专利名称：：一种丹参酮ⅱa化学对照品的分离制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种从丹参提取物中分离获得纯度大于98X的丹参酮IIA化学对照品的制备方法。技术背景丹参是我国传统药学中常用药物之一，其制剂在临床上应用非常广泛，丹参具有活血调经，祛瘀止痛，养心安神的功效，丹参酮IIA是丹参中主要药效成分之一，是中国药典中规定的含量测定成分。研究表明丹参酮IIA对多种心脑血管疾病及皮肤病征有良好治疗效果，广泛应用于医药和化妆品领域。目前丹参酮IIA的分离方法主要为正相色谱法、大孔吸附树脂法、超临界二氧化碳萃取法和高速逆流色谱法。正相色谱法使用硅胶作为填料，以甲醇一氯仿作为洗脱液，可以获得98纯度的丹参酮IIA，在分离过程中容易产生不可逆吸附，具有样品易损失，易污染，洗脱液毒性大的缺点。大孔吸附树脂法使用不同比例乙醇洗脱，具有上样量大，毒性小的特点，但只能获得的是丹参酮IIA含量低的混合物。超临界二氧化碳萃取具有绿色环保的特点，同时可以避免高温分解和氧化，有利于保持丹参酮IIA的化学稳定性。但由于缺少在线监测手段，丹参酮IIA的纯度难以稳定达到98%以上。高速逆流色谱法不需使用固定填料，所以没有不可逆吸附，具有样品无损失，无污染的特点，目前高速逆流色谱多局限于实验室规模，难以大量获得98%纯度以上丹参酮11A化学对照品。
发明内容为克服现有技术的缺陷，优化分离条件，本发明的目的在于提供一种分离时间短、分离效果好、产品纯度高(纯度在98%以上)的丹参酮IIA化学对照品的分离制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案分离制备方法，以重量含量5097X的丹参酮IIA提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以甲醇-水溶液为洗脱体系，具体步骤为(1)样品预处理将重量含量5097^的丹参酮IIA提取物用甲醇、乙醇或氯仿溶液溶解，配置成重量浓度为860mg/ml的丹参酮IIA提取物溶液，经0.220.45pm微孔滤膜过滤；(2)色谱柱处理高效液相色谱柱选择制备型高效液相色谱柱，以5一20倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系溶液为甲醇水溶液，其体积浓度为6085%;(3)进样将过滤后的样品溶液通过六通阀或泵进样，进样体积为l100ml;(4)洗脱采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在10600ml/min，在线紫外监测，收集含有丹参酮IIA的洗脱液；(5)丹参酮IIA化学对照品的获取减压浓缩所收集到的丹参酮IIA洗脱液，至干，即获得纯度大于98^的丹参酮IIA。丹参酮IIA的结构式如下所述制备型高效液相柱可以选用商品化或自己装填的制备型高效液相柱；其填料可为C8或C18键合相填料；自己装填的制备型高效液相柱装填方式为湿法装柱，制备型高效液相柱的填料粒径可为5-20pm，柱效在2000以上；在线紫外监测，其监测波长为220nm290nm;丹参酮IIA洗脱液收集后，减压浓縮，浓縮温度控制在557(TC。以本方法从丹参提取物中分离丹参酮IIA化学对照品具有如下优点和进步1.本发明以制备型高效液相为分离手段，采用520pmC18作为固定相，同时优化色谱条件，使丹参酮IIA得到高效分离，可以稳定获得纯度在98^以上的丹参酮IIA化学对照品，同时縮短分离时间，单次进样制备时间少于40分钟。2.本发明所述的甲醇-水洗脱体系能有效的保证丹参酮IIA与其他成分得到有效分离，从而保证分离的效果。3.本发明采用紫外监测器在线监测，使丹参酮IIA的分离情况可以直接监测，并可以选择性收集，显著提高收集效果。4.本发明所述方法操作简便，条件温和，能有效的保证丹参酮IIA的稳定性。5.可产业推广。色谱柱规格为50X250mm时，其规模可达到10克/月以上。图1为本发明实施例1制备的丹参酮IIA化学对照品的纯度分析色谱图。具体实施方式下面通过实施例和附图对本发明做进一步详细说明。实施例1:本实施例中，以50X的丹参酮IIA提取物为原料，以5pmC18键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-水(75:25,体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下1.样品预处理丹参酮IIA提取物用氯仿溶解，配置成浓度为60mg/ml的丹参酮IIA溶液，经0.22^m微孔滤膜过滤。2.