，1991；Zacharchuk，Journal ofImmunology 1454037-4045，1990；Zamai et al.，Cytometry 14891-897，1993；Gorczyca et al.，International Journal of Oncology 1639-648，1992中描述的那些测定法。
影响T细胞定型和发育的蛋白质的测定法包括但不限于，在Anticaet al.，Blood 84111-117，1994；Fine et al.，Cellular Immunology155111-122，1994；Galy et al.，Blood 852770-2778，1995；Toki et al.，Proc.Nat.Acad Sci.U.S.A.887548-7551，1991中描述的那些测定法。
用于评估STAT活性的测定法例如在Gilmour et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210772-10776中描述。例如，可以裂解所评估的细胞(例如，用激动剂或者候选激动剂处理的细胞)并且可以用抗磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀酪氨酸磷酸化蛋白质。然后，可以用对信号途径组分特异的抗体，例如，针对STAT蛋白质，如STAT的抗体评价沉淀的物质。
用于评估细胞因子水平的测定法可以用任意标准测定法评估样品或者受试者中的细胞因子水平，例如，用来评估IL-21参数。例如，样品可以从受试者得到或者可以包括培养物细胞。示例性样品可以得自或者来自一种或多种细胞、组织，或者体液，如血液、尿、淋巴液、脑脊液，或者羊水、培养的细胞(例如，组织培养物细胞)、面颊拭子、漱口水、粪便、组织切片，和活组织检查材料(例如，活组织检查抽吸)。
用于评估细胞因子水平的方法包括评估核酸以检测编码目的细胞因子(例如，IL-21)的mRNA或者cDNA或者评估用于检测细胞因子自身的蛋白质。例如，使用RT-PCR(例如，定量PCR)或者核酸微阵列，可以评估核酸。例如，使用质谱法或者免疫测定法可以评估蛋白质。
ELISA提供了一种方便的免疫测定法形式。例如，BiosourceInternational，Camarillo CA提供了可用于检测IL-21、IL-10和IL-12的测定试剂。类似地，R&D Systems提供了用于以＜8pg/ml的灵敏度检测IFN-γ或者以＜7pg/ml的灵敏度检测TGF-β1的试剂。SEARCHLIGHTTMProteome Array System(Pierce，BostonTechnology Center)提供了用于一次评估多种细胞因子的综合试剂。
这些方法可以用于例如在施用IL-21途径调节剂(例如，激动剂或者拮抗剂)之前、期间或者之后评估受试者。例如，为了确定这种激动剂是否导致细胞因子，例如，IL-21、IL-10或者IFNγ的水平的统计学显著改变或者确定它是否导致可接受的改变，例如，改变到细胞因子，例如，IL-21、IL-10或者IFNγ的正常范围的水平，评估所得信息可以用于调节激动剂的剂量。
类似地，可以利用评估IgG和IgE水平的方法。例如，AlphaDiagnostic International，Inc.(San Antonio，TX)提供了用于评估人IgE的ELISA试剂盒，Bethyl Laboratories，Inc也提供了这样的试剂盒。在一个实施方案中，如果IgE水平不降低到正常受试者范围内的水平，那么可以增加IL-21激动剂的施用，例如，通过增加剂量或者频率，例如，通过成比例或者对应量，或者增加至少约1.5、1.8或者2倍。
实施例在人特应性疾病中，IgE敏化变应性反应，而IgG4是保护性的。因为IL-4和IL-13引发Ig转化重组到IgE和IgG4，所以额外的试剂可能调节这些同种型之间的平衡以影响对特应性的敏感性或者耐受性。IL-21减小IL-4驱动的IgE转换重组但是增加人PBMC的IgG4分泌。与它在鼠系统中的效果比反，IL-21对人IgE的产生的抑制不是对B细胞的直接影响，并且可以被B细胞CD40与抗CD40抗体的交联克服。此外，IL-21不阻断应答IL-13产生的IgE。T细胞应答IL-4但是不应答IL-13，并且T细胞扩增似乎促进IL-21对IgE的产生的抑制作用。IFN-γ、IL-10、IL-12、CD40表达和细胞凋亡都不造成抑制性效果。
与其对IgE的产生的间接抑制不同，IL-21刺激IgG4从PBMC的分泌。我们发现IL-21可以影响人IgE和IgG4的产生，并且从而促进特应性反应的调节。
材料和方法PBMC分离和培养.将来自健康人供体的外周血抽入肝素化VACUTAINERTM管(BD，Mountain View，CA)。通过在HISTOPAQUE-1077TM(Singma，St.Louis，MO)上离心分离单核细胞。为了培养完整PBMC，将细胞以2×106/ml接种在96孔圆底板中，该96孔圆底板含有1×106/ml放射的(1500 RAD)自体PBMC作为饲养者，处于含有10％热失活的FCS、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素、2mML-谷氨酰胺的RPMI中。为了PHA活化，用2μg/ml PHA-P(Sigma)接种PBMC。2天后，加入缺少PHA但是含有25ng/ml重组人IL-4或者50ng/ml重组人IL-13、+/-20ng/ml重组人IL-21(R&D SystemsInc.，Minneapolis，MN)的新鲜培养基。通过每种细胞因子的剂量滴定确定这些水平。对于抗-CD40单克隆抗体活化，在细胞因子的存在下用1μg/ml抗人CD40(BD Pharmingen)接种PBMC。对于PHA和抗CD40活化的培养物，每4天加入含有新鲜细胞因子的培养基。在PHA培养的第14-21天，或者抗-CD40单克隆抗体培养的第6-12天，收获培养基用于测定抗体水平。这些时间点反映了与PHA刺激相比，在抗-CD40处理条件下IgE的产生的更快的时程。在培养过程中早期(第3-5天)或者较晚(第10-14天)分离细胞用于RNA分离。
