专利名称：抗肿瘤寡肽的化学修饰方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于多肽制药技术领域。
背景技术：
治疗疾病的多肽、酶、蛋白质因子等药物越耒越引起人们普遍重视。这类药物一般来说专一性强，时效高，但也有许多不尽人意的地方。这类药物进入体内后，它们的半衰期很短，这主要是由于体内高的清除率和遭到为数众多的蛋白水解酶类的破坏。在这种情况下，一个新的研资究领域出现了，即在分子水平上对蛋白质、多肽进行改造，其中化学修饰蛋白质和多肽成了一个热点，于是许多蛋白质、多肽类药物的聚乙二醇(polyethylene glycol，简称PEG)化成为一个非常活跃的领域，特别是PEG化的γ-干扰素使它成为长效药物用于治疗丙种肝炎的上市，带动了一大批目前已经在临床上使用的蛋白质、多肽也纷纷采用该技术。
我们用聚乙二醇修饰抗肿瘤寡肽(antitumor oligopeptide，简称AOP)，(抗肿瘤寡肽及其制备方法和应用，中国发明专利，专利申请号2006100768577，2006年，陈钧辉、张冬梅、王新昌等)，取得了很好的结果，预示在肿瘤治疗方面有很好前景。
发明内容
本发明需要解决的问题是研究一种抗肿瘤寡肽的化学修饰方法。通过研究，我们得到了一个对抗肿瘤寡肽AOP-1、AOP-2、AOP-3和AOP-4进行化学修饰的方法。
本发明的技术要点为1、AOP的化学修饰方法(1)AOP的制备根据“抗肿瘤寡肽及其制备方法和应用”中国发明专利，专利申请号2006100768577，2006年，陈钧辉、张冬梅、王新昌等的方法进行。
(2)PEG对PEG的分子量没有严格的限定，一般选用分子量为4000～10000，我们选用的是PEG6000(BBI公司)。
(3)PEG的活化先把PEG与丁二酸酐反应生成聚乙二醇二酸(PEG-DA)，然后再与N-羟基丁二酰亚胺形成聚乙二醇二酸活化酯(PEG-DA-NHS)。
(4)PEG-DA-NHS与AOP反应生成PEG-AOP(5)PEG-AOP的鉴定分子量的测定通过HPLC凝胶层析(TSK-3000柱)，氨基酸组成分析通过氨基酸自动分析仪，PEG-AOP中AOP的含量通过紫外法A230的吸收进行。
2、PEG-AOP的抗肿瘤活性测定(1)PEG-AOP的体外活性测定采用细胞计数的方法，测定PEG-AOP对人白血病细胞U937生长和增殖的抑制作用。当细胞生长成单层后，用含1％小牛血清的RPMI1640培养液制成细胞悬液，按每孔1ml接种到24孔培养板上，37℃、5％CO2培养箱中培养4h后，加入不同剂量的PEG-AOP，对照组和实验组均设三个重复孔，继续培养72小时后，在倒置显微镜下用血球计数板计数。
(2)PEG-AOP体内活性测定将已接种Lewis肺癌细胞的荷瘤小鼠处死，无菌操作抽取其腹水，按1∶3比例稀释，配制成细胞悬液，于每只实验用小鼠的右前肢腋窝皮下注射0.2ml瘤细胞悬液，瘤细胞不少于105，植瘤24hr后，给药组分别以不同剂量进行静脉注射，以生理盐水作为阴性对照组，CTX为阳性对照组，连续注射10天后，于停药4天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。
按本发明方法生产的PEG-AOP可制备成抗肿瘤药物。
本发明与现有技术相比所具有的效果抗肿瘤寡肽AOP-1、AOP-2、AOP-3和AOP-4是有效、安全的抗肿瘤寡肽，(“抗肿瘤寡肽及其制备方法和应用”中国发明专利，专利申请号2006100768577，2006年，陈钧辉、张冬梅、王新昌等)，而PEG化后显示出更优越的特性。
1、体外抑制肿瘤细胞生长的结果表明，相同摩尔浓度的情况下，其体外活性PEG-AOP是AOP的2倍。
2、体内抑瘤试验更清楚地表明，使用PEG-AOP的剂量其摩尔浓度仅为AOP的1/4，而且是每隔3天注射一次的情况下，其抑瘤效果与AOP相当。
