专利名称：同位素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同位素氮15标记-L-半胱氨酸和L-胱氨酸的制备方法，具体涉及利用有机合成的方法，制备15N标记L-半胱氨酸和L-胱氨酸。
背景技术：
氮-15(简称15N，下同)是氮元素的稳定同位素，可以用作示踪剂，广泛应用于生物化学、医学、药物学、农业科学等领域，尤其对生命科学研究有极为重要的意义。特别是在蛋白质的人工合成方面，氮-15氨基酸起着独特的示踪作用，其应用越来越广泛，市场前景良好。
此类产品产量小，对纯度和丰度要求高。目前主要是通过化学合成法或生物发酵法生产。化学合成法设备要求简单，生产的氨基酸是DL型氨基酸(消旋体)，丰度高，但不具有光学活性，需要再经化学或酶法拆分得到L型氨基酸。D型氨基酸大多被废弃，导致氮-15原料利用率降低，增加了生产成本。生物发酵法具有反应步骤少，产品光学纯度高的优点。但需要较大的设备投入，对菌种的要求高，后提取步骤较多。
L-半胱氨酸和L-胱氨酸均为含硫氨基酸，是构成蛋白质的主要成分，属非必需氨基酸，其化学合成法生产十分困难。目前国内外报导的方法均为生物化学法。主要以动物毛发经水解、分离、精制后得到，是当前L-半胱氨酸、L-胱氨酸常用的生成方法。但目前尚未看到由化学合成法制备同位素15N标记L-半胱氨酸的方法。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种同位素15N标记L-半胱氨酸的制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现同位素15N标记L-半胱氨酸的制备方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤(1)邻苯二甲酰亚胺钾盐的制备将含有15N标记无机氮源与碱性溶液作用，经邻苯二甲酸溶液充分吸收氨气后，蒸除溶剂，加热后得到邻苯二甲酰亚胺固体，将该固体与KOH的甲醇溶液作用得到邻苯二甲酰亚胺钾盐；无机氮源、邻苯二甲酸、KOH的用量比为1∶1～5∶1～3；(2)邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯钠盐的制备将邻苯二甲酰亚胺钾盐与新鲜制备的溴代丙二酸二乙酯作用，经加热、冷却、研磨、洗涤后得到邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯；再将该前体加热溶解于适量无水甲苯，加入稍过量的金属钠，搅拌反应1～7小时，冷却过滤后得到黄色产物，为15N标记的邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯钠盐，简称钠盐，下同；(3)缩合反应将钠盐和苄基氯甲硫醚、无水甲苯共热并回流5～25小时后，过滤沉淀，蒸除滤液中的甲苯，并经无水乙醇重结晶后得到15N标记的N-苄基氯甲硫醚基邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯，简称缩合产物，下同；(4)水解反应将缩合产物悬浮于乙醇与水的1∶1混合物中，于搅拌下加入5mol/L NaOH，并保持温度在55～60℃反应1～12小时，再加入足量HCl彻底水解；母液调pH值至中性后，析出的沉淀经乙醇洗涤、过滤、重结晶后，得到晶体状15N标记的D，L-苄基半胱氨酸；(5)拆分过程采用氨基酰化酶法拆分的方法，将上述D，L-苄基半胱氨酸经乙酰化、氨基酰化酶拆分，分离后得到15N标记的L-苄基半胱氨酸；未反应的D-型乙酰化苄基半胱氨酸可经消旋后继续用于拆分；(6)解保护反应L-苄基半胱氨酸于-70～-33.5℃低温下，溶解于适量液氨中，缓慢加入小块金属钠至体系维持蓝色3～5min不褪；反应完成后蒸发除去液氨，残余物缓慢加水溶解，调pH值至中性、空气流氧化，过滤、干燥后，得到15N标记的L-胱氨酸，经还原后可得到15N标记的L-半胱氨酸。
所述的步骤(1)中15N标记无机氮源选自(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl或NH4HCO3中的一种或几种。