Bcell富集.如上述分离的PBMC与B细胞富集混合物(ROSETTESEPTM，StemCell Technologies，Vancouver，BritishColumbia，Canada)一起温育，和根据生产商的说明书分离B细胞。所得群体为＞88％CD20+B细胞。将B细胞以2×105/ml接种在含有1×106/ml辐射的(1500 RAD)自体PBMC作为饲养者的培养基中，并用如上述的抗-CD40单克隆抗体或者细胞因子处理。在培养的第6-12天，收获培养基用于测定抗体水平。
人Ig同种型的ELISA.将ELISA板(EIA/RIA板；CorningCostar，Acton，MA)用溶于0.1M碳酸钠、0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)中的1μg/ml山羊抗人IgE(KPL Inc.，Gaithersburg MD)或者3μg/ml小鼠抗人IgG4(Southern Biotechnology Associates，Birmingham，AL)在4℃过夜包被。将ELISA板用PBS中的0.5％明胶和1％聚乙烯吡咯烷酮(Sigma，St.Louis，MO)阻断1小时。将板用含有0.05％Tween-20(PBS-Tween)的PBS洗涤，然后与血清或者人IgE(Biodesign Int，Kennebunk，ME)或者IgG4(Sigma)同种型标准在室温下温育4小时。用PBS-Tween洗涤后，将板在室温下用针对人IgE(KPL)或IgG4(Southern Biotechnology Associates)的生物素化抗体温育。将板洗涤并用HRP-标记的链霉抗生素蛋白(Southern BiotechnologyAssociates)在室温下温育1小时。洗涤板并用过氧化物酶底物Sure Blue(KPL)温育。加入0.1N HCl终止反应，并在SPECTRAMAXTM平板读出器(Molecular Devices Corp.，Sunnyvale，CA)中读出450nm下的吸光度。为了证明同种型特异性，将纯化的人IgM、IgG同种型或者IgA(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)在IgE和IgG4ELISA中运行并且不产生信号。IgE ELISA的灵敏度极限为0.3ng/ml。IgG4 ELISA的灵敏度极限为4ng/ml。
细胞因子分析.用IL-10的测定试剂盒(Biosource International，Camarillo，CA；灵敏度＜0.2pg/ml)、IL-12的测定试剂盒(BiosourceInternational；灵敏度＜2pg/ml)、IFN-γ的测定试剂盒(R&D Systems；灵敏度＜8pg/ml)或者TGF-β1的测定试剂盒(R&D Systems，灵敏度＜7pg/ml)测定培养物上清液中的细胞因子水平。
增殖测定法.富集的人B细胞以2×105/孔培养在96孔圆底板中的含有10％FBS、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺的RPMI中。如上述加入抗-CD40单克隆抗体和细胞因子。在第3天，将培养物用0.5μCi/孔3H-胸苷(PerkinElmer NEN，Boston，MA)脉冲，5小时后收获到玻璃纤维滤器垫上。通过液体闪烁计数测定3H胸苷掺入。
细胞凋亡测定.用膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)(Calbiochem，La Jolla，CA)通过流式细胞术测量细胞凋亡。如上述培养PBMC，并在加入细胞因子后在24和48小时测量细胞凋亡。将细胞与膜联蛋白V-FITC和APC缀合的抗人CD19(BD Pharmingen)在室温温育15分钟并洗涤。加入碘化丙锭并用BD FACSCalibur细胞计数器和CellQuest软件(BDBiosciences)分析荧光。
RNA分离.在PBMC或者B细胞培养第5天，合并来自微量滴定孔的细胞，用PBS洗涤，用RLT缓冲液(Qiagen Inc.，Valencia，CA)裂解，并用QIASHREDDERTM制备。使用RNA MINITMKit(Qiagen)根据生产商的使用说明书制备RNA。
无菌转录物的逆转录和PCR分析.用Promega ReverseTranscription试剂盒(Promega Corp.，Madison，WI)将如上述的mRNA转录成cDNA。用Clontech ADVANTAGETMPCR试剂盒(BDBiosciences Clontech，Palo Alto，CA)和下面的引物序列和条件进行PCR。使用引物扩增GAPDH，共25轮，每轮在94℃、65℃和72℃下1分钟。用引物(42)扩增Iε种系转录物，共38轮，每轮在94℃、65℃和74℃下1分钟。用引物(43)扩增Iγ4种系转录物，共38轮，每轮在94℃、65℃和76℃下1分钟。用JH共有正向引物5’(44)与Iε反向引物组合扩增成熟IgE转录物，共38轮，每轮在94℃、65℃和74℃下1分钟。通过Eurogentec(San Diego，CA)制备引物。扩增的产物在含有溴化乙锭的1.2％琼脂糖凝胶上电泳。
