氟代吡啶n-氧化物凝血酶调节剂和含氮杂芳基化合物的n-氧化方法

专利名称：氟代吡啶n-氧化物凝血酶调节剂和含氮杂芳基化合物的n-氧化方法
专利说明氟代吡啶N-氧化物凝血酶调节剂和含氮杂芳基化合物的N-氧化方法 发明领域 本发明涉及用做凝血酶抑制剂的新型化合物；本发明还涉及新型含氮杂芳基化合物的N-氧化方法。

背景技术：
丝氨酸蛋白酶凝血酶在止血和血栓形成中起着重要的作用，作为多因子蛋白，其可在血小板、内皮细胞、平滑肌细胞、白细胞、心脏和神经中诱导许多作用。通过内在途径(接触激活)或外在途径(通过将血浆暴露于非内皮表面、破坏血管壁或组织因子释放来激活)激活凝血级联导致一系列集中于凝血酶的生化反应。凝血酶裂解纤维蛋白原最终产生止血栓塞(血块形成)，通过独特的细胞表面凝血酶受体的溶蛋白性裂解强效激活血小板，并通过反馈机制自动扩大其自身的产生。因此，凝血酶功能抑制剂可有效治疗宿主的心血管和非心血管疾病。
以前已报道过血管内血栓的体内诊断成像方法。这些成像方法采用由可检测到的放射性或顺磁性原子标记的化合物。例如，由γ-发射体In-111标记的血小板可用作检测血栓的成像剂。此外，已报道过顺磁性造影剂二乙烯三胺五乙酸钆在用溶栓方法治疗的急性心肌梗塞患者的磁共振成像中的用途。
一直需要比现有蛋白酶抑制剂的生物利用度高、副作用低的用作强效的选择性蛋白酶抑制剂的非肽类化合物。因此，以其强抑制能力和低哺乳动物毒性为特征的新型蛋白酶抑制剂为各种病症的强效的有价值的治疗药物，包括治疗许多哺乳动物蛋白水解性疾病状态。
在药物发现过程中，有时会应用将吡啶类化合物和其它含N杂芳基如嘧啶、喹啉、吡嗪、苯并_二唑和哒嗪并喹啉转化为其N-氧化物的氧化反应。已经发展了许多影响该转化的方法。在许多情况下，这种转化可通过采用过酸来完成，如间氯过氧苯甲酸、单过氧邻苯二甲酸镁或从如30％过氧化氢水溶液和三氟乙酸酐或乙酸酐原位形成的过酸。采用催化性MTO(MeReO3)和30％H2O2作为共氧化剂或三氟乙酸酐和过氧化氢-脲复合物(Tet.Lett.412299，2000)或从Oxone_和硫酸原位形成的过硫酸(J.Org.Chem.421869，1977)来氧化一些缺电子吡啶。采用上述方法在将高度缺电子吡啶转化为N-氧化物时常遇到困难；参见，如Tet.Lett.412299，2000。因此，仍需要将高度缺电子含氮杂芳基氧化为其N-氧化物的实用方法。
发明简述 本发明涉及新型式I化合物(如下)。还提供了制备式I化合物的方法。本发明的新型化合物为强效凝血酶抑制剂。还提供了通过给予有效量的式I化合物治疗哺乳动物血栓形成的方法

式I 其中X为

或

和 Y为

或
本发明还包括将含氮杂芳基氧化为其相应的N-氧化物的方法。试剂系统可由相对安全和可购买得到的试剂来制备。此外，反应在如某些酸敏感性甲酯和腈基可耐受的中性-酸性条件下进行。
本发明还包括用于在哺乳动物中抑制血小板凝集物形成、抑制纤维蛋白形成、抑制血栓形成和抑制栓塞形成的组合物，所述组合物包含在药学可接受载体中的本发明化合物。这些组合物可任选包含抗凝剂、抗血小板剂和血栓溶解剂。所述组合物可加入倒血液、血液制品或哺乳动物器官中以达到所需的抑制作用。
本发明还提供了治疗心肌梗塞；不稳定心绞痛；中风；再狭窄；深部静脉血栓形成；由外伤或脓毒性血液透析(septic hemodialysis)引起的深部静脉血栓形成；心肺旁路手术；成人呼吸窘迫综合征；内毒素性休克；化疗过程中的过高血液凝固性；Alzheimer′s病；和眼部纤维蛋白形成的方法。本发明化合物的其它用途为包埋在或与用于血液收集、血液循环和血液储存的设备如导管、血液透析装置、血液收集注射器和管、输血导管和支架的制备材料物理结合作为抗凝剂。
本发明还包括降低哺乳动物表面凝血活性的方法，所述方法为将本发明化合物共价或非共价与所述表面结合。
在另一方面，本发明包括用于哺乳动物体内血栓成像的组合物，所述组合物包含可从体外被检测到的本发明化合物。优选的组合物包含本发明化合物和可检测标记如放射性或顺磁性原子。
在另一方面，本发明提供了用于哺乳动物体内血栓成像的诊断组合物，所述组合物包含药学可接受载体和诊断有效量的本发明化合物或组合物。
在另一方面，本发明包括用于哺乳动物体内血栓成像的方法。
发明详述 本发明涉及式I化合物。


式I 其中X为

或

和 Y为

或
本发明优选的实施方案为其中X为

本发明另一优选的实施方案为其中Y为
本发明优选的实例为2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺及其药学可接受盐。
本发明优选的实例为2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺二盐酸盐。
本发明优选的实例为2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺一氢溴酸盐。
本发明优选的实例为2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺磺酸盐。
本发明优选的实例为2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺萘-1，5-二磺酸盐。
本发明化合物还可为多晶形式，所有多晶形式都包含在本发明内。
式I化合物还可被溶剂化，特别是被水合。水合作用可在化合物或包含化合物的组合物制备过程中发生，或者，水合作用可由于化合物的吸湿性质随时发生。
在另一方面，本发明包括用于哺乳动物体内血栓成像的方组合物，所述组合物包含可在体外被检测到的本发明化合物。优选的组合物为包含本发明化合物和可检测标记如放射性或顺磁性原子的组合物。
在另一方面，本发明提供了用于哺乳动物体内血栓成像的诊断组合物，所述组合物包含药学可接受载体和诊断有效量的本发明化合物或组合物。
在另一方面，本发明包括用于哺乳动物体内血栓成像的方法。
根据优选方面，有效化合物为其中与二氟亚甲基相邻的吡啶取代基被可检测标记如放射性碘原子如I-125、I-131或I-123取代的化合物。可检测标记还可为其中合适的配体(L)直接或通过二价连接基团A″与所述吡啶取代基连接的放射性或顺磁性螯合物。合适的配体是指可与放射性或顺磁性金属离子螯合的有机部分。
在这些化合物中，二价连接基团A″包括可与吡啶基和螯合工具(chelating means)共价连接的基团。如A″可为-C(＝S)-、-C(＝O)-、-C(＝NH)-(CH2)6-C(＝NH)-、-C(＝O)-(CH2)6-C(＝O)-等。
同样，在由式I表示的化合物中，螯合配体L包括可与放射性或顺磁性原子共价结合或非共价结合的基团。螯合工具包括通常用于络合放射性或顺磁性原子的基团。其包括含3-12个，优选3-8个亚甲基膦酸基团、亚甲基羧肟胺(carbohydroxamic acid)基团、羧基亚乙基基团或特别是羧基亚甲基基团的与氮原子连接的螯合工具。如果只有一个或两个酸基团与氮原子连接，则那个氮通过任选取代的亚乙基或通过最多4个被氮或氧或硫原子隔开的分离的亚乙基单元与另一个具有所述基团的氮原子连接。优选的螯合工具为二乙烯三胺-N，N，N′，N″，N″-五乙酸(DTPA)。DTPA为本领域中众所周知的放射性原子铟-111(In-111)、锝-99m(Tc-99m)和顺磁性原子钆(Gd)的螯合工具。Khaw，et al，Science 209295(1980)；Paik C.H.等，美国专利No.4,652,440(1987)；Gries，H.等，美国专利No.4,957,939(1990)。优选的螯合配体L为1-(对氨基苄基)-二乙烯三胺五乙酸。螯合工具还包括包含巯基或胺部分的化合物，所述巯基或胺部分在任何组合中的总数至少为4个。这些巯基或胺部分通过至少两个原子各自分离，所述原子可为碳、氮、氧或硫。特别优选的螯合工具L为金属硫蛋白，其为本领域众所周知的Tc-99m螯合工具。
可用放射性碘通过交换反应来标记式I化合物。将强放射性碘(hot iodine)交换为弱放射性碘(cold iodine)的反应为本领域众所周知的。或者，可从相应的溴代化合物通过三丁基锡烷基中间体来制备放射性碘标记的化合物。参见美国专利No.5,122,361，通过引用并入本文。