色谱柱处理制备型高效液相柱选择为日本Sheshido公司生产的固定相为C18的制备柱(5pm，20X250mm)，以约5倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。3.上样将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为lml。4.洗脱流速控制在10ml/min，在线220nm紫外监测，收集含有丹参酮IIA的洗脱液，5.丹参酮IIA化学对照品的获取减压浓縮丹参酮IIA洗脱液至干。浓縮温度控制在6(TC，得到纯度为99.63n/。的丹参酮IlA;如图1所示，其分析结果如表l所示表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>实施例2本实施例中，以70M的丹参酸B提取物为原料，以5(mi的C18键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-水(60:40，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下1.样品预处理丹参酮IIA提取物用甲醇溶解，配置成浓度为8mg/ml的丹参酮IIA溶液，经0.45pm微孔滤膜过滤。2.色谱柱处理制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为5pm的C18键合相填料，湿法装柱，化学对照品色谱柱规格为50X200mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。3.上样将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为8ml。4.洗脱流速控制在90ml/min，在线270nm监测，收集含有丹参酮IIA的洗脱液，5.丹参酮IIA化学对照品的获取减压浓缩丹参酮IIA洗脱液至干。浓缩温度控制在7(TC，得到纯度为99.11。/。的丹参酮IIA。实施例3本实施例中，以60X的丹参酮IIA提取物为原料，以l(Him的C18键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-水(75:25，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下1.样品预处理丹参酮IIA提取物用乙醇溶解，配置成浓度为10mg/ml的丹参酮IIA溶液，经0.45pm微孔滤膜过滤。2.色谱柱处理制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10|im的C18键合相填料，色谱柱规格为75X250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。3.上样将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为15ml。4.洗脱流速控制在150ml/min，在线290nm紫外监测，收集含有丹参酮IIA的洗脱液，5.丹参酮IIA化学对照品的获取减压浓縮丹参酮IIA洗脱液至干。浓縮温度控制在6(TC，得到纯度为98.94M的丹参酮nA。实施例4本实施例中，以70^的丹参酮IIA提取物为原料，以10pmC18键合相填料为吸附剂，含有甲醇-水(75:25，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下1.样品预处理丹参酮IIA提取物用氯仿溶解，配置成浓度为40mg/ml的丹参酮IIA溶液，经0.45pm微孔滤膜过滤。2.色谱柱处理制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为20pm的C18键合相填料，色谱柱规格为100X270mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。3.上样将过滤后的样品溶液通过六通阀进样，进样体积为20ml。4.洗脱流速控制在300ml/min，在线254nm紫外监测，收集含有丹参酮IIA的洗脱液，5.丹参酮IIA化学对照品的获取减压浓縮丹参酮IIA洗脱液至干。浓縮温度控制在6(TC，得到纯度为99.15。/。的丹参酮IIA。实施例5本实施例中，以70。/。的丹参酮IlA提取物为原料，以20pm的C8键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-水(80:20，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下1.