实时RT-PCR.用RNEASYTMMini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从细胞分离总RNA。用PRIMER EXPRESSTM软件(AppljedBiosystems Division of Perkin Elmer Corp.，Foster City，CA)设计针对人GAPDH、IL-12p35、IL-10和IL-12Rβ2的寡核苷酸并由Eurogentec合成。在5’末端用指示染料6-羧基荧光素(FAM)并在3’末端用淬灭剂染料6-羧基-四甲基罗丹明(TAMRA)标记探针。用逆转录酶q-PCRMASTERMIXTM(Eurogenetec)和每次反应50ng模板RNA设置反应。样品在PRISM 7000TMSequence Detection System(AppliedBiosystems)上一式两份地运行，使用下面的RT-PCR程序48℃(1)30’循环，95℃(50)10’循环，95℃(1)15”循环和60℃(1)1’循环。用PRISM 7000TM软件分析数据。每个结果用RNA的阳性对照来源产生的标准曲线拟合，并将表达值对GAPDH归一化。
统计分析.所有观察结果都在2-6个单独实验中重复。用斯氏t检验比较处理组之间的数据。为了分析微量培养物中细胞因子对IgE的产生的影响，进行给定处理的每个微孔中的IgE水平作为单独测定，n＝每次处理24-36。为了分析细胞因子对大批培养物中IgE或者细胞因子的产生的影响，每次处理建立一式两份培养物。认为p值＜0.05是显著的。
结果IL-21增强人B细胞中IL-4和IL-13驱动的IgE合成.在IL-4或IL-13的存在下，将B细胞暴露于CD40交联剂可以引发IgE转换重组。为了研究IL-21对该过程的影响，从人PBMC富集B细胞到＞88％纯度，并在IL-4或者IL-13存在下用抗-CD40 mAb刺激。检测不到CD3+细胞。每次处理在24-36微量滴定孔中建立个体培养物。不存在IL-4或者IL-13时，没有孔含有IgE，与检测不到产生IgE的细胞相一致。当加入IL-4或者IL-13时，多数微量培养物含有产生IgE的细胞(图1A)，在上清液可检测到IgE(图1B)。尽管没有进行有限稀释分析来计算确切频率，但是IgE阳性微量培养物数目的增加，表明产生IgE的B细胞的频率增加。加入IL-21到IL-4或者IL-13一致地将产生IgE的水平增加到高于仅用IL-4或者IL-13看到的水平(图1A，B)。使用IL-4或者IL-4+IL-21，产生IgE的孔的百分数几乎为100％，并且百分数由仅用IL-13时的61％增加到使用IL-13+IL-21时的78％。IL-4和IL-13也诱导产生Iε种系转录物(图1C)，其与从头Ig转换重组到Cε基因座有关。
IL-4和IL-13还诱导产生Iγ4种系转录物(图1C)，但是在我们的培养系统中，仅IL-4或者IL-13不足够维持IgG4的产生和从细胞的释放(图1D)。相比，仅IL-21时只产生了Iγ4种系转录物的背景水平(图1C)，但是确实刺激低水平的IgG4释放到抗-CD40 mAb处理的B细胞的上清液中。加入IL-21到IL-4或者IL-13将IgG4产生强烈增强到高于仅用IL-4或者IL-13看到的水平(图1D)。实际上，除非向培养物加入IL-21，否则从细胞释放极少的IgG4。
IL-21刺激已经用抗CD40 mAb处理的人B细胞的增殖(22)，并且经历同种型转换重组的细胞的比例随着细胞分裂增加(34)。为了确定增加的B细胞增殖是否可以有助于说明IL-21存在下看到的IgE和IgG4的升高的水平，我们通过纯化的B细胞在上面使用的培养条件下评价了3H胸苷的掺入。结果表明IL-21将B细胞增殖增强到高于仅用IL-4或者IL-13看到的水平(图2)。
IL-21增强用抗-CD40 mAb和IL-4或IL-13刺激的未分级分离的PBMC中IgE合成.除了所报导的对B细胞的影响，IL-21对人T细胞也具有强烈影响。它诱导T细胞增殖(22，23，35)，并且在TCR交联剂和合适的共同刺激存在下加强细胞因子产生(23，36)。因此，感兴趣的是研究在其中T细胞也存在并且可以应答细胞因子的条件下，IL-21对IgE生成的影响。
用抗CD40 mAb与IL-4或者IL-13组合处理未分级分离的PBMC以促进IgE产生。7至14天后测量上清液中的IgE。IL21与IL-4或者IL-13组合，引起IgE和IgG4蛋白质水平的适度增加(图3A，B，D)。产生IgE的孔的百分数从仅用IL-4时的86％增加到使用IL-4+IL-21时的100％，并且从仅用IL-13时的19％增加到使用IL-13+IL-21时的56％。与此一致的是，在IL-21存在下，IL-4或者IL-13诱导的Iε种系转录物、J-Cε成熟转录物，和Iγ4种系转录物都得到保持(图3C)。
