香豆草醚类化合物及其组合物的用途的制作方法

专利名称：：香豆草醚类化合物及其组合物的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物提取物，尤其涉及一种从菊科植物中提取的香豆草醚类化合物，或者含有该化合物的药物组合物的用途。
背景技术：
：墨旱莲是一味传统的中药材，为菊科植物鳢肠(EcliptaprostrataLinn.)的全草，始载于《唐本草》。中医认为墨旱莲性甘酸、凉，入肝、肾经，具有滋肝补血、凉血止血之功效，主治吐血、咳血、须发早白、淋浊、带下等症。据报道，墨旱莲全草含皂甙、黄酮、鳢肠素(Ecliptine)、鞣质、维生素、烟碱以及多种噻吩化合物等；叶含香豆草醚类化合物，如蟛蜞菊内酯(Wedelolactone)、去甲基蟛蜞菊内酯和去甲基蟛蜞菊内酯-7-葡萄糖甙。1956年，Govindachari等首次从Wedeliacalendulacea中分离出香豆草醚类成分蟛蜞菊内酯Oedelolactone)，其结构为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(ChemicalExaminationofWedeliaCalendulacea,PartI,StructureofWedelolactone.Govindachari,etal.JournaloftheChemicalSociety,1956，629-632;ChemicalInvestigationofWedeliaCalendulacea,PartII,ThePositionoftheMethoxylGroupinWedelolactone.Govindachari,etal.JournaloftheChemicalSociety,1957，545-547)。其后Bhargava等从旱莲草(iiWipta中分离出去甲蟛蜞菊内酯(demethylwedelolactone)，结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(IsolationofdesmethylwedelolactoneanditsglucosidefromEcliptaalba.Bharg纖KK.，etal.IndianJChem，1970,8(7):664-665)。LiCC.等及美国专利6,552，071公开了该类化合物衍生物的结构及合成方法(Totalsynthesisofwedelolactone.LiCC.，etal.JOrgChem，2003,68(22):8500-8504;Methodsfortreatingcelldeathdiseasesandinflammation.Yuan,etal.UnitedStatesPatent6,552,071)。现代药理学研究表明，墨旱莲具有止血、免疫调节、扩血管、抗诱变、抗炎等方面的作用。有研究表明，墨旱莲有较强的免疫双向调节作用。墨旱莲的乙酸乙酯提取物可显著增强免疫功能低下小鼠的T细胞介导的细胞免疫应答、对抗免疫器官萎縮，还可显著提高血清溶血素水平及外周血T淋巴细胞CD4亚群的比例；但对于免疫功能正常的小鼠，墨旱莲的乙酸乙酯提取物则能显著抑制其T细胞介导的细胞免疫应答(墨旱莲的免疫抑制作用.覃华，刘梅，刘雪英，包国林.陕西中医，2002，23(1):73;墨旱莲乙酸乙酯总提物对免疫抑制小鼠免疫功能的影响.刘雪英，王庆伟，赵越平，蒋永培.中成药，2001，23(1):43-45;墨旱莲乙酸乙酯总提物对T淋巴细胞功能的调节.刘雪英，赵越平，蒋永培，汤海峰.第四军医大学学报，2001，22(8):754-756)。还有研究表明，墨旱莲水煎剂能够对抗环磷酰胺所造成的免疫损伤，抑制胸腺细胞凋亡(墨旱莲对小鼠胸腺细胞凋亡的调节作用.景辉，白秀珍，杨学东，郭云才，李键.数理医药学杂志，2005，18(4):318-320)。此外，国内外多篇文献报道墨旱莲具有较强的肝保护作用。B叩inderSingh等人通过研究墨旱莲的石油醚、苯、丙酮和50%乙醇提取物对四氯化碳毒性的肝保护作用，发现其中以50%乙醇提取物的肝保护作用最显著(墨旱莲的肝保护作用.B叩inderSingh,等.国外医学中医中药分册，1991，13(6):29)。李春洋等人研究表明，墨旱莲的乙酸乙酯提取物对醋氨酚诱发的急性肝损伤有较好的保护作用，能明显抑制肝损伤小鼠sALT、sAST的升高(墨旱莲提取物对肝保护作用的影响.李春洋，白秀珍，杨学东.数理医药学杂志，2004，17(3):249-250)。有文献报道认为，中药墨旱莲主要起肝保护作用的化学成分是香豆草醚类化合物蟛蜞菊内酯和去甲蟛蜞菊内酯，这两种成分在CCl,、D-氨基半乳糖和毒伞素诱导的肝损伤模型中均显示较强的肝保护作用(CoumestansasthemainactiveprinciplesoftheliverdrugsEliptaalbaandwedeliacalendulaced.WagerH,GeyerB，Kisoy，etal,PlantaMed，1986，5:374)。