专利名称：从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白的提取纯化工艺，具体是从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白的方法。
背景技术：
肌红蛋白是脊椎动物骨骼肌和心肌组织胞浆中一种重要的血红素蛋白，肌红蛋白具有可逆地与氧结合的性质，它的主要功能是在肌细胞内运输和储存氧。高铁肌红蛋白(MetMb)是它的氧化形式，它在动物体内在一定的酶系的作用下可以与脱氧肌红蛋白和氧合肌红蛋白相互转化，这对完成正常的呼吸过程具有重要的生理作用，这个过程如果发生障碍将影响呼吸过程的正常进行。纯化的高铁肌红蛋白可以应用于动物肉色稳定性的研究等，也可以作为人的克山病检测的底物。因此，纯化的高铁肌红蛋白可以作为生物试剂应用于临床检测和研究。
高铁肌红蛋白的分离纯化国内目前还没有相关报导，在国外文献中曾报导了从牛肉中提纯氧合肌红蛋白的方法，但这些方法需要特殊的设备，如TSK-2000W凝胶高压层析柱、高效液相色谱(HPLC)等，且所需时间较长，一般为3天左右(Gotoh，T.andShikama，K.(1976).Biochom.J.，80，397、Krzywicki，K.(1982).Meat Sci.，7，29、Gatellier，Ph.，Anton，M.and Renerre，M.(1993).Meat Sci.，33，401、Renerre M，AntonM，Gatellier，Ph.(1992).Meat Science，32，331)。不适于工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取纯化高铁肌红蛋白的方法，该方法选用DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-200HR两种层析介质，采用色谱法从猪心中分离和纯化高铁肌红蛋白，可在较短的时间内得到电泳纯的高铁肌红蛋白，且得率高，有效地解决了问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白的方法，包括以下步骤1)将新鲜动物心肌剁碎，加入冰冷的肌红蛋白萃取缓冲液，经匀浆、离心、过滤后得粗提液；所说的肌红蛋白萃取缓冲液是10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0；
2)粗提液经70％-100％硫酸铵盐析，得到的沉淀用平衡缓冲液A重悬，再加入过量的K3Fe(CN)6，离心后取上清液对平衡缓冲液A透析，透析膜的截留分子量为14000，得透析液；所说的平衡缓冲液A是10mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mM NaCl，pH8.5；3)将透析液上样到DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用平衡缓冲液A洗脱，收集洗脱峰对应的红褐色洗液；4)将收集的洗脱液泠冻干燥浓缩后，上样到Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析柱，用平衡缓冲液B洗脱，收集洗脱峰相对应的红褐色洗脱液，即得到纯化的高铁肌红蛋白；所说的平衡缓冲液B是100mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.5。
为了便于保存，可将得到的产品冷冻干燥后分装，于-80℃保存。
与通常的蛋白质提取纯化相似，其中第2～4步最好在4℃下进行。
本发明方法中所说的动物心肌，优选猪心肌，因为其来源广、成本低；其他动物如牛、羊等的心肌同样可做为原材料。对于本领域的技术人员，可以理解，除心肌外，其他富含高铁肌红蛋白的动物肌肉如骨骼肌，同样可参照本发明的步骤，制备高铁肌红蛋白。
目前我国很多医院和科研机构在做肌红蛋白方面的研究，高铁肌红蛋白标准品都需要从Sigma公司购进，价格昂贵。Sigma公司高铁肌红蛋白的售价为150美元/克左右，且纯度只能达到≥95％，而通过本发明方法从心肌中提纯得到的高铁肌红蛋白纯度大于Sigma公司的，纯度达到电泳纯，得率达到14.1％。而且猪心等原材料可直接从屠宰场采购，成本低廉。因此本发明方法具有产品纯度高，工艺简单、成本低等优点，既可填补我国该生物试剂制备的空白，又具有较高的经济价值。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是DEAE-Sepharose Fast Flow层析图谱图2是Sephacryl S-200HR分子筛层析图谱图3是SDS-PAGE电泳图其中M.蛋白marker；1.粗提液；2.透析后样品；3.经离子交换后样品；4.凝胶层析后样品图4A是粗提液样品电泳后凝胶扫描4B是经硫酸铵盐析样品电泳后凝胶扫描4C是经离子交换层析样品电泳后凝胶扫描4D是凝胶层析后样品电泳后凝胶扫描5是MetMb的分光光度计扫描图具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照附图数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例及附图只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1高铁肌红蛋白的制备材料新鲜猪心，阴离子交换层析材料(DEAE-Sepharose Fast Flow，Pharmacia)，凝胶过滤层析材料(Sephacryl S-200HR，Amersham-Pharmacia)，马心肌高铁肌红蛋白标准品(Sigma，purity＞90％)，考马斯亮蓝试剂盒，其它试剂均为分析纯。肌红蛋白萃取缓冲液10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0；平衡缓冲液A10mM Tris-HCl，1mMEDTA，10mM NaCl，pH8.5；平衡缓冲液B100mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.5。主要仪器及试剂DS-1高速组织捣碎机，FJ-200高速分散匀质机，JB-2型恒温磁力搅拌器，PHS-3C型精密pH计，BioLogic LP层析系统，Gel Doc2000成像系统，JeDa801凝胶分析软件，Spectrumlab54紫外可见分光光度计，LGJ1.5冷冻干燥机，LGR10-4.2冷冻高速离心机，Eppendorf 5415R台式冷冻高速高心机，DYY-12型电泳仪和电泳槽。方法(1)粗提取去掉脂肪和结缔组织的新鲜猪心约220克，切成小块，用冰冷的生理盐水冲洗，除去残留的血液。再剁碎，按1∶2的比例(V/M)加入肌红蛋白萃取缓冲液440ml，用DS-1高速组织捣碎机捣碎。再用FJ-200高速分散匀质机以20000rpm匀浆100s，4℃静置萃取1h后，以5000rpm，4℃下离心10min，上清液用中速定性滤纸进行粗滤，得粗提液350ml。