IL-21阻断用PHA和IL-4刺激的未分级分离的PBMC的IgE合成. 活化的T细胞是IL-21的唯一已知的来源。在下面的系列实验中，在Ig类别转换重组取决于T细胞活化的条件下研究IL-21的影响。未分级分离的PMBC用T细胞促分裂原PHA处理，以诱导CD40L表达(51)。当加入IL-4或者IL-13时，在14-21天内，IgE释放到上清液中。在该依赖T细胞的系统中，IL-4驱动的IgE产生受到IL-21阻断，其极大地减小了释放到上清液中的IgE的水平(图4A，B)。产生IgE的孔的百分数从仅用IL-4时的47％减小到使用IL-4+IL-21时的6％。有趣的是，当用IL-13启动IgE合成时，没有看到该效果。用IL-13+IL-21处理的细胞比仅用IL-13处理的细胞产生更多IgE(图4A，B)，如用纯化的B细胞所看到的(图1A)。产生IgE的孔的百分数从仅用IL-13时的31％增加到使用IL-13+IL-21时的68％。考虑到T细胞响应IL-4但是不响应IL-13，这些观测指向IL-21对该系统中IL-4驱动的IgE生成的抑制活性的依赖T细胞的机理。
为进一步研究该抑制活性，检查了Iε种系转录。使用PHA刺激，在加入IL-4或者IL-13后很早(培养的3-5天)就可检测到Iε种系转录。尽管IL-21阻断IL-4处理的培养物中IgE的产生，但是它不阻止IL-4或者IL-13对Iε种系转录物的该最初诱导(图4C)。
IL-21增加用PHA刺激的未分级分离的PBMC中IgG4的产生.在PHA刺激的PBMC培养物中，用IL-4或者IL-13处理诱导高水平的Iγ4种系转录物。用IL-21处理的或者不加入细胞因子的PBMC也显示出可检测到的转录物(图4C)。到第14-15天，在用IL-21处理的培养物中发现比在仅用IL-4或者IL-13处理的培养物中更高水平的IgG4(图4D)。加入IL-4对IL-21诱导的IgG4产生是抑制性的，而加入IL-13则不是(图4D)。
CD40L表达在IL-21存在下维持.当用PHA诱导IL-4驱动的IgE的产生的共刺激信号时，看到IL-2对IgE和IgG4的生成的抑制作用(图4)。相比，当用抗CD40直接交联PBMC培养物中的CD40时，IL-21不阻断应答IL-4而发生的IgE生成(图3)。从而，我们考虑IL-21可能减小了PHA和IL-4刺激的PBMC的CD40L表达。CD40L mRNA是不稳定的，并且认为表达在转录水平上受到调节(37，38)。使用实时PCR，我们检查了加入细胞因子后早期(第4天)，或者在较晚的时间点(第14天)(此时在细胞上清液中可测量到IgE)，在PHA刺激的PBMC培养物中的CD40L转录物水平。在这两个时间点，用IL-4或IL-4+IL-21处理的细胞都显示出强烈的CD40L mRNA表达，而仅使用IL-21的转录物水平不高于用PHA看到的水平(图5A)。这些发现得到PCR扩增的支持，该PCR扩增使用跨越整个CD40L编码区的引物(图5B)。该结果清楚地表明IL-21的存在不阻断CD40L转录，表明在其中IgE产生受到抑制的条件下，CD40L表达并不减少。
IL-21诱导IFN-γ的表达.进行了一些实验来解决用IL-21处理PHA刺激的、IL-4活化的PBMC是否导致产生阻断IgE的产生的细胞因子。IFN-γ拮抗IgE合成的能力已经良好表征(10，13，14，39)，并且已知IL-21刺激人T和NK细胞中IFN-γ基因转录(36，40)。因此，检查了用IL-4、IL-13或IL-21处理的PHA刺激的PBMC中IFN-γ转录物的表达。在培养早期，可以检测到Iε种系转录物时，在所有处理条件下都可以看到IFN-γ基因表达。到培养的第14天，此时可以从上清液测定IgE，仅在用IL-4处理的或者用IL-21处理的培养物中看到IFN-γ基因表达(图5)。从而，在用IL-4+IL-21处理的培养物中发现IFN-γ转录物，其中的IgE产生减少，在用IL-13+IL-21处理的培养物中也发现IFN-γ转录物，其中IgE的产生得到保持。
IL-21诱导PBMC产生IL-10，但是不影响IL-12的产生或者IL-12Rβ的表达.IL-10是多能细胞因子，已经报导其刺激(41)或者抑制(21)B细胞IgE合成，这取决于其他细胞因子或者共同刺激信号的存在。我们研究了在IL-21处理的PBMC中是否产生IL-10并且其是否有助于解释在IL-4存在下看到的IgE生成的抑制。发现在PHA刺激的培养物(图6A)和抗CD40 mAb刺激的培养物(图6B)中，IL-21加强PBMC的IL-10生成，其中在PHA刺激的培养物中，IgE产生受到抑制(图4)，在抗CD40 mAb刺激的培养物中，IgE产生不受到抑制(图3)。此外，在IL-4或IL-13存在下看到相当的IL-10水平(图6A，B)。实时PCR分析证明IL-21增加了IL-10产生，但是无论IgE是否释放，都看到IL-10产生的增加。为了更直接研究IL-10的角色，将IL-10的中和抗体加入PHA刺激的培养物中，并且所述中和抗体并不克服IL-21对IgE生成的抑制作用。
已经报导一些其他细胞因子阻断IgE生成，包括IL-12(19)和TGF-β(10)。在PBMC培养物中可以检测到IL-12(图6C)和TGF-β，但是存在或不存在IL-21时，用IL-4或者IL-13处理的细胞中水平是相似的。IL-21对PHA、IL-4或IL-13诱导的IL-12Rβ基因表达没有影响(图6D)。从而，IFN-γ、IL-10、IL-12、TGF-β都不能满意地解释IL-21对IL-4驱动的IgE生成的抑制作用。
IL-21不驱动PHA刺激的PBMC培养物中的B细胞凋亡.已经表明IL-21诱导原代鼠B细胞中细胞凋亡(25)。从而，用IL-21处理的PHA刺激的PBMC培养物中的B细胞可能被诱导而凋亡，这解释了IgE生成减少的原因。为了解决该问题，将PHA刺激的PBMC用抗-CD19染色以鉴定B细胞，并通过流式细胞术测定PI和FITC-膜联蛋白的结合。可以区分晚凋亡细胞(PI+/FITC-膜联蛋白+)与早凋亡的(PIneg/FITC-膜联蛋白+)或活的(PIneg/FITC-膜联蛋白neg)B细胞。结果表明，在IL-4处理的培养物中，加入IL-21导致凋亡的CD19+细胞百分数轻微增加，但是凋亡水平与用IL-13或IL-13+IL-21处理的培养物所看到的水平不同(图7)。从而，B细胞凋亡的诱导不能解释IL-21对IgE生成的抑制作用。