3、通过对AOP的PEG化，能够增长体内的半衰期，从而增加它的有效药物血浓度时间，在临床上可以减少相应剂量，不需每天注射，这不仅方便了患者，而且可以减轻经济负担。
具体实施例方式
实施例1聚乙二醇二酸(PEG-DA)和聚乙二醇二酸活化酯(PEG-DA-NHS)的制备30g PEG6000与2.5g丁二酸，溶于100ml氯仿，回流48小时后，抽去有机溶剂，加乙醚沉淀，真空干燥，得27.5gPEG-DA。
15.5g PEG-DA溶于50ml二氯甲烷，加入1.04g二环己基碳二亚胺(DCC)和0.602gN-羟基丁二酰亚胺的50ml四氢呋喃溶液，室温反应24小时后，过滤，滤液加乙醚沉淀，真空干燥，得14.9g PEG-DA-NHS。
实施例2PEG-AOP-1的制备称取720mg PEG-DA-NHS，溶于10ml二甲基甲酰胺(DMF)，加入305mgAOP-1溶于120ml pH8.5、0.5mol/L硼酸缓冲液，室温反应3小时，然后放入截留分子量为1000的透析袋中充分透析，透析液经冻干得产品847.9mg。
实施例3PEG-AOP-1的鉴定用TSK-3000凝胶柱在HPLC上进行分子量测定，用氨基酸自动分析仪对PEG-AOP-1的氨基酸进行测定，再用紫外法对PEG-AOP-1中AOP-1的含量进行测定，3个结果互相印证了PEG-AOP-1是1分子PEG6000结合了2分子的AOP-1。
实施例4PEG-AOP-1的体外活性测定采用细胞培养和细胞计数的方法，人白血病细胞U937以RPMI1640为培养基，视不同情况加入10％左右的小牛血清，用T-25培养瓶在37℃，5％CO2培养箱中单层培养。
当细胞生长成单层后，用含1％小牛血清的培养液制成细胞悬液，按每孔1ml接种到24孔培养板上，37℃、5％CO2培养箱中培养4h后，加入不同剂量的PEG-AOP-1，对照组和实验组均设三个重复孔，对照组加入20μl的PBS，试验组加入不同剂量的PEG-AOP-1，继续培养72小时后，在倒置显微镜下用血球计数板计数，结果如表1所示。
表1 PEG-AOP-1对U937细胞增殖的抑制作用
实施例5PEG-AOP-1的体内活性测定40只健康昆明种小白鼠，体重20±2克，平均分四组，每组10只，雌雄各半或全部为雄鼠。将已接种Lewis肺癌细胞的荷瘤小鼠处死，无菌操作抽取其腹水，按1∶3比例稀释，配制成细胞悬液，于每只实验用小鼠的右前肢腋窝皮下注射0.2ml瘤细胞悬液，瘤细胞不少于105，植瘤24hr后，给药组分别以不同剂量进行静脉注射，以生理盐水作为阴性对照组，CTX为阳性对照组，连续注射10天后，于停药4天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率，结果如表2所示。
表2 PEG-AOP-1对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
说明PEG-AOP-1的用量仅为AOP-1的1/4，而且每隔3天注射一次，共注射4次，而AOP-1则每天注射，共注射10次，其抑瘤效果相当。
实施例6PEG-AOP-2的制备同实施例2，不同之处仅在于用AOP-2替代AOP-1。
实施例7PEG-AOP-2的鉴定用TSK-3000凝胶柱在HPLC上进行分子量测定，用氨基酸自动分析仪对PEG-AOP-2的氨基酸进行测定，再用紫外法对PEG-AOP-2中AOP-2的含量进行测定，3个结果互相印证了PEG-AOP-2是1分子PEG6000结合了2分子的AOP-2。
实施例8PEG-AOP-2的体外活性测定测定方法同实施例4，其结果如表3所示表3 PEG-AOP-2对U937细胞增殖的抑制作用
实施例9PEG-AOP-2的体内活性测定测定方法同实施例5，其结果如表4所示表4 PEG-AOP-2对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