本发明还包括用于哺乳动物体内血栓成像的组合物，其中所述组合物包含式I化合物与放射性原子的混合物；合适的放射性原子包括Co-57、Cu-67、Ga-67、Ga-68、Ru-97、Tc-99m、In-Ill、In-113m、Hg-197、Au-198和Pb-203。一些放射性原子具有可用于放射化学成像技术的优良特性。特别地，由于其原子核的性质，锝-99m(Tc-99m)为用于成像的理想的放射性原子。铼-186和-188也具有可使其成像的γ发射。优选的组合物包含放射性原子Tc-99m。
式I化合物可被任何本领域已知的多种技术标记，得到本发明组合物。例如，本发明化合物可通过螯合剂标记，所述螯合剂如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或金属硫蛋白，两者都可与式I化合物共价连接。
通常，可通过生成锝-99m和还原剂以及水溶性配体的水性混合物，然后将该混合物与由式I代表的本发明化合物接触来制备包含锝-99m的本发明组合物。例如，可通过将锝-99m(氧化态)与具有螯合工具的本发明化合物在还原剂存在下反应在还原态的锝-99m(IV或V价态)之间生成稳定络合物来制备本发明的成像化合物。
本发明组合物的一个实施方案为通过用锝-99m标记具有DTPA螯合工具的式I化合物来制备。这可通过下面的步骤来完成将预定量(如5μg-0.5mg)的本发明化合物与包含柠檬酸盐缓冲液和亚锡还原剂混合，然后加入刚被洗脱的包含预定水平放射(如15mCi)高锝酸钠。在室温下将该混合物孵育后，通过无菌滤器(0.2-0.22微米)将反应混合物装在隔离注射器(shielded syringe)上，然后如果需要，将其配制到0.9％注射用盐水中。
本发明组合物的另一实施方案为通过用锝-99m标记具有金属硫蛋白螯合工具式I化合物来制备。这可通过下面的步骤来完成将高锝酸钠-99m水溶液与葡庚糖酸亚锡水溶液混合形成具有两个葡庚糖酸盐分子的锝-99m(还原态)可溶性复合物，然后将该溶液与连有金属硫蛋白的式I化合物混合。将该混合物在可使来自葡庚糖酸复合物的锝-99m交换式I化合物的金属硫蛋白的条件下孵育一段时间，然后可形成本发明的锝标记的组合物。
用于该方法的还原剂为生理学可接受，可将锝-99m从其氧化态还原为IV或V价态，或将铼从其氧化态还原。可用的还原剂为氯化亚锡、氟化亚锡、葡庚糖酸亚锡、酒石酸亚锡和低亚硫酸钠。优选的试剂为亚锡还原剂，特别是氯化亚锡或葡庚糖酸亚锡。还原剂的量为可将锝-99m还原以便在该放射性同位素的还原态与式I化合物的螯合工具结合所必需的量。例如，氯化亚锡(SnCl2)为还原剂，其可在1-1,000μg/mL范围内使用。
柠檬酸与锝-99m迅速复合形成锝-99m-柠檬酸盐复合物。当与式I化合物接触时，在温和条件下，锝-99m基本上定量地迅速从其柠檬酸盐复合物转移到式I化合物的螯合工具上。柠檬酸(为柠檬酸钠)的量可为约0.5mg/ml直到在介质中的最大溶解量。优选的柠檬酸的量为15-30μg/ml。
具有螯合工具的式I化合物的量可为约0.001-约3mg/m，优选约0.017-约0.15mg/mL。最后，高锝酸盐形式的锝-99m的量优选为约1-50mCi。每mg本发明化合物的mCi量优选为约30-150。
式I化合物和金属离子转移配体复合物之间的反应优选在具有使式I化合物稳定的pH值的水溶液中进行。稳定是指化合物仍旧可溶并保留其对α-凝血酶的抑制活性。通常，反应的pH可为约5-9，优选的pH为大于6-8。将锝-99m-柠檬酸盐复合物和式I化合物，优选在约20℃-约60℃，最优选在约20℃-约37℃，孵育足够长的时间以使金属离子从柠檬酸盐复合物转移到式I化合物的螯合工具上。通常，在这些条件下不到一小时的时间足以完成转移反应。
本发明的备选组合物包括In-111标记的本发明化合物。
本发明还包括可用于哺乳动物体内血栓成像的本发明化合物的组合物，所述化合物包含与顺磁性原子复合的由式I表示的化合物。
优选的顺磁性原子为原子序数为21-29、42、44和58-70的二价或三价元素。合适的离子包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镤(III)、钕(III)、钐(III)和镱(III)。由于它们非常强的磁矩，钆(III)、铽(III)、镝(dysprosium)(III)、钬(III)和铒(III)为优选的。特别优选的顺磁性原子为钆(III)。
本发明的组合物可通过将式I化合物与顺磁性原子混合来制备。例如，将合适的顺磁性原子的金属氧化物或金属盐(硝酸盐、氯化物或硫酸盐)溶于或悬浮于包含水和醇如甲醇、乙醇或异丙醇的介质中。将该混合物加入到等摩尔量的式I化合物在同样水性介质中并搅拌。可将反应混合物适当加热直到反应完成。可通过过滤分离所形成的不溶性组合物，通过蒸发溶剂分离可溶性组合物。如果螯合工具上的酸性基团仍存在于本发明化合物的组合物上，则可加入无机或有机碱甚至氨基酸将酸性复合物转化为中性复合物以便于均匀组合物的分离和纯化。与无机碱如钠、钾或锂的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐一样，有机碱或碱性氨基酸可用做中和剂。
本发明还包括可用于哺乳动物体内血栓成像的诊断组合物，所述组合物包含药学可接受载体和诊断有效量的得自式I化合物的组合物。
所述组合物一次剂量所需的“诊断有效量”取决于给药途径、所治疗哺乳动物的类型和所治疗的特定哺乳动物的体格特征。医学诊断领域中的熟练从业者非常清楚这些因素及它们与确定该剂量的关系。同样，可定制诊断有效量和给药方法以达到最佳效果，但这药取决于一下因素如体重、饮食、同时使用的药物和医学领域熟练技术人员知道的其它因素。成像剂量应足以检测到所讨论的血栓位点的成像剂的存在。通常，放射学成像需要本发明药用组合物所提供的剂量为约5-20μCi，优选约10μCi。磁共振成像需要所提供的剂量为约0.001-5mmole/kg，优选约0.005-0.5mmole/kg式I化合物与顺磁性原子的复合物。在任一情况下，本领域人员都知道实际剂量取决于血栓的位置。
用于体内的“药学可接受载体”为药学领域众所周知，在Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中有描述。本发明的药用组合物可由药学可接受载体制备，得到用于注射给药的无菌溶液或混悬液。特别地，注射剂可被制成常规形式，可为液体溶液剂或混悬剂、适于在注射前制成液体溶液或混悬液的固体形式或乳剂。合适的赋形剂如水、盐水、葡萄糖、甘露醇、乳糖卵磷脂、白蛋白、谷氨酸钠、盐酸半胱氨酸等。另外，如果需要，可注射药用组合物可包含少量的无毒辅助物质，如湿润剂、pH缓冲剂等。如果需要，还可使用吸收增强剂(如脂质体)。
本发明还包括用于储存或给药的诊断组合物。这些还包含防腐剂、稳定剂和染料。如可加入苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯作为防腐剂。出处同上在1449页。另外，还可用抗氧化剂和助悬剂。
本发明的体内成像方法还具有优于以前的用于检测或监控血栓存在、大小、消退或增加的成像技术的几个优势。特别地，本发明提供了可紧密结合与血栓有关的凝血酶的化合物、组合物和诊断组合物，从而降低由循环放射性或来自未结合成像剂的顺磁性而引起的“背景”。此外，通过冠状动脉内注射本发明化合物、组合物或诊断组合物的体内成像预计几乎是同时发生的，因为这些成像剂会立即使与血栓结合的凝血酶饱和。
因此，本发明还包括哺乳动物体内血栓成像的方法，所述方法包括以下步骤(1)给予哺乳动物诊断可接受量的本发明化合物、组合物或诊断组合物，和(2)检测血管中的血栓。
本文所用术语“体内成像”涉及检测哺乳动物体内血栓，监控哺乳动物血栓大小、位置和数量以及血栓溶解或生长的方法。