回加IL-13不能恢复IL-4和IL-21处理的PBMC中的IgE生成.
因为IL-21抑制应答IL-4但非IL-13时PHA刺激的PBMC的IgE生成(图4)，所以我们研究所有三种细胞因子的存在是否具有净激活或者抑制作用。结果表明IL-4和IL-13的组合对于IgE4生成是抑制性的。从而，IL-13不能挽救从IL-4和IL-21处理的PHA刺激的PBMC产生IgE(图8)，而加入IL-4减少了通常在用IL-13和IL-21处理的PHA刺激的PBMC中的IgE生成(图8B)。
CD40连接克服了IL-21对IgE生成的抑制作用.我们已经观察到在用抗CD40和IL-4刺激的人PBMC中，加入IL-21加强IgE生成(图3)。相比，在PHA和IL-4刺激的PBMC中，加入IL-21阻断IgE生成(图4)。为了帮助调和这些观察，用抗CD40组合IL-4在IL-21存在或不存在下处理PHA活化的PBMC。在这些条件下，IL-21不抑制IgE生成，但是将IgE水平升高到高于仅用IL-4看到的水平(图9)。从而，抗CD40能够克服IL-21对促分裂原活化的PBMC的IgE生成的抑制作用。
IL-21不减少PHA刺激的经辐射的PBMC的IgE生成.在这些研究中，组合IL-4+IL-21极大地加强了PHA刺激的T细胞扩增。因为T细胞可以应答IL-4，所以IL-4可能从这些培养物耗尽。根据该情况，在第3-5天可以见到最初的Iε转录物(图4C)，但是一旦T细胞数目变得太高，IL-4水平就不能维持B细胞IgE或者IgG4产生。因为T细胞不与IL-13相互作用，所以该细胞因子将不被耗尽，并且B细胞IgE产生可以在PHA和IL-13处理的培养物中维持。
为了检验T细胞扩增促进用IL-4和IL-21处理的PHA刺激的培养物中减小的IgE产生这一假说，PBMC在PHA刺激后进行辐射。将纯化的B细胞回加至占培养物的20％，以接近正常PBMC的B细胞频率。将细胞用如上述的细胞因子处理，并在第13天检查IgE产生。在通过辐射防止T细胞扩增的情况下，加入IL-21没有减少IL-4介导的IgE产生(图10A)。然而，在平行设置的非辐射的培养物中，IL-21没有导致IgE产生减少(图10B)，与图4A、B中显示的结果一致。这些观察提示向IL-4处理的、PHA刺激的PBMC加入IL-21导致IgE产生的表观减少对于淋巴细胞扩增是次要的(secondary)并且不是对B细胞的直接作用。
讨论体外IgE转换重组需要两种不同的信号(i)细胞因子IL-4或者IL-13来驱动Iε种系转录物的产生；和(ii)B细胞表面CD40抗原的参与以促进缺失转换重组(42)。细胞因子提供了该过程的重要调节。已经表明IL-21抑制鼠系统中的IgE产生(26，27)，但是还没有更详细研究其对人IgE生成的影响。我们已经检查了在三种不同的活化模型下，IL-21对人IgE生成的影响，并且发现，取决于这些条件，IL-21可以是刺激性的或者抑制性的。
IL-21是活化的T细胞产生的多效细胞因子，其影响许多免疫细胞类型(22，23)。在合适的条件下，它诱导B细胞增殖(22)或者B细胞凋亡(25)。在鼠系统中，IL-21阻断体外应答IL-4和促分裂原刺激和体内特异免疫接种时IgE的产生(26，27)。因此，IL-21R-缺陷小鼠与野生型小鼠相比具有升高的血清IgE静止水平(23)，并且当免疫接种或者感染时产生更高水平的IgE(26)。在分离的鼠B细胞中，IL-21直接拮抗IL-4和LPS诱导的Iε转换重组(27)。
我们现在报导IL-21增强分离的人B细胞中IL-4-或IL-13-介导的IgE生成。IL-21不仅加强纯化的B细胞的IgE合成，而且增强IL-4-或IL-13-处理的PBMC(其中用抗CD40 mAb实现B细胞活化)的IgE合成。静止的人外周血B细胞表达IL-21受体，并且IL-21可以增强抗-CD40诱导的B细胞增殖(22)。我们观察到在IL-21存在下，IL-4-或IL-13处理的B细胞的3H胸苷掺入增加。从而，IL-21存在下看到的IgE产生的增强可以至少部分是IL-21介导的B细胞扩增的结果。
相比，当PHA激活的T细胞用作IgE产生的共刺激信号来源时，观察到IL-21的抑制作用。在这些条件下，IL-21阻断IL-4而非IL-13驱动的IgE合成。尽管不是结论性的，但是这些观察指向依赖T细胞的机理，因为PHA是T细胞促分裂原并且T细胞应答IL-4而不应答IL-13。因为抗-CD40抗体可以克服该抑制，所以牵涉到CD40L功能或者表达。此外，我们观察到不存在IgE合成时的Iε种系转录物，其是CD40L表达(43，44)或者CD40信号传递(45)中的缺陷的特征。然而，CD40L转录物不被IL-21减少，其中CD40L转录物是不稳定的并且对蛋白质表达是限制性的(37，38)。从而，我们推测IL-21可以引起额外的细胞表面信号，其阻断该系统中T细胞-B细胞相互作用，或者减小CD40L信号的强度。
已经描述一些细胞因子拮抗IgE的产生，这些细胞因子包括TGF-β(10，46，47)、IFN-γ(10，13，14，46)、IL-10(21，48)和IL-12(18)。我们比较了其中IgE被产生或者受抑制的培养物中这些细胞因子的水平。TGF-β在所有培养物中都检测到，但是显示与IgE水平无关。IFN-γ转录由PHA刺激的PBMC培养物中IL-21引起，与以前的报导(36，40)一致，但是与IgE合成的损失无关。用IL-4+IL-21处理(其中IgE产生受到阻断)或者IL-13+IL-21处理(其中没有抑制)可以保持IFN-γ转录。