说明PEG-AOP-2的用量仅为AOP-2的1/4，而且每隔3天注射一次，共注射4次，而AOP-2则每天注射，共注射10次，其抑瘤效果相当。
实施例10PEG-AOP-3的制备同实施例2，不同之处仅在于用AOP-3替代AOP-1。
实施例11PEG-AOP-3的鉴定用TSK-3000凝胶柱在HPLC上进行分子量测定，用氨基酸自动分析仪对PEG-AOP-3的氨基酸进行测定，再用紫外法对PEG-AOP-3中AOP-3的含量进行测定，3个结果互相印证了PEG-AOP-3是1分子PEG6000结合了2分子的AOP-3。
实施例12PEG-AOP-3的体外活性测定测定方法同实施例4，其结果如表5所示表5 PEG-AOP-3对U937细胞增殖的抑制作用
实施例13PEG-AOP-3的体内活性测定测定方法同实施例5，其结果如表6所示表6 PEG-AOP-3对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
说明PEG-AOP-3的用量仅为AOP-3的1/4，而且每隔3天注射一次，共注射4次，而AOP-3则每天注射，共注射10次，其抑瘤效果相当。
实施例14PEG-AOP-4的制备同实施例2，不同之处仅在于用AOP-4替代AOP-1。
实施例15PEG-AOP-4的鉴定用TSK-3000凝胶柱在HPLC上进行分子量测定，用氨基酸自动分析仪对PEG-AOP-4的氨基酸进行测定，再用紫外法对PEG-AOP-4中AOP-4的含量进行测定，3个结果互相印证了PEG-AOP-4是1分子PEG6000结合了2分子的AOP-4。
实施例16PEG-AOP-4体外活性的测定测定方法同实施例4，其结果如表7所示表7 PEG-AOP-4对U937细胞增殖的抑制作用
实施例17PEG-AOP-4体内活性的测定测定方法同实施例5，其结果如表8所示表8 PEG-AOP-4对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用
说明PEG-AOP-4的用量仅为AOP-4的1/4，而且每隔3天注射一次，共注射4次，而AOP-4则每天注射，共注射10次，其抑瘤效果相当。
权利要求
1.一种抗肿瘤寡肽的化学修饰方法，其特征是由以下几个步骤构成(1)制备抗肿瘤寡肽，序列为Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala，其中X为Leu或Ile，Y为Thr或Ser；(2)聚乙二醇即PEG活化成聚乙二醇二酸活化酯PEG-DA-NHS，PEG分子量选用4000～10000；(3)PEG-DA-NHS与抗肿瘤寡肽反应是PEG-DA-NHS连接到抗肿瘤寡肽N-末端的游离氨基上，1分子PEG通过共价结合2分子抗肿瘤寡肽，形成一个共价修饰物PEG-抗肿瘤寡肽。
2.根据权利1所述的PEG-抗肿瘤寡肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明属于多肽制药技术领域。本发明提供一种用聚乙二醇(polyethyleneglycol，简称PEG)对抗肿瘤寡肽进行化学修饰的方法。抗肿瘤寡肽序列为Tyr－X－Glu－Pro－Gly－Pro－Y－Ala，其中X为Leu或Ile，Y为Thr或Ser，根据本发明对抗肿瘤寡肽进行化学修饰后所得的产物为PEG－抗肿瘤寡肽。它具有长效的功能从而能够减少所用剂量和注射次数，在制备治疗肿瘤药物中应用。
文档编号C07K7/06GK1883710SQ200610082399
公开日2006年12月27日 申请日期2006年5月26日 优先权日2005年6月21日
发明者陈钧辉, 张昕, 王文刚, 王新昌, 张冬梅, 李俊 申请人:南京大学