样品预处理丹参酮IIA提取物用甲醇溶解，配置成浓度为8mg/ml的丹参酮IIA溶液，经0.45]im微孔滤膜过滤。2.色谱柱处理制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为10,的C8键合相填料，湿法装柱，化学对照品色谱柱规格为150X250mm，以约10倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。3.上样将过滤后的样品溶液通过泵进样，进样体积为100ml。4.洗脱流速控制在600ml/min，在线230nm紫外监测，收集含有丹参酮IIA的洗脱液，5.丹参酮IIA化学对照品的获取减压浓縮丹参酮IIA洗脱液至干。浓縮温度控制在6(TC，得到纯度为98.55%的丹参酮11八。实施例6本实施例中，以97M的丹参酮IIA提取物为原料，以20pm的C18键合相填料为吸附剂，以含有甲醇-水(85:15，体积比)溶液为洗脱溶剂，具体工艺步骤如下1.样品预处理丹参酮IIA提取物用甲醇溶解，配置成浓度为8mg/ml的丹参酮IIA溶液，经0.45pm微孔滤膜过滤。2.色谱柱处理制备型高效液相柱是自己装填的制备柱，填料为粒径为20pm的C18键合相填料，湿法装柱，化学对照品色谱柱规格为150X250mm，以约8倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱。3.上样将过滤后的样品溶液通过泵进样，进样体积为100ml。4.洗脱流速控制在600ml/min，在线230nm紫外监测，收集含有丹参酮IIA的洗脱液，5.丹参酮IIA化学对照品的获取减压浓縮丹参酮IIA洗脱液至干。浓縮温度控制在55"C，得到纯度为98.85%的丹参酮IIA。权利要求1.一种丹参酮IIA化学对照品的分离制备方法，其特征在于以重量含量50～97％的丹参酮IIA提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以甲醇-水溶液为洗脱体系，具体步骤为，(1)样品预处理将重量含量50～97％的丹参酮IIA提取物用甲醇、乙醇或氯仿溶液溶解，配置成重量浓度为8～60mg/ml的丹参酮IIA提取物溶液，经0.22～0.45μm微孔滤膜过滤；(2)色谱柱处理高效液相色谱柱选择制备型高效液相色谱柱，以5-20倍柱体积的洗脱体系溶液平衡色谱柱；洗脱体系溶液为甲醇水溶液，其体积浓度为60～85％；(3)进样将过滤后的样品溶液进样，进样体积为1～100ml；(4)洗脱采用洗脱体系溶液洗脱色谱柱，流速控制在10～600ml/min，在线紫外监测，收集含有丹参酮IIA的洗脱液；(5)丹参酮IIA化学对照品的获取减压浓缩所收集到的丹参酮IIA洗脱液，至干，即获得纯度大于98％的丹参酮IIA。2.根据权利要求1所述丹参酮IIA化学对照品的分离制备方法，其特征在于所述制备型高效液相柱可以选用商品化或自己装填的制备型高效液相柱；其填料可为C8或C18键合相填料。3.根据权利要求2所述丹参酮IIA化学对照品的分离制备方法，其特征在于自己装填的制备型高效液相柱装填方式为湿法装柱。4.根据权利要求3所述丹参酮IIA化学对照品的分离制备方法，其特征在于所述制备型高效液相柱的柱效在2000以上。5.根据权利要求2所述丹参酮IIA化学对照品的分离制备方法，其特征在于所述制备型高效液相柱的填料粒径为5-20nm。6.根据权利要求1所述丹参酮IIA化学对照品的分离制备方法，其特征在于所述在线紫外监测，其监测波长为220nm290nm。7.根据权利要求1所述丹参酮IIA化学对照品的分离制备方法，其特征在于所述丹参酮IIA洗脱液收集后，减压浓縮，浓縮温度控制在5570°C。全文摘要本发明涉及一种丹参酮IIA化学对照品的制备方法。以含量50～97％的丹参酮IIA提取物为原料，以制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的甲醇-水溶液为洗脱体系，获得纯度大于98％的丹参酮IIA化学对照品。工艺步骤有样品预处理，色谱柱处理，进样，洗脱，在线监测，收集含有丹参酮IIA的洗脱液，减压浓缩丹参酮IIA洗脱液至干，即得丹参酮IIA化学对照品。经高效液相色谱法监测，丹参酮IIA的含量可达到98％以上。文档编号C07J73/00GK101210041SQ20061013512公开日2008年7月2日申请日期2006年12月27日优先权日2006年12月27日发明者肖红斌,高明哲申请人:中国科学院大连化学物理研究所