IL-10以依赖单核细胞的方式阻断IgE产生，从而它对纯化的B细胞没有抑制活性(49)，类似于当前用IL-21得到的发现。尽管在PBMC培养物中发现了IL-10，但是它与IgE的生成的抑制无关。在用抗-CD40mAb或PHA刺激的培养物中看到等同水平，尽管用PHA仅抑制IgE。在PHA处理的PBMC中，用IL-4+IL-21(其抑制IgE的产生)和用IL-13+IL-21(其刺激IgE的产生)产生了IL-10的相当的水平。针对IL-10的中和抗体没有逆转IL-21的抑制作用。这些观察表明IL-10不负责该系统中看到的IL-21的作用。
已经报导IL-12减小未分级分离的PBMC而非纯化的B细胞的IL-4驱动的IgE产生(18)，类似于当前用IL-21观察到的结果。此外，IL-21可以影响淋巴细胞对IL-12的应答。IL-21上调人NK细胞系和原代人T细胞中IL-12Rβ2的转录(40)，极大地增强了小鼠NK细胞的IL-12介导的IFN-γ分泌，并且促进对IL2Rα基因的IFN-γ-激活的序列的IL-12-介导的STAT4结合(40)。
IL-21驱动鼠B细胞的细胞凋亡，甚至已经用LPS刺激的鼠B细胞的细胞凋亡(25，50)。IL-4不能挽救IL-21处理的B细胞免于凋亡，但是用抗-CD40 mAb预活化可以起保护作用(25)。从而，用IL-4和PHA刺激的未分级分离的PBMC的IgE产生可以减少，因为B细胞已经经历了细胞凋亡，而用抗-CD40 mAb刺激的那些PBMC受到保护。我们发现PBMC培养物中B细胞的凋亡，用IL-21处理使得凋亡稍微增强，但是加入产生的IL-4引起的细胞凋亡不超过仅IL-21或者IL-13+IL-21引起的细胞凋亡。从而，导致减少的IgE生成的条件与增强的B细胞凋亡无关。
缺少IL-4或者IL-13的小鼠不产生野生型水平的IgE(51，52)，表明仅一种细胞因子不能完全弥补其他细胞因子的损失。实际上，IL-13可能是特应性应答的主要驱动者，因为尽管存在IL-4，但是选择性中和(53)或者缺失(54)IL-13保护小鼠免于发生哮喘病理。最近，Hajoui etal.(55)已经证明B细胞自身产生IL-13是应答IL-4产生IgE所需的，并且提出B细胞产生IL-13是IL-4诱导的IgE合成必需的。我们观察到用IL-4处理的PHA刺激的PBMC中IL-13产生，其在加入IL-21后减少一半。此外，我们发现IL-21拮抗PHA刺激的PBMC中IL-4诱导的IgE产生，而IL-13应答保持强烈，该发现表明IL-21在该自分泌途径的调节中的作用。
然而针对变应原的IgE是发生特应性疾病必要且足够的(56)，长期以来认为IgG4是保护性的(4，5，6，7)。我们发现仅用IL-21处理促分裂原活化的PBMC刺激IgG4释放。在这些条件下不产生IgE，表明在合适环境下，IL-21可能能够偏转IgG4和IgE之间的平衡。相比，尽管IL-4或者IL-13产生高水平的Iγ4种系转录物，但是我们和其他人(57)发现仅这些细胞因子不导致从人外周B细胞释放可检测的IgG4蛋白质。Ig基因重排和抗体分泌是受差别调节的事件(58)。IL-4诱导幼稚B细胞中IgG4转换重组，但是可以抑制已经转换到IgG4的那些细胞中成熟蛋白质的分泌(59)。仅用IL-21看到相反面，IL-21不导致高于未受刺激水平的Iγ4种系转录物，但是强烈增强IgG4蛋白质的分泌。IL-21诱导所有人IgG同种型的分泌，而促进仅特别从头转换重组成IgG1和IgG3(57)。没有从头转录时蛋白质的释放表明，IL-21促进已经体内定型的B细胞克隆的活化或者扩增而产生IgG4，这是以前表明可解释在体外IgG4的IL-4/IL-13-独立的产生的一种过程(60)。
总之，这些研究表明，取决于活化条件，IL-21刺激或者抑制人B细胞的IgE和IgG4产生。IL-21在其他系统中有相似的对立的应答。在合适条件下，它可以诱导NK细胞活化和/或凋亡，刺激或限制T细胞扩增，和诱导或者抑制T细胞IFNγ产生(61)。在鼠系统中，IL-21引发用LPS处理的B细胞的凋亡，但是共同刺激用抗CD40或抗-IgM处理的B细胞的增殖(25，50，62)。已经提出，IL-21作为生产性免疫应答的限制点，驱动许可条件下的活化和增殖，而促进不适当活化的或者不利环境中的淋巴细胞的凋亡(50，61，62)。在当前研究的上下文中，IL-21似乎对人IgE的产生发挥调节影响，提高水平或者确保防止过度产生该关键的效应分子。
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本领域技术人员将认识到，或者仅仅使用常规实验方法就可以确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案意在被下面的权利要求包括。
序列表<110>WyethKasaian，MarionWood，Nancy L.
Donaldson，Debra D.