至于其肝保护作用的机制，有学者认为是通过保护细胞溶酶体膜的稳定性、调节微粒体的药物代谢酶的功能实现的(H印atoprotectiveeffectsofEcliptaalbaonsubcellularlevelsinrats.A.K.Saxena,B.Singh,etal.JournalofEth,ha醒cology，1993,40:155-156)。目前在研究墨旱莲肝保护作用的文献当中，大部分研究者使用CC14、D-氨基半乳糖和醋氨酚诱发的肝损伤模型，它们致肝损伤的机理如下CCh通过肝内的CYP2E1代谢生成氧化活性中间产物(R0I)，从而造成生物膜结构的破坏和功能损伤，主要表现为肝小叶中央区肝细胞坏死、脂肪变性、反应性增生等脂质过氧化反应；D-氨基半乳糖可掺入正常己糖分子干扰膜结构的形成和功能，从而诱导肝细胞坏死，此外，其还可使肝细胞TNF-cimRNA的表达水平上调，增强肝细胞对促炎因子的敏感性；醋氨酚经体内P450代谢可生成活性代谢产物(NAPQI)，它与肝细胞内大分子发生共价结合形成加合物，从而诱发氧应激反应，造成肝脏过氧化损伤。以上所述的肝损伤模型中，大部分通过诱发氧应激反应，造成急性肝损伤。自身免疫性肝病，是指由于机体的免疫系统攻击自身的肝组织所造成的一组疾病，其病因及发病机制目前尚不完全清楚。临床常见的自身免疫性肝病包括自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎。自身免疫性肝炎(AutoimmuneH印atitis，AIH)是一种累及肝脏实质的特发性疾病。AIH无可确定病因的形态学特征，但以界面性肝炎(interfacehepatitis)并且无其它肝病时典型的改变为特征。临床上，AIH以波动性黄疸、高Y-球蛋白血症、循环中存在自身抗体、女性易患等为特点。该病一般对糖皮质激素治疗应答良好。这些特征提示AIH具有异常自身免疫的发病基础。原发性胆汁性肝硬化(PrimaryBiliaryCirrhosis,PBC)是一种自身免疫性肝脏疾病，主要影响中年妇女。主要表现为小叶间胆管(interlobualrbileduct)慢性非化脓性炎症和肉芽肿性破坏，并导致进行性胆管消失。其后的胆汁郁积一般缓慢进展、进而发生纤维化、肝硬化最终肝功能衰竭。目前，PBC一般在患者尚无症状、进行常规检査时发现肝脏生化检查异常和/或血清抗线粒体抗体(AMA)阳性时作出诊断。原发性硬化性胆管炎(PrimarySclerosingCholangitis,PSC)是以肝内和肝外胆管进行性炎症、阻塞和纤维化为特征的慢性进行性肝脏疾病。胆管广泛狭窄，间隔以正常或扩张的段，从而产生了胆管造影术中的特征性串珠症。大量研究表明，肝脏组织内浸润的T-淋巴细胞在自身免疫性肝病的发病机制中发挥重要作用。当肝细胞膜的某一种成分被抗原递呈细胞(APC)或被伴有HLAII类分子的肝细胞直接递呈给辅助性T-细胞(TH1，TH2)而抑制性T细胞(Ts)的抑制作用减弱或缺乏时，活化的辅助性T-细胞将产生多种细胞因子(IL-2，TNF-a,IFN-Y)，诱发多种机制导致肝脏损伤。①刺激细胞毒性T-淋巴细胞与HLAI类分子结合的自身抗原反应；②通过IFN-y活化巨噬细胞；③B-细胞转变为浆细胞，产生自身抗体，或通过杀伤性细胞和补体产生抗体介导性细胞破坏作用。病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的，以肝脏炎症和坏死病变为主的一组常见传染病。临床上以乏力、食欲减退、肝区疼痛、肝肿大、肝功能异常为主要表现，部分病例出现黄疸和发热，常见无症状感染。主要通过粪一口传播、血液或体液传播。常见的肝炎病毒有甲、乙、丙、丁、戊五种，另外还有输血传播病毒(TTV)。其中甲型和戊型肝炎多表现为急性肝炎，乙、丙、丁型主要表现为慢性肝炎并可发展为肝硬化和肝癌。病毒性肝炎的发病机理为，肝炎病毒通过消化道、输血等传播途径进入血液和肝脏，从而激活体液和细胞免疫(主要为T细胞介导的细胞免疫)，这些免疫产物进一步攻击被病毒感染的肝细胞，引起肝细胞变性、坏死、增生以及单核或淋巴细胞渗出等一系列病理性的改变。在慢性病毒性肝炎的发病过程中，病毒持续在肝细胞内复制，使肝细胞不断地受到免疫损伤，且由于肝细胞代谢失常所致肝内形成的免疫调节因子发生质与量的改变，从而导致免疫调节功能紊乱，T-B淋巴细胞之间及T细胞各亚群之间的协调功能失常，自身抗体产生增多，通过抗体依赖的细胞毒效应或抗体介导补体依赖的细胞溶解作用，造成自身免疫性肝损伤；或由于大量抗原-抗体复合物的形成，从而造成肝脏或其他组织器官更加严重而持续的损害。综上所述，由于自身免疫性肝病、病毒性肝炎所致的肝损伤，均与T淋巴细胞的活化密切相关，但是，到目前为止，还没有治疗自身免疫性肝病和病毒性肝炎的有效方法。因此，本领域迫切需要提供一种能有效治疗自身免疫性肝病和病毒性肝炎的方法。