在通过该方法在体内使用本发明化合物组合物或诊断组合物时，“给药”通过全身或局部定向的胃肠外方式进行。全身给药通过将本发明化合物、组合物或诊断组合物注射入方便的和可进入的静脉或动脉来完成。这包括但不限于肘前静脉给药。局部定向给药通过将本发明化合物、组合物或诊断组合物注射入怀疑含有血栓的静脉或动脉内完成，其中静脉血栓应位于注射位点的近端，动脉血栓应位于注射位点的远端(Local targeted administration is accomplishedby injecting the compounds，compositions or diagnostic compositions ofthe present invention proximal in flow to a veinor artery suspected tocontain thrombi distal to the injection site)。这包括但不限于直接注射到冠状动脉对冠状动脉血栓成像，注射到颈动脉对大脑脉管系统的血栓成像或注射到足静脉对小腿深静脉血栓成像。
同样，本发明组合物向血栓位点的递送方式被认为是在术语“给药”的范围内。例如，将连有螯合工具的由式I表示的化合物可被注射入哺乳动物，稍后再注射入放射性原子从而在体内血栓位点形成包含式I化合物与放射性原子复合物的组合物。或者，可将包含式I化合物与放射性原子复合物的组合物注射给哺乳动物。
如前所述，本发明方法中所用的化合物、组合物或诊断组合物的“诊断有效量”取决于给药途径、所治疗的哺乳动物的类型和所治疗哺乳动物的体格特征。医学诊断领域中的熟练从业者非常清楚这些因素及它们与确定该剂量的关系。体内成像剂量应足以检测到所讨论的血栓位点的成像剂的存在。通常，放射学成像需要本发明诊断组合物所提供的剂量为约5-20μCi，优选约10μCi。磁共振成像需要诊断组合物所提供的剂量为约0.001-5mmole/kg，优选约0.005-0.5mmole/kg式I化合物与顺磁性原子的复合物。在任一情况下，本领域人员都知道实际剂量取决于血栓的位置。
定位于这种血栓的放射性或顺磁性原子的存在使得通过成像检测血栓成为可能。
与本发明组合物和诊断组合物有关的放射性原子优选采用可检测γ辐射如γ照相机等的放射检测方法成像。通常放射成像照相机使用转换介质(其可吸收高能量的γ射线，在其回到基态后置换发射光子的电子)，装在立体检测室的光电检测器(确定所发射光子的位置)和分析在检测室内检测到的光子的电路并产生影像。
与本发明的组合物和诊断组合物有关的顺磁性原子在磁共振成像(MRI)系统中检测。在该系统中，用强磁场来排列患者体内原子的自选矢量。所述场被定位于血栓的顺磁性原子的存在干扰，当原子核恢复至其平衡排列时读取患者的影像。
定义 当修饰所用试剂的量时，本文所用术语“约”是指+/-15％；如“约1mmol”是指0.85mmol-1.15mmol。当谈到温度时，本文所用术语“约”是指+/-5℃；例如“约40℃”是指35℃-45℃。
本文所用术语“烷基”，无论是单独使用还是作为另外基团的一部分，都是指最多12个碳的直链和支链基团，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异叔丁基、戊基、己基、异己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基。优选地，烷基为1-6个碳原子。
除非限定链的长度，否则本文所用术语“烯基”是指2-20个碳原子的直链或支链基团，包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基等。优选地，烯基链长为2-8个碳原子，最有选为2-4个碳原子。
除非限定链的长度，否则本文所用术语“炔基”是指2-20个碳原子的直链或支链基团，其中在链中至少存在一个两个碳原子之间的叁键，包括但不限于乙炔、1-丙炔(propylene)、2-丙炔(propylene)等。优选地，炔基链长为2-10个碳原子，最有选2-4个碳原子。
在本文任何烯基或炔基部分作为取代基的情况下，不饱和键如二价乙烯基或乙炔键优选不直接与氮、氧或硫部分连接。
术语“吸电子基团”是指使电子密度朝向自己而远离其它区域的取代基。吸电子基团的实例为苯基、杂芳基、卤素、-NO2、-CN、砜、亚砜、酯、磺酰胺、氨甲酰、烷氧基、烷氧基醚、烯基、炔基、-OH、-C(O)烷基、-CO2H5-O苯基、-O杂芳基和-CF3。
本文所用术语“杂芳基”是指具有5-14个环原子；6、10或14π电子参与环排列；并包含碳原子和1、2或3个氧、氮或硫杂原子的基团(杂芳基的实例包括噻吩基、苯并[b]噻吩基、萘并[2，3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、苯并_唑基、色原烯基、呫吨基、吩氧硫杂环已二烯基(phenoxathiinyl)、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4αH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌间二氮(杂)苯基(perimidinyl)、菲咯啉基、吩嗪基、异噻唑基、吩噻嗪基、异_唑基、呋咱基和吩_嗪基)。
本文所用术语“杂原子”是指氧原子(″O″)、硫原子(″S″)或氮原子(″N″)。应了解当杂原子为氮时，其可形成NRaRb部分，其中Ra和Rb相互独立，可为氢或C1-C8烷基，或与连接它们的氮原子一起形成饱和/或不饱和5-、6-或7-元环。
术语“三氟甲磺酸盐”是指三氟甲磺酸盐阴离子CF3SO3-，简称Otf-。“三氟甲磺酸盐”的形容词形式为“三氟甲磺酸的”。例如，三氟甲磺酸的脱水物是指三氟甲磺酸酐(CF3SO2)2O，简称Tf2O。
药学可接受盐 式I化合物的药学可接受盐(水或油溶性或可分散产物形式)包括常规无毒盐或从无机或有机酸或碱形成的季铵盐。这种酸加成盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、重硫酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、campliorate、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(glucoheptanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐和十一酸盐。碱盐包括铵盐，碱金属盐如钠和钾盐，碱土金属盐如钙和镁盐，与有机碱形成的盐如二环己基胺盐、N-甲基-D-葡萄糖胺盐，以及与氨基酸形成的盐如精氨酸、赖氨酸等，包括与胍基部分形成的盐。同样，包含碱性氮原子的基团可被象低级烷基卤化物一样的试剂季铵化，如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基(stearyl)氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物如苄基和苯乙基溴化物等。优选的形成酸加成盐的酸包括HCl、HBr、硫酸和萘-1，5-硫酸。
应用 至于其最终应用，本发明可用于许多治疗目的。本发明可抑制凝血酶。因此，这些化合物可用于治疗或预防以涉及凝血酶生成或作用嘎的异常静脉或动脉血栓形成为特征的状态。这些状态包括但不限于深部静脉血栓形成；肺栓塞；动脉血栓形成；通常得自动脉肌纤维震颤期间的心房引起的或由透壁性心急梗塞之后的左心室(leftventricule)的全身性栓塞；不稳定心绞痛；再狭窄；成人呼吸窘迫综合征；内毒素性休克；化疗或放疗过程中或之后的过高血液凝固性；在感染性休克、病毒感染和癌症期间出现的弥散性血管内凝血病；心肌梗塞；中风；冠状动脉搭桥术；眼部纤维蛋白形成；矫形外科手术如髋关节置换术；和由血栓溶解疗法或经皮穿刺冠状动脉成形术(PCTA)引起的血栓形成。本发明优选的应用为预防或治疗深部静脉血栓形成。
本发明化合物预计可用于治疗和预防由任何机制包括细菌、多重创伤和中毒引起的弥散性血管内凝血。
本发明化合物预计可用于其中没有过高血液凝固性体征的凝血酶水平升高的情况，如Alzheimer′s病和胰腺炎。
其它用途包括所述凝血酶抑制剂植入或物理结合在用于制造用于血液采集、血液循环和血液储存的医学设备如导管、血液透析装置、血液采集注射器和试管和输血导管上的材料上作为抗凝剂的用途。本发明化合物还可在体外血液回路中用作抗凝剂。
