专利名称：一种达托霉素的合成方法
技术领域：
本发明涉及新型抗生素达托霉素(Daptomycin)的一种合成方法。特 别涉及固液相结合的达托霉素合成方法。
背景技术：
近年来随着抗生素应用的增多，细菌的耐药性问题日益严重。在美国， 临床上分离到的金葡菌有95。/。对青霉素耐药,50。/。以上对甲氧西林耐药(Frindkin SK, Gaynes RP. Antimicrobial resistance in intensive care units. Clin Chest Med. 1999, 20(2) :303-316);在日本，耐甲氧西林金葡菌(MRSA)在皮 肤感染中的比例逐年上升(Nishijima S. The incidence of isolation of methicillin-resistant 5Y邵力/JocociAS si/reus(MRSA) strains from skin infections during the past three years. JDermatil, 1993, 20(4) : 193-197)。 尽管万古霉素常常被认为是抵抗革兰阳性菌感染的最后防线，但这道防线并非牢 不可破，20世纪80年代以来，万古霉素耐药菌株有增长趋势，包括耐万古霉素 金葡菌禾口肠球菌(The centers for Disease Control and Prevention. 5Yap/ yJocoms ai/reus with reduced sueceptibility to vancomycin-United States 1997. JAMA, 1997， 278(11):891-892)。革兰阳性菌是皮肤感染中很常见的致病菌，随着MRSA对万古霉素的敏感 性下降，作用机制不同于万古霉素的抗生素显得极其重要。2003年9月，美国 FDA批准注射用Daptomycin(商品名cubicin⑧)用于治疗复杂性皮肤及皮肤软组织 感染(cSSSIs)，包括较大的脓肿，术后切口感染和感染性溃疡，特别是由金葡菌、 化脓性链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌似马亚种(ar印tococcuy ^wgate^ae 孤fc/^d^ ^w'w'TO'fo)以及耐万古霉素粪肠球菌引起的感染(Cubicin [package insert]. Lexington, Mass: Cubist Pharmaceuticals, Inc. ;2003)。Daptomycin最初由Lily公司开发，于1994年转让给C u b i s t制药公司，Daptomydn的整个开发时间长达22年之久，是具有着独特抗菌特性的环脂肽类 抗生素。独特的作用机制使得细菌对Daptomycin产生耐药性可能会比较困难。 目前，Daptomycin是由玫孢链霉菌(Srr印tomyces roseo^pon^)发酵制得，由于专利保护等各种原因，玫孢链霉菌不易得。
发明内容
本发明的目的是提供一种Daptomycin的合成方法，通过固液相结合， 首次人工合成D邻tomycin。主要解决现有以玫孢链霉菌作为原料合成成本过高 的技术问题。本发明的方法包括如下步骤以2-氯三苯甲基氯树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护 基团的氨基酸，其中Fmoc-AA、 DIC、 HOBT三者间重量比为1:1:1， Fmoc-AA 缩合过量2 5倍，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，每一步连 接氨基酸縮合都经过kaiser test检测，如反应呈阳性则重复接氨基酸。同样的固 相方法连接正癸酸，至kaiser test检测阴性，无需脱去Fmoc-保护基团步骤。通 过酯化的步骤连接下一个氨基酸，Fmoc-AA、 DIC、 DMAP三者间重量比为3:3:1， Fmoc-AA縮合过量1 2倍，一次反应时间为2~4h，连续反应两次，反应结束无 需kaiser test检测，直接脱去Fmoc-保护基团。同样的固相方法连接剩余的两个 氨基酸，并依次脱去Fmoc-保护基团。用1~2%TFA或CH2Cl2溶液将全保护肽从树脂上切下，处理切割液浓縮至 干，加入乙醚析出固体，干燥。液相环化时，需添加环化剂:PyBOP、 HOAT，全保护多肽:PyBOP:HOAT三 者间重量比为1:2:2，全保护多肽的浓度为lO—tlO^mol/L,有机溶剂为DMF, CH2Cl2或THF中的一种，反应过夜。用TFA:水:苯甲硫醚三者间重量比为95:2.5:2.5的混合液处理环化产品2~3h，切去肽的保护基，吹干后加入乙醚析出固体，过滤后得粗品。 