发明内容本发明旨在提供一种治疗自身免疫性肝病和病毒性肝炎的新物质。在本发明的第一方面，提供了一种式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯的提取物的用途，Ri0-R4I式中，R,代表氢原子、羟基、甲氧基；R2代表氢原子、羟基、d-C8垸基；R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基；所述的用途是被用于制备治疗自身免疫性肝病或病毒性肝炎的药物。在另一优选例中，所述药物还用于抑制T-淋巴细胞增殖。在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐或酯是式I化合物与选自下组的酸所形成的盐或酯氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸。在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐是式I化合物与选自下组的碱金属或碱土金属所形成的盐钠、钾、钙、镁等。在另一优选例中，所述的自身免疫性肝病选自下组自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎；所述的病毒性肝炎选自下组(按病原学分类)甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎。在另一优选例中，所述的式I化合物或所述的提取物是从菊科植物中提取的。在另一优选例中，所述的菊科植物选自鳢肠(EcliptaprostrataLinn)、蟛蜞菊(Wedeliachinensis)，或其组合。在本发明的第二方面，提供了一种式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯的提取物的用途，"^^"R4式中，R,代表氢原子、羟基、甲氧基；R2代表氢原子、羟基、d-(V烷基；R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基；所述的用途是用于制备免疫调节剂。在另一优选例中，所述调节剂还用于抑制T-淋巴细胞增殖。在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐或酯是式I化合物与选自下组的酸所形成的盐或酯氢氯酸、氢溴酸、硫酸、拧檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸。在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐是式I化合物与选自下组的碱金属或碱土金属所形成的盐钠、钾、钙、镁等。在另一优选例中，所述的式I化合物或所述的提取物是从菊科植物中提取的。在另一优选例中，所述的菊科植物选自鳢肠(EcliptaprostrataLinn)、蟛蜞菊(Wedeliachinensis)、旱莲草(Ecliptaalba)，或其组合。在另一优选例中，所述调节剂还用于治疗自身免疫性肝病或病毒性肝炎。在另一优选例中，所述的式I化合物是具有式II的蟛蜞菊内酯在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有(a)含有作为主要活性成分的0.05_90讨％的式I化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯的提取物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>式中，R,代表氢原子、羟基、甲氧基；R2代表氢原子、羟基、d-CV烷基；R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基；(b)选自下组的一种或多种辅助活性成分抗病毒药物；免疫抑制剂；抗肝纤维化药物；护肝药物；和(c)药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐或酯是式I化合物与选自下组的酸所形成的盐或酯氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸。在另一优选例中，所述的药学上可接受的盐是式I化合物与选自下组的碱金属或碱土金属所形成的盐钠、钾、钙、镁等。在另一优选例中，所述的式I化合物或所述的提取物是从菊科植物中提取的。在另一优选例中，所述的菊科植物选自鳢肠(EcliptaprostrataLinn)、蟛蜞菊(Wedeliachi腦sis)、旱莲草(Ecliptaalba)，或其组合。在另一优选例中，所述的抗病毒药物选自下组的一种或多种利巴韦林、单磷酸阿糖腺苷、拉米夫定、阿昔洛韦、泛昔洛韦、胸腺肽；所述的免疫抑制剂选自下组的一种或多种强的松、甲基强的松龙、雷公藤、硫唑嘌呤、环孢素、他克莫司(FK506)、雷帕霉素、霉酚酸脂、咪唑立宾；所述的抗肝纤维化药物选自下组的一种或多种维甲酸、S-腺苷甲硫氨酸、秋水仙碱、己酮可可碱；所述的护肝药物选自下组的一种或多种硫普罗宁、葡醛酸钠、还原型谷胱甘肽、甘草酸二胺、门冬氨酸鸟氨酸。在另一优选例中，所述的组合物选自注射剂、注射用无菌粉末、片剂、胶囊、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、栓剂。