据显示，支架可减少再狭窄，但会形成血栓。一种降低支架致血栓性的策略为在支架表面涂渍、植入吸附或共价连接凝血酶抑制剂。本发明化合物可用于该目的。本发明化合物可附着或植入可溶性和/或生物可降解的聚合物中，然后涂渍在支架材料上。所述聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、聚羟基-丙基异丁烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基-天冬酰胺(aspartamide)-苯酚或被棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸共聚物、聚ε己内酯(polyepsilon caprolactone)、聚羟基丁酸、聚正酯、缩醛树脂、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或双亲嵌段共聚物。参见欧洲专利申请761251、欧洲专利申请604,022、加拿大专利No.2,164,684和PCT公开申请Nos.WO 96/11668、WO 96/32143和WO96/38136。
由于凝血酶对许多细胞类型都有作用，如平滑肌细胞、上皮细胞和中性粒细胞，所以还发现本发明化合物可用于治疗或预防成人呼吸窘迫综合征；炎症应答；创伤愈合；再灌注损伤；动脉粥样硬化；和损伤如气囊血管成形术、经皮腔内斑块旋切术和动脉支架放置之后的再狭窄。
本发明化合物可用于治疗神经退化性疾病如Alzheimer′s病和Parkinson′s病。
本发明化合物的给药有效剂量范围为约0.1-约500mg/kg，优选为0.1-10mg/kg体重，一次给药或每天分2-4次给药。
本发明化合物可与血栓溶解剂如组织纤维蛋白溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶联用。另外，本发明化合物可与其它抗血栓药或抗凝血药如但不限于纤维蛋白原拮抗剂和血栓素受体拮抗剂联用。
本发明化合物还可与可溶性聚合物偶联作为靶向药物载体。所述聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基-丙基异丁烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基-天冬酰胺-苯酚或被棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷-聚赖氨酸。此外，本发明化合物还可与一类可用于控制药物释放的生物可降解聚合物如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸共聚物、聚ε己内酯、聚氰基丁酸、聚正酯、缩醛树脂、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或双亲嵌段共聚物偶联。
本发明的药用组合物可给予任何可经受本发明化合物有益作用的动物。尽管发明者不想这样限定，但排在最前的动物为人。
本发明的药用组合物可以任何能达到其预计目的的方式给予。例如，可经胃肠外、皮下、静脉、肌内、腹膜内、经皮、口腔含化或眼部途径给药。备选的或可同时进行的给药方式可为口服途径。给药剂量取决于受者的年龄、健康状况和体重，同期治疗的类型，如果还有的话，治疗频率、和所需效果的性质。
除了药理学活性化合物以外，新型药物制剂可包含合适的药学可接受载体，所述载体包括便于降化学化合物加工成可药用的制剂的赋形剂和助剂。
本发明的药用组合物由已知方式制备，如通过混合、制粒、包糖衣、溶解或冻干过程制备。因此，用于口服的药物制剂可通过下面的方法获得将活性化合物与固体赋形剂混合，任选将所得混合物研磨并将混合物加工成颗粒，加入合适的助剂后(如果需要或必需的话)得到片剂或糖衣片核。
对于适于给予敌人的本发明组合物，术语“赋形剂”是指包括但不限于Handbook of Pharmaceutical Excipients，AmericanPharmaceutical Association，2nd Ed.(1994)中描述的那些赋形剂，将该文献通过引用以其整体并入本文。特别地，合适的赋形剂为填充剂如糖类如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇，纤维素制品和/或磷酸钙如磷酸三钙或磷酸氢钙，以及粘合剂如采用如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮制成的淀粉糊。如果需要，可加入崩解剂，如上述淀粉，还有羧甲基淀粉，交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如海藻酸钠。。重要的助剂为流动调节剂和润滑剂如硅胶、滑石粉、硬脂酸或其盐如硬脂酸镁或硬脂酸钙和/或聚乙二醇。如果需要，糖衣片核具有可啼抵抗胃液的合适的包衣。为了该目的，可采用浓缩糖溶液，其可任选包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、保护膜涂液(lacquer solutions)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了得到可抵抗胃液的包衣，可采用合适的纤维素质谱的溶液，如邻苯二酸乙酰纤维素或羟丙基甲基-纤维素邻苯二甲酸酯。为了区分或为了鉴别活性化合物制品的剂量，可向片剂或糖衣片包衣中加入颜料或色素。
其它可口服的药物制剂包括由明胶制备的推-适胶囊(push-fitcapsule)以及用明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制备的软、密封胶囊。推-适胶囊可包含颗粒形式的活性化合物，其可与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁和任选稳定剂混合物。在软胶囊中，活性化合物优选溶于或悬浮于合适的液体中，如脂肪油或液体石蜡。此外，可加入稳定剂。
合适的胃肠外给药的制剂包括活性化合物的水可溶性形式如水可溶性盐的、碱性溶液和环糊精包合络合物的水溶液剂。特别优选的碱性盐为用Tris、胆碱氢氧化物、Bis-Tris丙烷、N-甲基葡萄糖胺或精氨酸制备的铵盐。可用一种或多种改性或未改性的环糊精来温度和增加本发明化合物的水溶性。在美国专利Nos.4,727,064，4,764,604和5,024,998中公开了可用于该目的的环糊精 此外，可给予活性化合物的混悬液如合适的油性注射混悬液。合适的亲脂溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如乙基油酸酯或甘油三酸酯或聚乙二醇-400(化合物可溶于PEG-400)。水性注射混悬液可包含能增加混悬液粘度的物质如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。任选地，所述混悬液还可包含稳定剂。
下面的实施例示例了但并不限制本发明的方法和组合物。其它经常遇到的并为本领域熟练技术人员所知的各种条件和参数的合适的修饰和改变都在本发明的精神和范围内。
通用合成方法 本发明化合物可根据方案I合成。
方案I
在-40℃-150℃下，优选室温下，在空气下将H2N-CH2-Y在溶剂如DCM或CH3CN中的溶液加入到实施例1i中制备的(6-氯-3-氰基-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基)-乙酸4-硝基-苯基酯在溶剂如CHCl3的混合物中，得到化合物III。式H2N-CH2-Y的化合物可购买得到或可根据已知方法合成；参见Org.Process Res.Dev.Vol 8，p.192，2004和J.Med.Chem.Vol 46，p.461，2003。然后将化合物III，X-NH2，一种碱如二异丙基乙胺(DIEA)和溶剂如DMSO的混合物在空气下在室温-150℃，优选100℃下搅拌，得到化合物I。式X-NH2的化合物可由已知方法制备；参见Org.Process Res.Dev.Vol 8，p.192，2004，J.Org.Chem.Vol 68，p.8838，2003、WO 9911267、WO 2004091613、J.Med.Chem.46461，2003和Chem.Pharm.Bull.48982，2000。