所述的步骤(3)中苄基氯甲硫醚的制备方法包括以下工艺步骤将苄硫醇与稍过量的三聚甲醛混合后，冰浴下冷却，并用干燥HCl气饱和，加入足责备量无水CaCl2，再于室温下保持10～30小时后过滤，滤液经洗涤、干燥，减压下蒸馏，收集102℃、2mmHg的馏分，得到苄基氯甲硫醚。
所述的步骤(4)、(5)、(6)中可得到15N标记半胱氨酸的相关衍生产品，该衍生产品包括L-、D-以及D，L-型的苄基半胱氨酸、乙酰化苄基半胱氨酸、半胱氨酸、胱氨酸。
本发明提供了一套15N标记L-半胱氨酸和L-胱氨酸的制备方法。在现有的有机合成α-氨基酸技术的基础上，结合15N原料昂贵的特点，选择适宜的合成前体，优化合成路线和工艺，使之具有良好的经济性。该方法适用于合成15N标记的L-、D-、D，L-型半胱氨酸、胱氨酸。本方法过程较为简单，15N原料利用率高，得到的L-半胱氨酸及其衍生产品纯度在99％以上，丰度在98％以上。
具体实施例方式
实施例1一种同位素15N标记L-胱氨酸的制备方法，该方法包括以下工艺步骤(1)邻苯二甲酰亚胺钾盐的制备将60ml浓度为4mol/L的NaOH溶液缓慢滴加到放置有5.45g(0.10mol)15NH4Cl的烧瓶中，产生的氨气鼓泡通入含18.27g(0.11mol)的邻苯二甲酸悬浮液中，经邻苯二甲酸溶液充分吸收氨气后，蒸除水分，升温300℃后得到邻苯二甲酰亚胺固体。将制得的固体与溶有70.14g(0.125mol)KOH的甲醇溶液作用，得到17.7g邻苯二甲酰亚胺钾盐，收率95％。
(2)邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯钠盐的制备将17.7g(0.095mol)邻苯二甲酰亚胺钾盐与新鲜制备的25.1g(0.105mol)溴代丙二酸二乙酯作用，经油浴加热、冷却、研磨、洗涤后得到邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯。再将该前体加热溶解于适量甲苯，加入2.4g(0.104mol)的金属钠，搅拌反应1～7小时，冷却过滤后得到24.95g(0.076mol)黄色产物，为15N标记的邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯钠盐(简称钠盐，下同)，收率80％。
(3)缩合反应将24.95g(0.076mol)钠盐和14.7g(0.085mol)苄基氯甲硫醚、200ml无水甲苯共热并回流6小时后，将沉淀过滤、洗涤，并经无水乙醇重结晶后，得到20.51g(0.046mol)15N标记的N-苄基甲硫醚基邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯(简称缩合产物，下同)，收率61％。
(4)水解反应取20.51g(0.046mol)15N标记的缩合产物悬浮于100ml乙醇与水的1∶1混合物中，于搅拌下加入50ml浓度为5mol/L NaOH溶液，并保持温度在55～60℃反应6小时，再加入过量浓HCl彻底水解。母液用氨水调至中性后，析出的沉淀经乙醇洗涤、过滤、重结晶后，得到5.41g(0.0255mol)晶体状15N标记的D，L-苄基半胱氨酸，收率55％，熔点212～215℃。
(5)拆分将上述得到的5.41g(0.0255mol)D，L-苄基半胱氨酸在NaOH溶液中与过量乙酸酐反应，得到的乙酰化产物溶解于50ml NaOH溶液中，调节pH值至8，加入0.5g氨基酰化酶，拆分完成后，经分离得到2.16g15N标记的L-苄基半胱氨酸，熔点211～214℃，[α]20D＝+19.4°(c＝1mol/L NaOH)。单程收率80％。未反应的D-型乙酰化苄基半胱氨酸可经消旋后继续用于拆分。
(6)解保护2.16g(0.010mol)15N标记的L-苄基半胱氨酸于低温下(-70～-33.5℃)，溶解于50ml液氨中，缓慢加入小块金属钠至体系，维持蓝色3～5min不褪；反应完成后蒸发除去液氨，残余物缓慢加水溶解，调pH值至中性、空气流氧化，过滤、干燥后，得到0.95g(0.0039mol)15N标记的L-胱氨酸，收率78％。