本发明中一些常用的缩写具有以下含义2-Cl-Chlorotrityl Chloride Resin:2-氯三苯甲基氯树脂Fmoc:芴甲氧羰基tBu:叔丁基OtBu:叔丁氧基Trt:二苯基BOC:叔丁氧羰基Fmoc-AA: N-芴甲氧羰基-氨基酸Fmoc-Gly-OH:Fomc-Asp(OtBu)-OH:N-芴甲氧羰基-天冬氨酸 FmooD-Ala-OH:N-銜甲氧羰基-D-丙氨酸 Fmoc-Oni(Boc)-OH:N-銜甲氧羰基-鸟氨酸(叔丁氧羰基) Fmoc-Thr-OH:N-新甲氧羰基-苏氨酸 Fmoc-Asn(Trt)-OH:N-荷甲氧羰基-天冬酰胺(三苯基) FmooTrp(Boc)-OH:N-笏甲氧羰基-色氨酸(叔丁氧羰基) D'ecanoic acid:正癸酸Fmoc-Kyn(Trt)-OH:N-笏甲氧羰基-犬尿氨酸(三苯基) Fmoc-3-CH3-Glu(OtBu)-OH:N-药甲氧羰基-3-甲基-谷氨酸(叔丁氧基) Fmoc-D-Ser(tBu)-OH:N-荷甲氧羰基-D-丝氨酸 Fmoc-Tyr(OtBu)-OH: N-芴甲氧羰基-酪氨酸(叔丁氧基) Fmoc-Glu(OtBu)-OH: N-芴甲氧羰基-谷氨酸(叔丁氧基) DIC: 二异丙基碳化二亚胺PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷HOAT:N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑HOBt: 1-羟基苯并三唑DMAP:4-二甲氨基吡啶DMF:N， N-二甲基甲酰胺TFA:三氟醋酸Piperidine:吡聢CH2Cl2:二氯甲烷THF:四氢呋喃Et2。乙醚合成路线如下Fmoc-AArOH"(^)脱保护HOBT ，DIC,DIEA^Fmoc-AA2Fmoc-AArAAi-( P接肽 脱保护Decanoic acid-AA10-......AArFmooAAuDIC，DMAP池*效 脱保护Decanoic acid-AA10....AA7..AAr卩pAAFmoc-AA12 FrrKK>AA13 脱保护Decanoic acid-AAlo,.AA7,AA'-「PAA13AA12.AA"切割 环化Daptwnycin或类似物目标分子HPLC焦格产-口-cm卩P 〗一2-Cl-QJorotrityl Qiloride Resin本发明的有益效果是我们选择了固液相结合的方式合成Dapto顶ycin，并且 应用DIC/DMAP体系进行酯化反应，效果理想。开环点的选择也有效地避免了 消旋的产生。该方法简单易操作，适合结构类似物的大量合成。
具体实施例方式以下将参照实例对本发明作进一步的详细描述，但本发明不限于此具体实例。本发明合成步骤也可用于具有达托霉素相似结构的环B:化合物的合成。 实施例.D即tomycin合成3Ll固相制备全保护多肽称取2-Cl-Chlorotrityl Chloride树脂(0.4 0.5mmol/g)0.5g，用100mlDMF浸泡， 使树脂充分溶胀，抽干。取0.15gFmoc-Gly-OH放入接肽瓶中,60mlDMF溶解后 加入0.6mlDIEA， 25。C反应1小时。抽干，加入60ml甲醇反应10rnin。抽干， 分别用DMF，Me0H， CH2C12及Et20各洗涤三次，干燥。称重0.081g。取代度为 0.54mmol/g。将上述树脂放入接肽瓶中，加入50ml20。/。piperidine(DMF)振荡5min，抽干。 再加入5Oml20。/。piperidine(DMF)振荡15min,然后抽干，用DMF，MeOH和CH2Q2 依次各洗涤三次，然后依次接Fmoc-Asp(OtBu)-OH 、 Fmoc-D-Ala-OH 、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH 、 Fmoc-Orn(Boc)-OH 、 Fmoc-Gly-OH 、 Fmoc-Thr-OH 、 Fmoc-Asp(C)tBu)-OH、 Fmoc陽Asn(Trt)-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Decanoic acid， 用0.627mmo1的Fmoc-AA-OH/DIC/HOBt(三者之间重量比为l:l:l)縮合，DMF 为溶剂，脱Fmoc用20%piperidine(DMF)，脱2次，第一次5分钟，第二次15 分钟。其中，连接Decanoic acid方法同连接保护氨基酸，连接结束不需脱Fmoc。洗條后抽干，取出树脂，干燥。取0.5g千燥后的树脂放入接肽瓶中，加入<formula>formula see original document page 8</formula>0.81mmolFmoc-Kyn(Trt)-OH/DIC/DMAP(三者之间重量比为3:3:1),DMF为溶剂， 反应3h，连续反应2次。抽干，DMF，MeOH及CH2C12依次各洗涤三次，用 2(^piperidine(DMF)脱Fmoc,脱2次，第一次5分钟，第二次15分钟。同法洗 涤后抽干，最后依次接Fmoc-3-CH3-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-D-Ser(tBu)-OH,方法同上。