Collins，Mary<120>免疫球蛋白产生和特应性疾病的调节<130>16158-016WO1<150>US 60/572,407<151>2004-05-19<160>12<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>617<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc 60tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca 120caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat 180tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga 240agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa 300gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag 360gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg 420tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca 480aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc 540taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg 600
tat tccaagt ggaggag617<210>2<211>131<212>PRT<213>人<400>2Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp1 5 10 15Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala20 25 30Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe35 40 45Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile50 55 60Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn65 70 75 80Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser85 90 95Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu100 105 110Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser115 120 125Glu Asp Ser130
<210>3<211>3072<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>3gagaaccaga ccaaggccct gtcatcagct cctggagact cagttctggt ggcatggaga 60ggacccttgt ctgtctggta gtcatcttct tggggacagt ggcccataaa tcaagccccc 120aagggccaga tcgcctcctg attagacttc gtcaccttat tgacattgtt gaacagctga 180aaatctatga aaatgacttg gatcctgaac ttctatcagc tccacaagat gtaaaggggc 240actgtgagca tgcagctttt gcctgttttc agaaggccaa actcaagcca tcaaaccctg 300gaaacaataa gacattcatc attgacctcg tggcccagct caggaggagg ctgcctgcca 360ggaggggagg aaagaaacag aagcacatag ctaaatgccc ttcctgtgat tcgtatgaga 420aaaggacacc caaagaattc ctagaaagac taaaatggct ccttcaaaag atgattcatc 480agcatctctc ctagaacaca taggacccga agattcctga ggatccgaga agattcccga 540ggactgagga gacgccggac actatagacg ctcacgaatg caggagtaca tcttgcctct 600tgggattgca agtggagaag tacgatacgt tatgataaga acaactcaga aaagctatag 660gttaagatcc tttcgcccat taactaagca gacattgtgg ttccctgcac agactccatg 720ctgtcaacat ggaaaatctc aactcaacaa gagcccagct tcccgtgtca gggatttctg 780gtgcttctca agctgtggct tcatcttatt gcccaactgt gacattcttt gattggaagg 840ggaaaactaa agcttttagc aaaaatacag ctagggaatt tgtcgatctg cgagagtaag 900acctcttatg atcctaacgg aatgatgtaa gctggaaata ataagcataa gatgaaattg 960aaaattgaag tctttattct ttaagaaaaa ctttgtactt gaaagcatgt ctgaagagtt 1020tactcattac cacaaacatc tagcatattg ataactaaca tctttatact ctacaagaga 1080