实施例2一种同位素15N标记L-半胱氨酸的制备方法，其中步骤(1)～(6)与实施例1相同，该方法还包括以下工艺步骤(7)还原反应将0.95g(0.0039mol)15N标记L-胱氨酸(0.01mol)溶解于20ml浓度为2mol/L的HCl溶液中，加入0.5g(0.042mol)金属锡粉，55℃下搅拌反应5小时，室温放置过夜，通入H2S气体至终点后，过滤，滤液减压浓缩后经多次结晶，真空干燥后得到0.87g L-半胱氨酸盐酸盐(0.0035mol)，收率90％，熔点173～175℃。
权利要求
1.同位素15N标记L-半胱氨酸的制备方法，其特征在于，该方法包括以下工艺步骤(1)邻苯二甲酰亚胺钾盐的制备将含有15N标记无机氮源与碱性溶液作用，经邻苯二甲酸溶液充分吸收氨气后，蒸除溶剂，加热后得到邻苯二甲酰亚胺固体，将该固体与KOH的甲醇溶液作用得到邻苯二甲酰亚胺钾盐；无机氮源、邻苯二甲酸、KOH的用量比为1∶1～5∶1～3；(2)邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯钠盐的制备将邻苯二甲酰亚胺钾盐与新鲜制备的溴代丙二酸二乙酯作用，经加热、冷却、研磨、洗涤后得到邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯；再将该前体加热溶解于适量无水甲苯，加入稍过量的金属钠，搅拌反应1～7小时，冷却过滤后得到黄色产物，为15N标记的邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯钠盐，简称钠盐，下同；(3)缩合反应将钠盐和苄基氯甲硫醚、无水甲苯共热并回流5～25小时后，过滤沉淀，蒸除滤液中的甲苯，并经无水乙醇重结晶后得到15N标记的N-苄基氯甲硫醚基邻苯二甲酰亚胺抱丙二酸二乙酯，简称缩合产物，下同；(4)水解反应将缩合产物悬浮于乙醇与水的1∶1混合物中，于搅拌下加入5mol/L NaOH，并保持温度在55～60℃反应1～12小时，再加入足量HCl彻底水解；母液调pH值至中性后，析出的沉淀经乙醇洗涤、过滤、重结晶后，得到晶体状15N标记的D，L-苄基半胱氨酸；(5)拆分过程采用氨基酰化酶法拆分的方法，将上述D，L-苄基半胱氨酸经乙酰化、氨基酰化酶拆分，分离后得到15N标记的L-苄基半胱氨酸；未反应的D-型乙酰化苄基半胱氨酸可经消旋后继续用于拆分；(6)解保护反应L-苄基半胱氨酸于-70～-33.5℃低温下，溶解于适量液氨中，缓慢加入小块金属钠至体系维持蓝色3～5min不褪；反应完成后蒸发除去液氨，残余物缓慢加水溶解，调pH值至中性、空气流氧化，过滤、干燥后，得到15N标记的L-胱氨酸，经还原后可得到15N标记的L-半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的同位素15N标记L-半胱氨酸的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中15N标记无机氮源选自(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl或NH4HCO3中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的同位素15N标记L-半胱氨酸的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中苄基氯甲硫醚的制备方法包括以下工艺步骤将苄硫醇与稍过量的三聚甲醛混合后，冰浴下冷却，并用干燥HCl气饱和，加入足责备量无水CaCl2，再于室温下保持10～30小时后过滤，滤液经洗涤、干燥，减压下蒸馏，收集102℃、2mmHg的馏分，得到苄基氯甲硫醚。
4.根据权利要求1所述的同位素15N标记L-半胱氨酸的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)、(5)、(6)中可得到15N标记半胱氨酸的相关衍生产品，该衍生产品包括L-、D-以及D，L-型的苄基半胱氨酸、乙酰化苄基半胱氨酸、半胱氨酸、胱氨酸。
全文摘要
本发明涉及同位素
文档编号C07C323/58GK101041630SQ200610024939
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月22日 优先权日2006年3月22日
发明者汤财德, 罗勇, 王博, 强歌, 李美华 申请人:上海化工研究院