1.2液相环化将连接好的树脂干燥后放入100ml的茄形瓶中，加入40mll~2%TFA/CH2Cl2， 振荡反应lh，过滤，取滤液。用三乙胺将滤液pH调至中性，浓縮至干。加入Et20, 析出白色固体，用Et20反复洗涤后，干燥。得0.04g固体，即1.5*10—5mmol。将固体投入干燥的250ml茄形瓶中，并加 入4.5nO-5咖olPyBOP/HOAT(两者之间重量比为1:1),用100ml 0 :12溶解，室温 反应过夜。1.3切保护，纯化处理将反应好的反应液常规处理后，浓縮至干，加入10mlTFA:水:苯甲硫醚的重 量比为95:2.5:2.5的混合溶液，振荡反应2h后，用N2将切割液吹干，加入Et20 有白色沉淀析出，Et20反复洗涤后，得粗品0.043g。
权利要求
1. 一种达托霉素的合成方法，主要包括如下步骤a、以2-氯三苯甲基氯树脂为载体，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，期间依次脱去Fmoc-保护基团；b、用同样的方法连接正癸酸后，再通过酯化的步骤连接下一个氨基酸，脱去Fmoc-保护基团，剩余的两个氨基酸按照正常的固相方法连接，并且脱去Fmoc-保护基团；c、用三氟醋酸或二氯甲烷溶液将全保护肽从树脂上切下，处理干燥后，在有机溶剂中完成首尾液相环化；d、最后用三氟醋酸和水及苯甲硫醚混合溶液将肽从树脂上切下，得到粗品。
2、 根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是固相合成 连接氨基酸过程中，脱去Fmoc-保护基团的脱保护剂用N-荷甲氧羰基-氨基酸、 二异丙基碳化二亚胺和1-羟基苯并三唑，三者之间重量比为1:1:1， N-苑甲氧羰 基-氨基酸縮合过量2~5倍。
3、 根据权利要求1或2所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是在接 氨基酸过程中每一步縮合都经过kaiser test检测，如反应呈阳性则重复接氨基酸。
4、 根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是酯化反应 过程中，脱去Fmoc-保护基团脱保护剂用N-芴甲氧羰基-氨基酸、二异丙基碳化 二亚胺和4-二甲氨基吡啶，三者之间重量比为3:3:1， N-芴甲氧羰基-氨基酸缩合 过量1 2倍， 一次反应时间为2 4h，连续反应两次，反应结束无需kaiser test检 测，直接脱去Fmoc-保护基团。
5、 根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是所述的三 氟醋酸或二氯甲烷溶液浓度为1~2%。
6、 根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是液相环化 时，需添加环化剂六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷、N-羟基-7-偶氮苯 并三氮唑，全保护多肽六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑的重量比为1:2:2，全保护多肽的浓度为1(T^l(^md/L,有机溶 剂为N, N-二甲基甲酰胺,二氯甲垸或四氢呋喃中的一种，室温反应过夜。
7、 根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是步骤c中 混合溶液三氟醋酸水:苯甲硫醚的重量比为95:2.5:2.5。
8、 根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是肽从树脂 上切下反应时间为2 3h。
9、 根据权利要求1所述的一种达托霉素的合成方法，其特征是步骤c处 理干燥是指将切割液浓縮至干或吹干，加入乙醚析出固体处理。
全文摘要
本发明涉及一种达托霉素的合成方法。主要解决现有以玫孢链霉菌作为原料合成成本过高的技术问题。主要合成步骤a.以2-氯三苯甲基氯树脂为载体，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护十肽树脂，期间依次脱去Fmoc-保护基团；b.用同样的方法连接正癸酸后，再通过酯化的步骤连接下一个氨基酸，脱去Fmoc-保护基团，剩余的两个氨基酸按照正常的固相方法连接，并且脱去Fmoc-保护基团；c.用三氟醋酸或二氯甲烷溶液将全保护肽从树脂上切下，处理干燥后，在有机溶剂中完成首尾液相环化；d.最后用三氟醋酸和水及苯甲硫醚混合溶液将肽从树脂上切下，得到粗品。本发明主要可用于合成达托霉素。
文档编号C07K1/00GK101235080SQ20071003700
公开日2008年8月6日 申请日期2007年1月31日 优先权日2007年1月31日
发明者徐红岩, 陆婷婷 申请人:中国科学院上海有机化学研究所;吉尔生化(上海)有限公司