在另一优选例中，所述的式I化合物是通过包括以下步骤的提取方法获得的(a)用95±3%乙醇提取菊科植物的果实、叶或枝，得到乙醇浸膏；(b)取乙醇浸膏，用5-300倍(较佳地10-200倍，更佳地20-100倍)于浸膏体积的50-8(TC的水溶解，过滤去除杂质，回收水相；(C)用乙酸乙酯萃取步骤(b)的水相，回收乙酸乙酯相；(d)对步骤(C)的乙酸乙酯相进行干燥，得到沉淀物；(e)在硅胶柱上，用梯度为5:1至1:2的石油醚/丙酮洗脱剂进行洗脱步骤(c)的沉淀物，收集石油醚丙酮为l:l的洗脱组分；(f)对步骤(e)的洗脱组分进行浓縮，得浓縮物；(g)在硅胶柱上，用梯度为5:1至1:2的二氯甲烷/丙酮洗脱剂洗脱步骤(f)的浓縮物，收集二氯甲烷丙酮为3:1的洗脱组分；(h)在硅胶柱上，用梯度为20:10:1至5:10:1的甲苯-丙酮-甲酸洗脱剂洗脱步骤(g)的洗脱组分，收集甲苯丙酮甲酸为10:10:1的洗脱组分；(i)在硅胶柱上，用梯度为30:1至1:1的二氯甲烷/甲醇洗脱剂洗脱步骤(h)的洗脱组分，收集二氯甲垸甲醇为20:1的洗脱组分；(j)用乙醇进行重结晶，得到式I的香豆草醚类化合物沉淀。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>R3R4I式中，Rt代表氢原子、羟基、甲氧基；R2代表氢原子、羟基、d-C8烷基；R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基。据此，本发明提供了一种能有效治疗自身免疫性肝病和病毒性肝炎的方法。具体实施方式发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现一种式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含有该化合物的植物提取物在免疫调节方面通过抑制T-淋巴细胞的增殖发挥作用，因而可有效地治疗自身免疫性肝病和病毒性肝炎，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>式中，R,代表氢原子、羟基、甲氧基；R2代表氢原子、d-8烷基；R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基。在此基础上完成了本发明。所述的烷基是指具有18个碳原子的直链或支链的垸基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。优选具有14个碳原子的直链或支链的垸基。最优选甲基。如本文所用，术语"组合物"包括(a)治疗自身免疫性肝病或病毒性肝炎的组合物，(b)调节免疫、抑制T-淋巴细胞增殖的组合物。式I化合物可由植物中提取或化学合成、半合成、生物转化的方式获得，例如从菊科植物鳢肠"ch7faprostrafa丄i/m)、蟛蜞菊(^ec/eh'ac/i/3e/2Ws)等植物中提取。该化合物在菊科植物中的提取部位为植物的枝、叶或果实部位，尤其是叶部位。本发明的化合物可以以药学或生理学上可接受的盐或酯的形式使用。这些盐或酯包括(但不限于)与如下酸形成的盐或酯氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、羟^磺酸。卤化物的盐同样适用。其他盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以其他常规的"前体药物"形式存在的盐(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。含有式I化合物的提取物也可用于本发明。一种优选的提取方法如上所述。通常，在提取物中式I化合物的纯度按重量计应在40%_99.9%，更佳地为50-98%。用途本发明的香豆草醚类化合物或含有该化合物的提取物可用于治疗自身免疫性肝病。代表性的例子包括(但并不限于)自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎。本发明的香豆草醚类化合物或含有该化合物的提取物还可用于治疗病毒性肝炎。代表性的例子包括(按病原学分类)甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎。本发明的香豆草醚类化合物或含有该化合物的提取物还可用作免疫调节剂。本发明的香豆草醚类化合物或含有该化合物的提取物还可用于抑制T-淋巴细胞的增殖。所用的活性成分的有效剂量可随给药模式和待治疗疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约0.5-500mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为1-100mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体混合的约0.5-500mg的活性化合物。可调节此治疗方案以达到最佳治疗效果。例如，可根据治疗状况的需要，每天若干次分开给药，或将剂量按比例减少。通常，成人口服临床剂量的范围为l-1000mg/日，优选为10-200mg/日，成人非口服的剂量为0.1-100mg/日，优选l-100mg/日。