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权利要求
1.减轻受试者中特应性疾病的症状的方法，该方法包括对该受试者施用IL-21途径激动剂，其用量有效减轻该特应性疾病的至少一种症状。
2.权利要求1的方法，其中IL-21途径激动剂是IL-21多肽。
3.权利要求2的方法，其中IL-21多肽是人的。
4.权利要求2的方法，其中IL-21多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
5.权利要求1的方法，其中IL-21途径激动剂是编码IL-21多肽的核酸。
6.权利要求1的方法，其中所述特应性疾病选自由特应性皮炎、哮喘、外源性支气管哮喘、荨麻疹、湿疹、变应性鼻炎和变应性肠胃炎构成的组。
7.权利要求1的方法，其中受试者是人。
8.权利要求1的方法，其中IgE水平相对于施用前受试者中的水平减少至少40％。
9.权利要求1的方法，其还包括评估受试者中所述特应性疾病的一种或多种症状。
10.权利要求1的方法，其还包括评估受试者中IL-21有关的参数。
11.权利要求1的方法，其还包括评估受试者中内源IgE的水平。
12.治疗或者预防人类受试者中特应性疾病的方法，该方法包括对受试者施用IL-21途径激动剂，其用量有效治疗或者预防该特应性疾病。
13.权利要求12的方法，其中IL-21途径激动剂是IL-21多肽。
14.权利要求13的方法，其中IL-21多肽是人的。
15.权利要求14的方法，其中IL-21多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
16.权利要求12的方法，其中所述特应性疾病选自由特应性皮炎、哮喘、外源性支气管哮喘、荨麻疹、湿疹、变应性鼻炎和变应性肠胃炎构成的组。
17.调节细胞中IgG产生的方法，该方法包括将IL-21途径调节剂以足够调节IgG产生的量接触所述细胞。
18.权利要求17的方法，其中IgG的产生增加并且IL-21途径调节剂是IL-21途径激动剂。
19.权利要求18的方法，其中IL-21途径激动剂是IL-21多肽。
20.权利要求17的方法，其中IgG的产生减少并且IL-21途径调节剂是IL-21途径拮抗剂。
21.权利要求20的方法，其中IL-21途径拮抗剂是结合IL-21的抗体或者包含IL-21受体可溶形式的试剂。
22.权利要求20的方法，其中IL-21途径拮抗剂是减少IL-21、IL-21受体，或者IL-21途径组分的核酸。
23.权利要求17的方法，其中所述细胞在体外。
24.权利要求17的方法，其中所述细胞在体内。
25.调节细胞中IgE产生的方法，该方法包括将IL-21途径调节剂以足够调节IgE产生的量接触所述细胞。
26.权利要求25的方法，其中IgE的产生减少并且IL-21途径调节剂是IL-21途径激动剂。
27.权利要求26的方法，其中IgE水平降低至少40％。
28.权利要求25的方法，其中IgE的产生增加并且IL-21途径调节剂是IL-21途径拮抗剂。
29.权利要求28的方法，其中IgE水平升高至少20％。
30.调节IgE和IgG的相对水平的方法，该方法包括将IL-21途径调节剂以足够调节IgE和IgG的相对水平的量接触所述细胞。
31.权利要求30的方法，其中IgE/IgG比例减小并且IL-21途径调节剂是IL-21途径激动剂。
32.权利要求31的方法，其中IL-21途径激动剂是IL-21多肽。
33.权利要求31的方法，其中所述比例减小至少40％。
34.利要求30的方法，其中IgE/IgG比例增加并且IL-21途径调节剂是IL-21途径拮抗剂。
35.权利要求31的方法，其中所述比例增加至少20％。
36.权利要求30的方法，其中通过抑制Iε转录物所需的转换重组来调节所述相对水平。
37.权利要求30的方法，其中所述相对水平在T细胞存在下受到调节。
38.药物组合物，其包含IL-21途径激动剂和用于治疗特应性疾病的第二种试剂。
39.容器，其包含IL-21途径激动剂的药物组合物的一个或多个剂量和标签，所述标签包含关于施用一剂该组合物以治疗特应性疾病或病症的使用说明书。
40.评估患有或者怀疑患有特应性疾病的受试者的方法，该方法包括为患有特应性疾病的受试者评估IL-21相关的参数，比较评估结果与参照参数，和作为所述比较的函数，为所述疾病的疗法提供建议。
41.权利要求40的方法，其中IL-21相关的参数包含IL-21多肽丰度或者IL-21mRNA的定量或者定性值。
42.权利要求40的方法，其中IL-21相关的参数包含IL-21受体蛋白质或者mRNA或者IL-21途径活性的定量或者定性值。
43.权利要求40的方法，其中所述特应性疾病选自由特应性皮炎、哮喘、外源性支气管哮喘、荨麻疹、湿疹、变应性鼻炎和变应性肠胃炎构成的组。
44.评估受试者的特应性疾病风险的方法，该方法包括为受试者评估IL-21相关的参数，比较评估结果与参照参数，和作为所述比较的函数，提供特应性疾病的风险评估。
全文摘要
IL－21多肽或者其他IL－21途径激动剂可以用于治疗特应性疾病，如哮喘。
文档编号C07K1/00GK1980698SQ200580016235
公开日2007年6月13日 申请日期2005年5月19日 优先权日2004年5月19日
发明者M·T·卡赛安, N·L·伍德, D·D·唐纳森, M·科林斯 申请人:惠氏公司