一类氮杂冠醚配合物作为核酸切割试剂的应用的制作方法

专利名称：：一类氮杂冠醚配合物作为核酸切割试剂的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物化学和分子生物学
技术领域：
，具体涉及一类氮杂冠醚配合物作为核酸切割试剂的应用。技术背景人工核酸切割试剂尤其是定点切割试剂在生物化学和分子生物学领域中有着重要的应用价值，20多年来有关的研究一直非常活跃。天然的核酸限制性内切酶所能识别的碱基序列非常短，只有4-8个碱基对，所以当一条较长的核酸链被限制性内切酶切断时，将产生非常多的碎片，这些碎片很难被进一步利用，因此寻找新型的核酸切割试剂显得尤为重要。合成核酸酶是化学生物学发展迅速的一个具有挑战性的新领域。大环多胺由于环中引入的氮原子对过渡金属离子、重金属离子具有特殊的配位亲和性，所形成的大环配合物除了在主客体化学、分子识别和信息传输中具有重要意义外，还可以用作水解酶的模拟物来研究水解金属酶的动力学及机理，为研究生命活动过程提供了广泛的可能性(KimumE,AokiS,KoikeT,etal.J.Am.Chem.Soc.1997,119:3068)。研究人员对大环多胺配合物与核酸的相互作用进行了深入的研究，而且有些大环多胺配合物表现了良好的核酸切割活性(De-YuanKong，Yu-YuanXie.Polyhedron.2000,19:1527—1537,Xiao隱YanWang,JiZhang,KunLi,etal.Bioorganic&MedicinalChemistry,2006,14:6745—6751,Qing-XiangXiang,JiZhang,Pei-YanLiu，etal.JournalofInorganicBiochemistry,2005,99:1661—1669，18.Yu-GuoFang,JiZhang,Shan-YongChen,etal.Bioorganic&MedicinalChemistry,2007,15:696~701,EmikoKikuta,ShinAoki,EiichiKimura.J.Am.Chem.Soc.2001,123:7911-7912,M.C.B.Oliveira,M.S.R.Couto,P.C.Severino,etal.Polyhedron,2005,24:495499,DillipKumarChand，Hans-JorgSchneider,JuanA.Aguilaretal.InorganicaChimicaActa,2000,316:71—78)。氮杂冠醚配合物与大环多胺配合物的结构类似，但从已有的研究资料的来看，氮杂冠醚配合物对核酸的切割效果没有大环多胺的好(ThorstenBerg，AntonSimeonov,KimD.Janda.J.Comb.Chem.，1999,1:96-100,47.AnneRoigk,OlgaV.Yescheulova,YuryV.Fedorov，etal.Organicletters,1999，1:833-835,RagunatnanKG,SchneiderHJ,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1996,35:1219-1221)，因此人们对它的研究也远没有大环多胺配合物的多。尽管如此，由于氮杂冠醚与生物体内存在的一些物质具有相似的结构，因此设计、合成及其生物活性的研究以及提高其分子亲核性、序列选择性和切割效率仍然具有重要意