在使用本发明化合物或含有该化合物的提取物治疗自身免疫性肝病或病毒性肝炎时，还可与其他治疗剂联用。例如与选自下组的一种或多种辅助活性成分联用抗病毒药物利巴韦林、单磷酸阿糖腺苷、拉米夫定、阿昔洛韦、泛昔洛韦、胸腺肽；免疫抑制剂强的松、甲基强的松龙、雷公藤、硫唑嘌呤、环孢素、他克莫司(FK506)、雷帕霉素、霉酚酸脂、咪唑立宾；抗肝纤维化药物维甲酸、S-腺苷甲硫氨酸、秋水仙碱、己酮可可碱；护肝药物硫普罗宁、葡醛酸钠、还原型谷胱甘肽、甘草酸二胺、门冬氨酸鸟氨酸。在使用本发明化合物或含有该化合物的提取物作为免疫调节剂或T-淋巴细胞活性抑制剂时，还可与其他治疗剂联用。例如(但不限于)和选自下组的一种或多种免疫抑制剂联用强的松、甲基强的松龙、雷公藤、硫唑嘌呤、环孢素、他克莫司(FK506)、雷帕霉素、霉酚酸脂、咪唑立宾。本发明还包括治疗自身免疫性肝病和病毒性肝炎的方法，它包括给哺乳动物施用药物有效量的本发明化合物。本发明还包括调节免疫、抑制T-淋巴细胞增殖的方法，它包括给哺乳动物施用药物有效量的本发明化合物。通常，当本发明化合物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合制成不同给药途径的药物剂型，如注射剂、注射用无菌粉末、片剂、胶囊、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、栓剂等。上述剂型中可经口服给药的剂型为片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、醑剂。固态载体包括淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖、白陶土、微粉硅胶、滑石粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮。而液态载体包括无菌水、乙醇、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制备药物组合物的过程中通常使用的佐剂包括调味剂、着色剂、防腐剂(如羟苯垸基丁酯、苯甲酸钠、山梨酸)和抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯)。上述剂型中可用于注射途径给药的剂型包括注射剂、注射用无菌粉末，它们是将药物与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合制成以供注射给药的形式。溶剂包括无菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，还需加入抑菌剂(如苯甲醇、羟苯丁酯、硫柳汞)、等渗调节剂(如氯化钠、葡萄糖)、助悬剂(如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素)、增溶剂(吐温-80、卵磷酯)、抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠)和填充剂(如乳糖、甘露醇)。上述剂型中可经胃肠道外途径给药的有气雾剂、粉雾剂、栓剂。粉雾剂中适合的载体实例包括乳糖、葡聚糖、阿拉伯胶、甘露、葡萄糖和十二垸基硫酸钠。气雾剂中适合的溶剂为无菌水、乙醇、植物油、油酸。适合的抛射剂为三氯一氟甲烷、二氯二氟甲垸、丙垸、异丁烷、二氧化碳、氮气。栓剂的制备可将药物与一种适合的无刺激性赋形剂混合而成，赋形剂包括可可脂、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000、羟苯乙酯、甘油。从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。优选口服给药。本发明的主要优点在于1、香豆草醚类化合物具有明显的治疗自身免疫性肝病和病毒性肝炎的功效。2、香豆草醚类化合物具有调节免疫的功效。3、香豆草醚类化合物具有抑制T-淋巴细胞增殖的功效。4、所述的香豆草醚类化合物是从天然植物中获得的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例l旱莲草(fch》t3a"a)中提取化合物蟛蜞菊内酯(1)浸泡及过滤旱莲草全草300kg，完全浸入0.75吨乙醇(浓度95%)中一浸泡过夜(IO小时)一粗滤，从而除去全草残渣(保留)一净滤(抽滤)或高速离心(10000rpm，10分钟)，从而除去灰尘及细渣一绿色澄清滤液。(2)乙醇回收蒸馏回收乙醇，温度不超过60。C—每次回馏2小时，将反应釜中的浸膏移出至收集桶中(浸膏呈深墨绿色，略粘稠状)一重复上述步骤，直至回收全部乙醇。(3)二次浸泡及回馏回收乙醇0.75吨，重新浸泡全草残渣一浸泡过夜，粗滤、净滤及蒸馏回收要求同前。得到浸膏。(4)乙酸乙酯萃取取上述浸膏50-80。C(更佳地60-7(TC)加热水振荡混匀，热水加量为浸膏体积的50倍，抽滤得到热水相液。按照水相酯相体积比为l:l的比例加入萃取用的乙酸乙酯，充分混匀震荡后，静置，待水相/酯相分层。