本申请不仅提供了能制备新型化合物的实用方法，还提供了广泛适用于将高度缺电子吡啶类和其它含N杂芳基化合物氧化为其N-氧化物的方法。优选的含N杂芳基为吡啶、嘧啶、吡嗪和喹啉。该反应发生在特定酸敏感性官能团可耐受的中性至酸性条件下。该反应在CH3CN或CH3CN和DCM(二氯甲烷)的混合物中进行。该反应还适用于缺电子嘧啶类和缺电子喹啉类化合物。方案2中显示了通用反应条件。
方案2
其中EWG为吸电子基团，优选卤素、-CF3、酯或-CN；和 n为1、2、3、4或5。
本领域熟练技术人员会认识到除了吸电子基团外，杂芳基上还可存在烷基。方案3中显示了优选的实例，特别优选的实例为其中EWG为-CO2烷基。
方案3
该反应最重要的方面为过碳酸钠和三氟甲磺酸酐的结合使用。本领域熟练技术人员能够领会，尽管该反应在3.5小时或16小时后被停止，但采用约30分钟至一周的任何时程，该反应均可顺利进行。通过TLC检测反应起始原料的损耗是最可靠的确定反应终点的方法。还应了解，也可用超出0℃-室温范围的温度。我们预计反应可在-50℃-40℃的温度范围下顺利进行。本领域熟练技术人员还了解还可采用除乙腈之外的溶剂，特别是溶剂混合物如乙腈和二氯甲烷(注意为了安全，在强氧化剂存在下我们不推荐采用醚溶剂)。最后，应了解猝灭反应(将反应物倒入碎冰和碳酸氢钠混合物中)、用二氯甲烷萃取、用亚硫酸钠破坏过量的过氧化氢、采用ISOLUTE_硅胶柱分离产物的步骤不是本发明的关键方面，本领域任何熟练技术人员都会猝灭该反应并通过其它的方法分离产物。
通用方法向烘干的4-打兰管中加入吡啶(1.0mmol)、过碳酸钠(157mg，1.0eq.)和无水CH3CN(5.0mL)。将该混悬液在冰水浴中冷却，向其中逐滴加入三氟甲磺酸酐(339μL，2.0eq.)。在加入三氟甲磺酸酐过程中有气泡产生。在0℃下将所得混合物继续搅拌3.5小时。3小时后大部分固体过碳酸钠消失。可采用TLC(或NMR光谱)检测反应进行过程中的等分部分(worked-up aliquot)中起始原料的消耗来监控反应，当TLC或NMR光谱显示不再发生反应时，可猝灭反应。然后将反应混合物倒入碎冰(10g)和饱和碳酸氢钠溶液(40mL)中。搅拌30分钟后，将混合物用DCM(3×20mL)萃取。用盐水(20mL)洗涤和合并的DCM溶液，用硫酸钠干燥。水溶液用10％Na2S2O5溶液处理。浓缩后，将DCM溶液装在20g ISOLUTE_硅胶柱上，用己烷/EtOAc洗脱。表1显示了缺电子吡啶类化合物的代表性的氧化。
表1.用Tf2O/Na2CO3-1.5H2O2在0℃-室温下的吡啶类化合物的氧化
*过夜反应经2-3小时升至室温。
或者，优选的缺电子吡啶、嘧啶、喹啉或哒嗪的氧化可采用脲过氧化氢代替过碳酸钠来完成。方案4中显示了优选的反应条件。 方案4
其中EWG为吸电子基团，优选卤素、-CF3、酯或-CN；和 n为1、2、3、4或5. 本发明最重要的方法为脲过氧化氢和三氟甲磺酸酐的结合。
实施例1 2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺二盐酸盐
a.2，5，6-三氟-尼克腈(nicotinonitrile)
将刚刚在空气下制成粉以除去凝块的2，6-二氯-5-氟-尼克腈(25.67g，134mmol)和喷雾干燥的KF(23.6g，406mmol)(Aldrich)一起振摇，确保在加入无水DMSO(30mL)之前完全混合。将该混合物在氩气下室温充分搅拌1-2分钟，然后置于100℃的油浴中搅拌5分钟。经10分钟将温度升至130℃，将该混合物在此温度下搅拌40分钟。反应物等分部分的NMR光谱证明在130℃下反应10分钟后转化率为86％，40分钟后转化率＞95％。然后将粘稠紫色混合物冷至室温，在冰浴中与DCM(30mL)一起振摇，然后将其直接装在用DCM预平衡的快速硅胶柱(1.0kg硅胶；120mm×6″)上。用DCM洗脱(140mL流分；合并流分10-19)，得到20.65g澄清浅琥珀色油状物。NMR光谱证明为1∶0.58mol比率的标题化合物DMSO(16.0g标题化合物；76％).1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.99(m，1H).LC/MS(ESI)质谱计算值158.0，实测值159.5(MH)+。
b.6-叔丁氧基-2，5-二氟-尼克腈
将与THF(20mL)预混合的1.04M KOtBu的t-BuOH溶液(110mL，114mmol)经15分钟逐滴加入到前面的步骤制备的含4.6gDMSO杂质的0℃的2，5，6-三氟-尼克腈(16.0g，101mmol)的t-BuOH(80mL)和THF(15mL；防止冻结)溶液中。所得均匀红琥珀色溶液在0℃下再搅拌5分钟，然后除去冰浴，将该溶液在室温下再搅拌20分钟。然后用5M NH4Cl(100mL)猝灭反应，用醚(2×100mL)萃取。用水(1×100mL)、1M NaCl(1×150mL)和4M NaCl(1×100mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)澄清紫色有机层，减压浓缩，置入醚(50mL)中，通过硅藻土滤垫过滤。用醚(3×50mL)洗涤滤饼，在50-60℃下减压浓缩合并的滤液，得到20.89g澄清紫色油状物。NMR显示为89∶11mol比率的标题化合物和2，6-二-叔丁氧基-5-氟-尼克腈(18.22g标题化合物；85％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.60(dd，1H)，1.67(s，9H)。
c.丙二酸叔丁酯甲酯，钠盐
将NaH(1.50g，59.4mmol)在醚(50mL)中的室温混合物置入-78℃浴中，然后立即在空气下在间歇振荡下用5份约2mL的丙二酸叔丁酯甲酯(10.33g，59.4mmol)处理。未出现气泡或放热。丙二酸酯加入完成后，立即将松开盖子的烧瓶在0℃的浴中振荡1-2分钟(无气泡)，然后在室温下小心间歇用喷枪加热10分钟。出现轻微冒泡后，将反应在室温下静置1小时，偶尔进行振荡，此时得到粘稠糊状物。然后在40℃通过旋转蒸发，接着通过高度真空除去挥发物，得到标题化合物，为易处理的基本上不吸湿的白色粉末(11.37g，98％)。
d.2-(6-叔丁氧基-3-氰基-5-氟-吡啶-2-基)-丙二酸叔丁酯甲酯
将实施例Ib中制备的6-叔丁氧基-2，5-二氟-尼克腈(18.22g，85.9mmol)、前面的步骤制备的丙二酸叔丁酯甲酯钠盐(34.49g，176mmol)和二氧六环(110mL)的粘稠混合物在氩气下在95℃(油浴)搅拌14小时。所得均匀深紫色溶液冷至室温，用醚(150mL)稀释，用含2.0M柠檬酸(40mL)的1.0M NaH2PO4(200mL)溶液洗涤。水层用醚(1×100mL)反萃取，合并有机层，用4M NaCl(1×100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，减压浓缩。在高度真空下在95℃经1小时从残留物中除去大部分丙二酸叔丁酯甲酯，得到标题化合物，为澄清深棕色粘稠油状物(32.37g，约100％粗产率)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.48(d，1H)，5.06(s，1H)，3.80(s，3H)，1.62(s，9H)，1.47(s，9H)。
e.(3-氰基-5-氟-6-羟基-吡啶-2-基)-乙酸甲酯
将茴香醚(6mL，55mmol)和TFA(58mL，750mmol)加入到前面步骤制备的2-(6-叔丁氧基-3-氰基-5-氟-吡啶-2-基)-丙二酸叔丁酯甲酯(31.87g，87mmol)中，所得均匀溶液在40℃下搅拌1.5小时。然后用旋转蒸发仪在40℃下浓缩反应物，再加入TFA(130mL，1.74mol)，将反应在室温下搅拌过夜。然后将反应物在≤40℃下用旋转蒸发仪浓缩，所得粘稠油状物溶于CHCl3(100mL)。接着，在0℃下经5-10分钟在搅拌下以5-10mL一份分批加入2.0M K2CO3(100mL)，直至水层的pH为9。然后在0℃下在搅拌下分批加入2.0M柠檬酸(30mL)至pH 4，加入CHCl3(100mL)和水(100mL)。水层用CHCl3(2×100mL)萃取，合并有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩得到粘稠深色油状物(16.6g)。残留物用硅胶快速色谱法纯化(9∶1→7∶3DCM/丙酮)，得到黄色固体标题化合物(9.10g，51％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ12.73(br s，1H)，7.30(d，1H)，3.92(s，2H)，3.82(s，3H)。