(2)盐析及透析滤液用2M冷铵水调节pH值至8.0，4℃下，10000rpm离心20min。将盛上清液的烧杯置JB-2型恒温磁力搅拌器上，缓慢加入固体(NH4)2SO4至70％饱和度，用2M冷铵水调节pH值至8.0，静置30min后，4℃下以10000rpm离心20min，弃沉淀。上清液再缓慢加入固体(NH4)2SO4至100％饱和度，用2M冷铵水调节pH值至8.0。静置30min，10000rpm离心25min，弃上清，沉淀用冷的平衡缓冲液A重悬。加入过量的K3Fe(CN)6，10000rpm离心10min，取上清对平衡缓冲液A透析(14000MWcut-off)过夜，其间换液3次，得透析液102ml。
(3)离子交换层析得到的透析液以0.4ml/min的流速上样到用平衡缓冲液A平衡过夜的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，以同一缓冲液洗去未结合的蛋白，再用含100mM NaCl的同一缓冲液进行洗脱，洗脱速度为1.25ml/min。280nm下自动检测并记录，自动收集洗脱峰对应的洗脱液。层析图谱如图1所示，洗脱峰对应的流出液为红褐色。
(4)凝胶过滤将上述收集的洗脱液经LGJ1.5冷冻干燥机冷冻干燥浓缩后，上样到用平衡缓冲液B平衡好的Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析柱，用同一缓冲液洗脱，洗脱速度为1ml/min，收集红褐色洗脱液，即得到高铁肌红蛋白。层析图谱如图2所示，曲线上有3个峰，第一个峰对应的为无色液体，第二个峰对应的为红褐色液体，第三个峰对应的也为无色液体。
(5)将得到的产品冷冻干燥后，于-80℃保存。
实施例2高铁肌红蛋白的定性与定量将实施1中(1)-(4)步骤得到的粗提样品、透析液样品、经离子交换层析样品和经凝胶过滤处理样品进行SDS-PAGE电泳试验，结果如图3所示。电泳后凝胶用Gel Doc2000成像系统拍照后，经JeDa801凝胶分析软件进行条带扫描定量分析，结果如图4。
从图3及图4分析可知，粗提样品中含有的蛋白种类较多，且蛋白之间不能很好分开(图4A)；经70％-100％硫酸铵分段盐析并透析后，大致可以看到九个条带，即主要由九种蛋白质构成，且电泳后凝胶扫描可知，透析后的提取液中MetMb的相对含量为39.29％(图4B)；再经离子交换层析后，大致由五条带组成，条带也较清晰，且MetMb所对应条带浓度最高，经扫描可知MetMb的相对含量已经达到了88.12％(图4C)；最后经凝胶过滤后，只留下一个条带，表明已经纯化得到了电泳纯的蛋白，含量大于98％(图4D)，此蛋白的分子量在17000左右。
将凝胶过滤后收集的第二个峰对应的为红褐色液体和马心肌高铁肌红蛋白标准品进行波长扫描，通过分光光度计扫描图谱(图5)，可见它们均在波长为505nm和630nm处分别有特征吸收峰。由此判定该蛋白就是高铁肌红蛋白。
权利要求
1.一种从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白的方法，包括以下步骤1)将新鲜动物心肌剁碎，加入冰冷的肌红蛋白萃取缓冲液，经匀浆、离心、过滤后得粗提液；所说的肌红蛋白萃取缓冲液是10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0；2)粗提液经70％-100％硫酸铵盐析，得到的沉淀用平衡缓冲液A重悬，再加入过量的K3Fe(CN)6，离心后取上清液对平衡缓冲液A透析，透析膜的截留分子量为14000，得透析液；所说的平衡缓冲液A是10mM Tris-HCl，1mM EDTA，10mMNaCl，pH8.5；3)将透析液上样到DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，用平衡缓冲液A洗脱，收集洗脱峰对应的红褐色洗液；4)将收集的洗脱液泠冻干燥浓缩后，上样到Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析柱，用平衡缓冲液B洗脱，收集洗脱峰相对应的红褐色洗脱液，即得到纯化的高铁肌红蛋白；所说的平衡缓冲液B是100mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH7.5。
2.根据权利要求1所说的从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白的方法其特征在于，其中第2～4步在4℃下进行。
3.根据权利要求1或者2所说的从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白的方法，其特征在于，所说的动物心肌是猪心肌。
4.根据权利要求3所说的从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白的方法，其特征在于，还有步骤5)得到的高铁肌红蛋白液经冷冻干燥，于-80℃保存。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白的提取纯化工艺，具体是从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白的方法。具体的方法是将新鲜动物心肌经前处理，萃取得到组织蛋白粗提物；粗提物再经硫酸铵盐析后，通过截留分子量为14000的透析处理得透析样品；将透析样品经DEAE－Sepharose Fast Flow阴离子交换层析，收集红褐色洗脱液；收集的洗脱液再经Sephacryl S－200HR凝胶过滤层析，收集洗脱峰相对应的红褐色洗脱液，即得到纯化的高铁肌红蛋白。本发明方法具有产品纯度高，工艺简单、成本低等优点，既可填补我国该生物试剂制备的空白，又具有较高的经济价值。
文档编号C07K14/805GK1800202SQ200610037909
公开日2006年7月12日 申请日期2006年1月20日 优先权日2006年1月20日
发明者金邦荃, 汤祥明, 刘兴余 申请人:南京师范大学