移出乙酸乙酯层，5(TC真空减压蒸馏至干燥，加入少量乙醇溶解，置于烧杯中于4。C保存过夜，底部出现沉淀。减压抽滤获得沉淀，5(TC烘箱干燥，得到粗品。(5)产品的分离精制取粗品5g，拌样于10g200300目硅胶，进行硅胶柱层析(200g，200—300目)，用石油醚-丙酮梯度洗脱，每100mL收集一次，分别得到不同极性部位，合并(TLC石油醚-丙酮1:1，Rf=1/3)的斑点。将合并的组份浓缩后，再拌样于硅胶进行柱层析，用二氯甲垸-丙酮梯度洗脱，每50mL收集一次，分别得到不同极性部位，合并(TLC二氯甲烷-丙酮3:l，Rf^/6)的斑点。将合并的组份浓缩后，再拌样于硅胶进行柱层析，用甲苯-丙酮-甲酸梯度洗脱，每50mL收集一次，分别得到不同极性部位，合并(TLC甲苯-丙酮-甲酸10:10:l，Rf=l/2)的斑点。将合并的组份浓縮后，再拌样于硅胶进行柱层析，用二氯甲垸-甲醇梯度洗脱，每25mL收集一次，分别得到不同极性部位，合并(TLC二氯甲垸-甲醇20:l，Rf^l/6)的斑点。得到纯度〉90%的产品，收率约1%。(6)标准品精制将纯度〉90%的样品30mg溶于70%甲醇中，用Lichropr印RP-18(4063n)柱进行反相洗脱，用TLC检测，收集70%洗脱下来的样品，合并得到纯度〉98%的标准品。收率约90%。标准品的性状、分子式、熔点和IR，EIMS，'HNMR，13CNMR峰的归属如下灰白色粉末，分子式C16H1()07，mp315。C(分解)，UV入max(MeOH,nm):211.5(4.65)，247(4.40)，304(4.01)(sh)，350(4.48)。IR(KBr)cm—13300,1715,1640，1620，1445，1415，1320，1205,1155，1070。EIMS/h/z(%):314(M+100)，313(22)，299([M-CH3]，28)，285(5)，271([M-CH3-CO]，8)，243([M-CH3-CO-CO],28),187(17)，69(42)。'HNMR(5):7,23(s),7.14(s),6.58(d，J二2.3Hz)，6.42(d,J=2.3Hz),3.90(s)"CNMR(S):158.0(C-1)，101.1(C-2)，159.6(C-3)，95.6(C-4),99.3(C-5)161.1(C-6)，95.0(C-7)，155.5(C-8)，155.0(C-9),104.7(C_10)，145.2(C—11)，144.3(C-12)'99.0(C-13)，114.0(C—14)，148.7(C-15),55.7(C-16)。结果表明，获得的化合物是具有式II的蟛蜞菊内酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>通过上述方法提取得到的蟛蜞菊内酯(以下称AP-1)，用于以下各实施例中。实施例2实验方法1.脱脊椎处死小鼠(雄性SPF级KM小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，无菌条件下取其脾脏。将脾脏用毛玻璃片磨碎，过膜，300g离心5分钟，弃上清。沉淀加入lml红细胞裂解液，混匀，静置1分钟，加入PBS溶液，离心。将细胞洗涤1-2次后，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基调整细胞浓度至4X107ml;2.将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100ul，放置细胞培养箱(37°C，5%C02)中培养24h后，用药组每孔加入细胞培养基稀释的AP-150P1(终浓度分别为5uM，10nM，25PM，50wM,100uM)禾卩50u1的ConA(终浓度为5ug/ml);阳性组每孔加入50n1的ConA(终浓度为5ng/ml)和50yl的细胞培养基；阴性组加入100ul的细胞培养基，每组均设3个复孔；3.将细胞置于培养箱中培养40h后，每孔加入25ul(0.5uCi/well)3H-胸腺嘧啶核苷酸；4.培养8h后，将培养板冻存于-2(TC冰箱。测定时用细胞收集仪将细胞收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于Beta计数仪(Matrix96,PACKARD)上读取掺入细胞DNA的3H-胸腺嘧啶核苷酸，以CPM值代表细胞增殖的情况。实验结果见表2。表2AP-l对ConA诱导T淋巴细胞增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*表示/7<0.01，与阳性组相比，有显著性差异；a表示；7〈0.01，与阴性组相比，有显著性差异。淋巴细胞增殖是免疫系统应答抗原刺激的一个重要功能性反应。以有丝分裂原(ConA)为基础建立淋巴细胞增殖模型，可用于检测药物对免疫系统的作用。结果表明，未加ConA的阴性组CPM值较小，加入ConA显著刺激细胞增殖，CPM值显著提高(阳性组246138土2064，p<0.01)，为AP-1的药效学研究提供可靠的实验平台。