f(6-氯-3-氰基-5-氟-吡啶-2-基)-乙酸甲酯
将前面步骤中制备的(3-氰基-5-氟-6-羟基-吡啶-2-基)-乙酸甲酯(9.10g，43.3mmol)和POCl3(40mL，433mmol)在95℃下搅拌7小时。然后减压浓缩均匀的棕色溶液，将残留物置于冰浴，用醚(200mL)稀释，然后与冰水(100mL)一起振摇。水层用醚(1×100mL)萃取，合并有机层，干燥(Na2SO4)，在40℃减压浓缩，得到标题化合物，为澄清深琥珀色油状物(9.45g，96％).1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.75(d，1H)，4.06(s，2H)，3.77(s，3H)。
g.(6-氯-3-氰基-5-氟-吡啶-2-基)-乙酸
将前面步骤中制备的(6-氯-3-氰基-5-氟-吡啶-2-基)-乙酸甲酯(9.36g，40.9mmol)、4.0M HCl(aq)(256mL)和二氧六环(51mL)在65℃下剧烈搅拌2小时。然后将均匀的琥珀色溶液冷至室温，用DCM(3×100mL)萃取，干燥(Na2SO4)，在45℃下减压浓缩，得到标题化合物，为澄清深琥珀色油状物(7.40g，84％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ7.75(d，1H)，4.11(s，2H)。
h.(6-氯-3-氰基-5-氟-吡啶-2-基)-乙酸4-硝基-苯基酯
将前面步骤中制备的(6-氯-3-氰基-5-氟-吡啶-2-基)-乙酸(2.37g，11.0mmol)的均匀棕色溶液、4-硝基苯酚(1.84g，13.2mmol)和DCM(11mL)在0℃在氩气下搅拌，同时在搅拌下经3分钟逐滴加入加入1，3-二异丙基碳化二亚胺(DIC)(1.90mL，12.1mmol)。DIC加入完成后，立即除去冰浴，将带有浅黄色沉淀的棕色混合物在室温下搅拌40分钟。然后将粗反应物直接装在快速硅胶柱上，用96∶4甲苯/CH3CN洗脱，得到标题化合物，为半透明浅黄色油状物(3.11g，84％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ8.29(m，2H)，7.80(d，1H)57.35(m，2H)，4.35(d，0.7Hz，2H)。
i.(6-氯-3-氰基-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基)-乙酸4-硝基-苯基酯
方法A [注意尽管下面描述的反应进行时未发生事故，但还是在巨大的树脂玻璃隔离罩后进行]。将固体过碳酸钠(4.54g，(含～25％wt％(～43mmol)H2O2)，得自Aldrich)在空气下在搅拌下一次性加入到0℃的前面步骤中制备的(6-氯-3-氰基-5-氟-吡啶-2-基)-乙酸4-硝基-苯基酯(4.85g，14.5mmol)在CH3CN(110mL)中浅黄色溶液中。过碳酸钠加完后，立即在0℃在搅拌下经11分钟逐滴加入三氟甲磺酸酐(7.58g，26.9mmol)，所得半透明黄色溶液在0℃下搅拌3小时。然后将反应用冰冷的DCM(150mL)稀释，并用冰冷的1M NaHCO3(150mL)猝灭，将两层在0℃下搅拌7分钟。然后收集有机层；水层用DCM(2×100mL)萃取，合并有机层，干燥(2×Na2SO4)，过滤，在室温下减压浓缩，得到4.89g标题化合物粗品(NMR显示68mol％标题化合物，25mol％起始原料，和7mol％硝基苯酚)。将该物质在室温下在搅拌下用无水醚研磨5分钟(1×50mL；1×25mL)。NMR显示84mol％标题化合物，16mol％起始原料，完全除去了硝基苯酚。再在室温下在搅拌下研磨四次20分钟(1×50mL醚，1×55mL 10∶1醚/DCM，1×50mL 1∶1醚/DCM，和1×50mL DCM)，每次研磨后除去上清液，得到标题化合物，为类白色固体(2.96g，58％)。NMR显示96mol％标题化合物和4mol％起始原料。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ8.29(m，2H)，7.46(d，1H)，7.36(m，2H)，4.37(d，0.7Hz，2H)。
方法B 将(6-氯-3-氰基-5-氟-吡啶-2-基)-乙酸4-硝基-苯基酯(35.90g，106.95mmol)溶于乙腈(179.50mL)并用冰/水浴冷至0℃。向混合物中加入脲过氧化氢(23.14g，245.98mmol)搅拌5分钟。然后在0℃下经2.25小时向反应混合物中加入三氟甲磺酸酐(66.38g，235.28mmol)，加入过程中保持温度低于3.5℃。加入完成后，将混合物继续在同样的温度下搅拌2小时。再向反应混合物中加入脲过氧化氢(2.3g，24.4mmol)、三氟甲磺酸酐(4mL，23.8mmol)，然后在0℃下搅拌30分钟。再向混合物中加入等分部分的脲过氧化氢(2.3g，24.4mmol)和三氟甲磺酸酐(4mL，23.8mmol)。将混合物在0℃下搅拌15分钟，HPLC显示反应96％完全。向混合物中小心加入亚硫酸氢钠溶液(5％，1000mL)，加入过程中保持温度低于10℃。将混合物在0℃在冰/水浴中搅拌5分钟，然后储存在冰箱中过夜。过滤浆液，用水(2×100mL and 50mL)洗涤。所得固体在真空下在60℃干燥6小时，得到棕色固体(31.7g，84％)。1H-NMR(400MHz，d3-乙腈)8.32(m，2H)，7.75(m，1H)，7.37(m，2H)，4.32(s，2H)。19F-NMR(376MHz，d3-乙腈)-115ppm。C14H7N3O5ClF元素分析计算值C 47.81，H 2.00，N11.95，F 5.40，Cl 10.08.实测值C 47.66，H 1.70，N 11.82，F 5.84，Cl10.16.m.p.＝171.9-173.6℃。
j.(3-氟-吡啶-2-基)-甲基胺
将(3-氟-吡啶-2-基)-甲基胺二盐酸盐(1.313g，6.60mmol)(WO00/75134 A1；Chem.Pharm.Bull.33565，1985)在醚(6mL)和2.5MNaOH(5mL；12.5mmol)之间分配。水层(pH约8)用DCM(4×20mL)萃取。然后用2.5M NaOH将水层调至pH～12，用DCM(2×20mL)萃取，合并DCM和醚层，干燥(2×Na2SO4)，用旋转蒸发仪在＜30℃下浓缩，得到标题化合物的游离碱，为澄清深棕色油状物(780mg，94％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ8.38(dt，1H)，7.39-7.32(m，1H)，7.24-7.17(m，1H)，4.06(d，2H)，1.83(br s，2H)。
k.2-(6-氯-3-氰基-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基)-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺
在空气下室温将前面步骤中制备的(3-氟-吡啶-2-基)-甲基胺(698mg，5.53mmol)在DCM(35mL)和CH3CN(5mL)中的均匀溶液加入到实施例1i中制备的(6-氯-3-氰基-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基)-乙酸4-硝基-苯基酯(1.801g，5.12mmol)在CHCl3(10mL)中的混合物中。然后盖上烧瓶，将混合物在室温下搅拌10小时，此时其变为半透明琥珀色溶液。[NMR显示85％转化为标题化合物，未剩余(3-氟-吡啶-2-基)-甲基胺]。反应10小时后，再加入(3-氟-吡啶-2-基)-甲基胺(68mg，0.53mmol)，将反应再搅拌12小时，然后用旋转蒸发仪浓缩至适于直接装在用EtOAc预平衡的硅胶快速柱上的半透明琥珀色溶液(～15mL)。用EtOAc洗脱，得到标题化合物，为类白色固体(1.29g，74％)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ8.36(dt，1H)，7.55(br s，1H)，7.44-7.36(m，1H)，7.41(d，1H)，7.30-7.23(m，1H)，4.66(dd，2H)，4.20(s，2H)。
1.2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺
将前面步骤中制备的2-(6-氯-3-氰基-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基)-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺(1.156g，3.42mmol)、2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙胺(651mg，4.12mmol)(J.Med，Chem.46461，2003；Chem.Pharm.Bull.48982，2000)、DIPEA(622μL，3.76mmol)和DMSO-d6(2.8mL)的混合物在100℃下在空气下搅拌2小时。此时粗反应物的NMR显示转化率为～95％。然后将粗反应物装在用4∶1 EtOAc/丙酮预平衡的硅胶快速柱上(600mL无水硅胶)，用4∶1→3∶1 EtO Ac/丙酮洗脱，得到标题化合物，为类白色固体(935mg，59％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ8.65(m，1H)，8.31(dt，1H)，7.99(m，2H)，7.83(td，1H)，7.67(m，1H)，7.42(m，1H)，7.36(m，1H)，7.31-7.20(m，2H)，4.63(dd，2H)，4.55(dt，2H)，4.15(s，2H)。
m.2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺二盐酸盐
方法A 在轻微加热下将前面步骤中制备的2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺(920mg，2.00mmol)溶于无水CH3CN(42mL)中。在空气下在振荡下向该均匀热溶液中一次性加入0.202M HCl/CH3CN(21mL；4.24mmol HCl)溶液。(0.202M HCl/CH3CN溶液通过简单地将无水HCl气体通入包含无水CH3CN的称皮重的(tared)量筒中至终体积为47.7mL而得到)。盖上所得均匀溶液，在室温下静置过夜，30分钟内开始有晶体析出。晶体完全析出后，滗出琥珀色上清液，将晶体与无水CH3CN(20mL)一起振摇，滗出溶剂，然后在CH3CN(20mL)存在下将晶体从烧瓶中刮出。然后将晶体在真空下干燥，用研钵和研棒研成粉末，在真空下干燥过夜，得到一批标题化合物的一水合物，为淡粉色晶状固体(612.3mg，57％)。1H-NMR(300MHz，CD3OD)δ8.82(d，1H)，8.65(m，1H)，8.51(dt，1H)，8.10-8.00(m，2H)，7.80(d，1H)，7.77(td，1H)，7.60(m，1H)，4.89(d，2H)，4.57(dt，2H)，4.15(s，2H).LC/MS(ESI)游离碱质谱计算值460.1，实测值461.1(MH)+。游离碱·2.04HCl·1.07H2O·0.045CH3CN元素分析计算值C，45.57；H，3.68；N，15.23；Cl，13.02.实测值C，45.47；H，3.40；N，15.1；Cl，13.02.卡尔·费歇尔法测定的水含量％3.46。
方法B 用油浴在搅拌下将400mg 2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺在8.0mL乙腈中的混悬液加热至75℃。在72℃下固体开始溶解，在75℃下完全溶解形成黄色溶液。在油浴中将混合物缓慢冷至约53℃。在搅拌下向混合物中逐滴加入0.2mL盐酸(37％，ACS试剂，ca.9.8M)在0.3mL乙腈中的溶液。几乎立即生成沉淀。在剧烈搅拌下将所得混合物冷至室温。将混合物冷至室温。然后将混合物置入冰箱过夜。过滤所得浆液，用少量冷乙腈冲洗。所得固体用研钵和研棒研磨，在25℃下真空干燥过夜，得到白色晶状固体(0.45g，94％)1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.78(dd，J＝1.14，5.77Hz，1H)，8.60(dm，J＝4.18Hz，1H)，8.46(dt，J＝1.16，8.70Hz，1H)，8.02(m，1H)，7.97(dt，J＝1.68，7.81Hz，1H)，7.77(d，J＝11.98Hz，1H)，7.71(td，J＝7.95，0.99Hz，1H)，7.53(dd，J＝4.91，7.59Hz，1H).4.86(d，J＝0.94Hz，2H)，4.54(t，J＝13.90Hz，2H)，4.12(s，2H).LC/MS(APCI)游离碱质谱计算值460.1，实测值460.9(MH)+。游离碱·2HCl·H2O元素分析计算值C，45.75；H，3.66；N，15.24；Cl，12.86；H2O，3.27.实测值C，45.63；H，3.34；N，15.11；Cl，13.06.卡尔·费歇尔法测定的水含量％3.15。
n.2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺一氢溴化物
在油浴中在搅拌下将2.0g 2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺在40mL乙腈中的混悬液加热至75℃。在72℃时固体开始溶解，在75℃时完全溶解形成黄色溶液。将混合物在油浴中缓慢冷至约53℃。在搅拌下向混合物中逐滴加入0.59mL氢溴酸(48％，ACS试剂，ca.8.84M)在2mL乙腈中的溶液。几乎立即生成沉淀。在剧烈搅拌下将混合物冷至室温。然后将混合物置入冰箱过夜。过滤所得混合物，用少量冷乙腈冲洗。所得固体用研钵和研棒研磨，在78℃下真空干燥2小时，得到浅黄色晶状固体(2.11g，86％)1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ8.76(dd，J＝1.12，5.71Hz，1H)，8.60(dm，J＝4.73Hz，1H)，8.42(dt，J＝1.11，8.72Hz，1H)，8.00(m，1H)，7.96(dt，J＝1.64，7.79Hz，1H)，7.77(d，J＝11.97Hz，1H)，7.70(td，J＝7.93，0.87Hz，1H)，7.52(dd，J＝4.98，7.45Hz，1H).4.85(s，2H)，4.54(t，J＝14.05Hz，2H)，4.12(s，2H).LC/MS(APCI)游离碱质谱计算值460.1，实测值461.0(MH)+。游离碱·1.2HBr·0.6H2O元素分析计算值C，44.38；H，3.26；N，14.79；Br，16.87；H2O，1.90.实测值C，44.48；H，3.08；N，14.71；Br，17.21.卡尔·费歇尔法测定的水含量％1.99。
实施例2 片剂制备 分别包含25.0、50.0和100.0mg活性化合物2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺二盐酸盐的片剂制备如下 含25-100mg活性化合物剂量的片剂 将所有活性化合物、纤维素和一份玉米淀粉混合并制粒成10％玉米淀粉糊。将所得颗粒过筛、干燥，与剩下的玉米淀粉和硬脂酸镁混合。然后将所得颗粒分别压成含25.0、50.0和100.0mg活性成分/片的片剂。