结果表明，5个浓度计量组都对T淋巴细胞的增殖有抑制作用，且AP-1在浓度大于10uM时对T淋巴细胞的增殖有显著的抑制作用，呈现明显的浓度依赖性。因此，对有丝分裂原ConA诱导的T淋巴细胞增殖作用，AP-l呈现浓度依赖性的抑制作用。实施例3蟛蜞菊内酯对ConA诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用1992年，Tiegs等成功地应用刀豆蛋白A(ConA)诱发了小鼠特异性肝损伤，近年来其逐渐发展成为研究免疫细胞介导的肝损害的主要实验模型。刀豆蛋白(Concanavalin，ConA是植物凝集素，具有促有丝分裂作用，作为有丝分裂原剌激T淋巴细胞表达多种细胞因子TNF-ci、IFN-y、IL-2介导肝损伤，ConA诱导T淋巴细胞依赖性肝损伤病理与人类自身免疫性肝病、急慢性病毒性肝炎相似，并能被免疫抑制剂所缓解。给予ConA后8小时，即见血浆ALT、AST、LDH明显升高，肝内大量T淋巴细胞浸润，部分汇管区淋巴细胞浸润呈"套袖"样改变，大量肝细胞核破裂、出现凋亡小体和脂肪变性等。这些均证明，T淋巴细胞与本模型发病机制密切相关。而自身免疫性肝病、病毒性肝炎等所致的肝损害，均与免疫细胞的活化密切相关。实验动物雄性SPF级KM小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(许可证号:SCXK(沪)2003-2003;质量合格证编号0023816)，体重为18-22g，SPF级动物房饲养，12h光照/12h黑暗，自由摄取饲料和水。实验方法1.造模方法小鼠尾静脉注射剂量为20mg/kg的ConA;2.给药情况小鼠禁食不禁水13小时后，将其分别随机分为3组(每组IO只)(l)正常组，(2)模型组，(1)(2)组小鼠给予体积为0.lml/10g的蒸馏水；(3)阳性药物组，小鼠给予剂量为4.5mg/kg的地塞米松；(4)AP-1组，小鼠给予剂量为10mg/kg的AP-1。分别于造模前5小时、1小时腹腔注射给药。本实验通过ConA造模前提前两次给药(分别为5小时和1小时)，从而使药物在血液中的浓度明显升高，达到治疗有效量。造模8小时后摘眼球取血，4。C静置30分钟，3500rpm离心8分钟。取血清，用赖氏法通过A^间接测定血清中的ALT含量。计算抑制率抑制率=(模型组A492—实验组A492)/模型组A492X100%。计算每组平均值，用SPSS统计软件进行one-way方差分析，以及进行两两组间比较。实验结果见表3。表3蟛蜞菊内酯对ConA诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用(Mean士SD，n=10)组别性别数量(只)平均体重(g)吸光度A492(X±SD)抑制率(％)正常组雄1019.250.009±0.001—模型组雄1018.700.108±0.018A-阳性药物组雄1018.610.014±0.004*86.88AP-1组雄1018.580.024±0.013*78.25*表示/<0.01，与模型组相比，有显著性差异；a表示；K0.01，与正常组相比，有显著性差异结果表明，模型组小鼠血清中ALT含量(0.108±0.018)与正常组(0.009±0.001)相比具有显著差异，表明造模成功。(3)、(4)组小鼠血清中ALT含量明显低于模型组，差异有显著性，抑制率分别为78.25%和86.88%。而(3)(4)组之间比较，无显著差异。结果表明，蟛蜞菊内酯对免疫性肝病具有预防性的保护作用。实施例4蟛蜞菊内酯对DHBV感染鸭的治疗作用实验动物市售l日龄北京鸭，体重为60-70克，自由摄取词料和水。实验方法1.造模方法孵出24小时之内的北京鸭，经足静脉注射DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.2ml，7天后取血，分离血清，-2(TC保存待检。2.给药情况经ELISA法筛选DHBsAg阳性鸭30只，随机分为3组，每组IO只。(1)空白对照组，以生理盐水代替药物作为空白对照；(2)阳性药物组，以无环鸟苷(ACV)按100mg/kg灌胃，2次/天，给药2周；(3)AP-1组，给药剂量为150mg/kg，灌胃，2次/天，给药2周。分别于用药第7天(T7)、第14天(T14)、停药后第3天(P3)自鸭腿胫静脉取血，分离血清，-20。C保存待检。测定血清中的ALT含量，采用DHBV-DNADotBlot法，以杂交斑点吸光度值(A)作为标本DHBV-DNA水平值。计算每组平均值，用SPSS统计软件进行one-way方差分析，以及进行两两组间比较。实验结果见表4、5。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*表示/〈0.01，与空白对照组相比，有显著性差异表4的结果表明，在AP-l组中，DHBV的滴度在给药后第7天和第14天，与空白对照组相比具有显著性差异(p<0.01)，且停药后无反弹。ACV对DHBV有明显抑制作用，但停药后又显著升高，与给药前相比差异无显著性(pX).05)。表5的结果表明，(2)、(3)组小鼠血清中ALT含量明显低于空白对照组，差异有显著性(p<0.01);而(2)、(3)组之间比较，无显著差异。结果表明，蟛蜞菊内酯对病毒性肝炎具有治疗作用。实施例5制备片剂利用常规技术，混合以下组分，然后直接压片，制备片剂形式的药物组合物，其配方如下<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例6制备注射剂<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>①将亚硫酸氢钠加于500ml注射用水中，加入羧甲基纤维素钠，混匀，浸泡过夜(24小时)，全溶后，用210目尼龙布过滤；②将溶液①水浴加热，加入吐温-80，混匀；③至水浴沸腾，加入蟛蜞菊内酯，混匀，继续加热30分钟，取出冷却至室温，G.,垂熔玻璃漏斗过滤；④加注射用水至1000ml，混匀，灌封，用10(TC30分钟灭菌。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯的提取物的用途，id="icf0001"file="A2007100364580002C1.gif"wi="66"he="37"top="49"left="33"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>式中，R1代表氢原子、羟基、甲氧基；R2代表氢原子、羟基、C1-C8烷基；R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基；其特征在于，被用于制备治疗自身免疫性肝病或病毒性肝炎的药物。2.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述药物还用于抑制T-淋巴细胞增殖。3.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的自身免疫性肝病选自下组自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎；所述的病毒性肝炎选自下组甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎。4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的式I化合物或所述的提取物是从菊科植物中提取的。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的菊科植物选自鳢肠(EcliptaprostrataLirm)、蟛蜞菊(Wedeliachinensis)，或其组合。6.—种式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯的提取物的用途，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式中，R,代表氢原子、羟基、甲氧基；R2代表氢原子、羟基、(VCs烷基；R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基；其特征在于，用于制备免疫调节剂。7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述调节剂还用于抑制T-淋巴细胞增殖。8.如权利要求6—7任一所述的用途，其特征在于，所述调节剂还用于治疗自身免疫性肝病或病毒性肝炎。9.如权利要求1或6所述的用途，其特征在于，所述的式I化合物是具有式II的蟛蜞菊内酯<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>10.—种药物组合物，其特征在于，它含有(a)含有作为主要活性成分的0.05-90wtX的式I化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含式I的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯的提取物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式中，Ri代表氢原子、羟基、甲氧基；R2代表氢原子、羟基、C「(V烷基；R3和R4各自独立地选自氢原子、卤素原子、羟基、甲氧基；(b)选自下组的一种或多种辅助活性成分抗病毒药物；免疫抑制剂；抗肝纤维化药物；护肝药物；和(c)药学上可接受的载体。全文摘要本发明公开了一种从菊科植物中提取的香豆草醚类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或者含有该类化合物的植物提取物在制备治疗自身免疫性肝病、病毒性肝炎药物方面的应用。体外和动物体内实验证明，这种从菊科植物中提取的香豆草醚类化合物可有效治疗和改善自身免疫性肝病、病毒性肝炎的症状。文档编号C07D493/04GK101225087SQ200710036458公开日2008年7月23日申请日期2007年1月15日优先权日2007年1月15日发明者强俞申请人:上海安普生物科技有限公司