实施例3 静脉注射液制备 上面提到的实施例1的活性化合物的静脉给药剂型制备如下 活性化合物 0.5-10.0mg 柠檬酸钠5-50mg 柠檬酸 1-15mg 氯化钠 1-8mg 注射用水(USP) 适量加至1ml 采用上面的分量，将活性化合物在室温下溶于预先配置好的氯化钠、柠檬酸和柠檬酸钠的注射用水溶液中(USP，see page 1636 ofUnited States Pharmacopeia/National Formulary for 1995，published byUnited States Pharmacopeial Convention，Inc.Rockville，Maryland(1994)(美国药典/美国国家处方集，1995版，第1636页，美国药典委员会出版))。
实施例4 纯化酶的体外抑制作用 试剂AU缓冲盐得自Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，为能得到的最高纯度。
人α-凝血酶得自Enzyme Research Laboratories(South Bend，Indiana)。
用显色底物进行的动力学分析 用动力学分析法采用对硝基苯胺显色底物在405nm监测来评价化合物对凝血酶的抑制活性。所用的分析缓冲液为50mM HEPES，pH 7.5，200mM NaCl和新鲜配制的0.05％正辛基β-d-吡喃葡萄糖苷。DMSO的终浓度为4％，来自底物和抑制化合物母液。在96孔低结合聚苯乙烯板中，将底物在分析缓冲液中的280uL溶液与10μL试验化合物的DMSO溶液在37℃下预孵育15分钟，得到与Ki值接近的(bracketed the Ki)的最终试验化合物浓度。加入10μL蛋白酶开始反应，在37℃，405nm用Molecular Devices Spectramax 340板读数器动力学监测由于底物的溶蛋白性裂解而产生的吸光度的增加。通过分析反应初期的线性部分确定初速度。将vo/vi对抑制剂浓度的曲线图(其中vo＝没有抑制剂的速度，vi＝抑制速度)进行线性回归，从斜率的倒数确定IC50。采用分析的特定Ki因子从IC50计算Ki，计算公式Ki＝IC50×Ki因子，或Ki＝IC50×(1/(1+[S]/Km))，其中S为分析中的底物浓度，Km为底物的Michaelis常数(Cheng Y andPrusoff WH(1973)Biochem Pharmacol 223099-3108)。
凝血酶分析掺入了底物SucAAPR pNA(Bacliem L-1720，[S]＝100uM final，Km＝320μM，Ki因子＝0.76)。将底物的DMSO溶液(10.7mM)在分析缓冲液中稀释100倍至终浓度为100μM。将人α-凝血酶(Enzyme Research Laboratories HTl 002a)在分析缓冲液中稀释1500倍至终分析浓度为1.1nM。
结果表明实施例的化合物对人凝血酶的Ki值在9.8和11nM之间。
现在完全描述了本发明，本领域普通技术人员应了解，在宽广的和等同范围的条件、制剂和其它参数也可进行同样的实验而不影响本发明或其任何实施方案的范围。本文所有引用的专利和公开通过引用以其整体完全并入本文。
权利要求
1.一种式I的化合物
式I
其中X为
或
和
Y为
或
及其药学可接受盐。
2.一种药用组合物，所述组合物包含权利要求1的化合物和药学可接受载体。
3.权利要求2的药用组合物，还包含至少一种抗凝血剂、抗血小板剂或血栓溶解剂。
4.权利要求2的药用组合物，其中所述化合物的量为约0.1-约500mg。
5.一种抑制或治疗需要其的哺乳动物由血栓溶解疗法或经皮穿刺冠状动脉成形术引起的深部静脉血栓形成、弥散性血管内凝血病、眼部纤维蛋白形成、心肌梗塞、中风或血栓形成的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的权利要求1的化合物。
6.一种在手术前或手术后治疗人的方法，所述手术为冠状动脉血管成形术、冠状动脉搭桥术和髋关节置换术。
7.一种治疗或预防以涉及哺乳动物凝血酶产生或作用的异常静脉或动脉血栓形成为特征的状态的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物权利要求2的组合物。
8.一种抑制哺乳动物血小板凝聚物形成、抑制纤维蛋白形成、抑制血栓形成或抑制栓塞形成的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的权利要求2的组合物。
9.一种用于血液采集、血液储存或血液循环的医学设备，所述所述设备包含植入或物理黏附于所述医学设备上的权利要求1的化合物。
10.一种医学设备，所述设备为导管、支架、血液透析仪、血液采集注射器或管或输血导管，所述设备包含植入或物理黏附于所述医学设备上的权利要求1的化合物。
11.一种治疗化疗中的哺乳动物不稳定心绞痛、再狭窄、成人呼吸窘迫综合征、内毒素性休克或过高血液凝固性的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的权利要求2的组合物。
12.一种治疗人的Parkinson′s病或Alzheimer′s病的方法，所述方法包括给予所述人有效量的权利要求2的组合物。
13.权利要求12的组合物，其中所述酶为凝血酶。
14.一种哺乳动物体内血栓成像的方法，所述方法包括联用式I化合物和放射性同位素。
15.一种合成吡啶N-氧化物的方法，所述方法包括
将吡啶与过碳酸钠和三氟甲磺酸酐以各自约二分之一当量-各自约10当量的量在约-50℃-约40℃的温度下在溶剂中反应。
16.权利要求15的方法，其中所述温度为-10℃-10℃。
17.一种合成嘧啶N-氧化物的方法，所述方法包括
将嘧啶与过碳酸钠和三氟甲磺酸酐以各自约二分之一当量-各自约10当量的量在约-50℃-约40℃的温度下在溶剂中反应。
18.一种合成喹啉N-氧化物的方法，所述方法包括
将喹啉与过碳酸钠和三氟甲磺酸酐以各自约二分之一当量-各自约10当量的量在约-50℃-约40℃的温度下在溶剂中反应。
19.一种合成吡嗪N-氧化物的方法，所述方法可
将吡嗪与过碳酸钠和三氟甲磺酸酐以各自约二分之一当量-各自约10当量的量在约-50℃-约40℃的温度下在溶剂中反应。
20.权利要求19的方法，其中所述吡嗪起始原料在2-位被吸电子基团取代，在5-位被甲基取代。
21.权利要求20的方法，其中所述吸电子基团为-CONH2。
22.一种合成吡啶N-氧化物的方法，所述方法包括
将吡啶与脲过氧化氢和三氟甲磺酸酐以各自约二分之一当量-各自约10当量的量在约-50℃-约40℃的温度下在溶剂中反应。
23.权利要求22的方法，其中所述温度为-10℃-10℃。
24.一种合成嘧啶N-氧化物的方法，所述方法包括
将嘧啶与脲过氧化氢和三氟甲磺酸酐以各自约二分之一当量-各自约10当量的量在约-50℃-约40℃的温度下在溶剂中反应。
25.一种合成喹啉N-氧化物的方法，所述方法包括
将喹啉与脲过氧化氢和三氟甲磺酸酐以各自约二分之一当量-各自约10当量的量在约-50℃-约40℃的温度下在溶剂中反应。
26.一种合成吡嗪N-氧化物的方法，所述方法包括
将吡嗪与脲过氧化氢和三氟甲磺酸酐以各自约二分之一当量-各自约10当量的量在约-50℃-约40℃的温度下在溶剂中反应。
27.权利要求26的方法，其中所述吡嗪起始原料在2-位被吸电子基团取代，在5-位被甲基取代。
28.权利要求27的方法，其中所述吸电子基团为-CONH2。
29.一种化合物，为2-[3-氰基-6-(2，2-二氟-2-吡啶-2-基-乙基氨基)-5-氟-1-氧基-吡啶-2-基]-N-(3-氟-吡啶-2-基甲基)-乙酰胺及其药学可接受盐。
全文摘要
本发明描述了式I化合物或其药学可接受盐，用于预防或治疗与哺乳动物凝血酶活性相关的疾病和病症。本发明还涉及含氮杂芳基的N-氧化的新型方法。
文档编号C07D213/89GK101228129SQ200680021986
公开日2008年7月23日 申请日期2006年3月21日 优先权日2005年4月20日
发明者K·克罗伊特尔, T·卢, Y·K·李, C·特尔哈, M·普莱尔, X·朱 申请人:詹森药业有限公司