发明内容本发明的目的在于提供一类氮杂冠醚配合物作为核酸切割试剂的应用，其中，所述氮杂冠醚配合物为氮杂冠醚与金属离子配位而成，氮杂冠醚为1，12-二氮杂-3，4，9，10-二苯并-5，8-二氮杂环十五垸-N，N，-二乙酸，分子式为C2306N2H28，结构如下所述金属离子可以为Q+、Ni2+、Co"或Z^+等中任一种。核酸是重要的生命遗传物质，对核酸的特定位点断裂和损伤修复是分子生物学和生物工程首先要解决的问题之一。随着癌症发病率的升高，寻找高效、特异选择性、对人体副作用小的抗癌药物显得尤为紧迫。本发明将一类氮杂冠醚配合物用作"分子剪刀"在接近生理pH条件下切割核酸。实验结果表明几种氮杂冠醚配合物能在接近生理pH条件下低浓度、短时间内有效地切割线型和超螺旋的DNA。在11202存在时，氮杂冠醚铜和钴配合物的浓度为30uM、IO分钟内就对线型DNA表现出明显的切割作用，也可以将超螺旋质粒DNA部分切割成缺刻型DNA;浓度为100uM、10分钟内就可以将30kb的线型DNA切割成小于3000bp的DNA，超螺旋质粒DNA完全切割成线型DNA。无&02存在时，氮杂冠醚铜、钴、镍、锌配合物浓度为200pM、24小时内也可以将超螺旋DNA切割成缺刻型和线型DNA。在实验中还发现当条件改变时，这几种配合物切割DNA可能存在两种机理，一种是水解机理，一种是自由基机理。选择条件使配合物以自由基机理切割核酸，由于自由基的体积很小且易于扩散，因而可以作为性能良好的足迹试剂来水解与蛋白质结合在一起的核酸、充当化学探针研究核酸的高级结构；如果使配合物以水解机理切割核酸，由于水解断裂的核酸可以通过连接酶再连接因此可以获得生物体内的一些信息，提供生物体内核酸酶的作用机制，在用作抗肿瘤药物时也可以减小对人体的毒副作用。本发明为进一步合成DNA定点识别及切割试剂的研究提供了良好的基础和有效的途径，具有重要的意义。图1为铜离子及氮杂冠醚铜配合物在H202存在时切割线性CTDNA的琼脂糖凝胶电泳图。图2为铜、镍、钴、锌的氮杂冠醚配合物切割质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图。图3为铜、镍、钴、锌的氮杂冠醚配合物在11202存在时切割质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式下面通过实施例进一步说明本发明。实施例1:氮杂冠醚配合物对DNA进行裂解实验，裂解实验采用琼脂糖凝胶电泳方法。1、仪器<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>硼酸AR国药集团甘油AR上海化学试剂有限公司浓盐酸AR上海化学试剂有限公司3、试剂的配制采用灭菌三重蒸馏水配制缓冲溶液。Tris缓冲溶液的配制取50mMTris和18mMNaCl的缓冲液，用1M盐酸调至pH为7.2，用于电泳中所有药品的配制。10XTBE电泳缓冲溶液的配制:108gTris，55gH3B03，9gEDTA溶解于IL蒸馏水中，得到10XTBE的缓冲液。使用时取出适量稀释10倍，使溶液终浓度为89mMTris，89mMH肌和2mMEDTA，即得到lxTBE电泳缓冲液。6XDNA上样缓冲液的配制0.0254g溴酚蓝，3mL甘油，加入灭菌蒸馏水配成10mL溶液，置于4'C冰箱中。使用时取出适量稀释6倍，即得到lxDNA上样缓冲液。染色剂将溴化乙锭(EB)溶于三重蒸馏水中，控制溴化乙锭的最终浓度为0.51.0ug/L，避光保存。4、操作步骤琼脂糖凝胶电泳实验步骤如下(1)将琼脂糖加入到锥形瓶中，再加入lxTBE电泳缓冲液，对于切割p服322DNA选用的琼脂糖浓度为0.8wt%，切割CTDNA的选用的琼脂糖的浓度为0.6wt%，将装有琼脂糖和lxTBE缓冲液的锥形瓶放在微波炉中加热使琼脂糖颗粒溶解，冷却至55-6(TC时，倒入带梳子的水平槽中，室温下放置30-40分钟，然后将水平槽放入电泳槽中；(2)加入lxTBE电泳缓冲液到水平电泳槽中，加入量以淹没胶面lmra以上即可，然后取出梳子，令样品孔自然充满缓冲液；(3)在EP管中加入电泳样品，然后将EP管放入恒温箱内，在37'C温度下，在有&02存在时作用9-ll分钟，无11202存在时作用9.5-10小时后，依样品量加入适量lxDNA上样缓冲液中止反应。(4)将混匀的样品用微量进样器加入到凝胶样品孔中并盖上电泳槽，在室温下采用4V/cm电压槽电泳，电压为55—65V，使DNA向阳极移动，观察溴酚蓝显示的电泳情况，当样品到达阳极时中止电泳；(5)取出凝胶，在染色剂中浸泡染色30分钟，水中脱色10分钟后，在凝胶成像仪中观察并拍摄下电泳结果图片；(6)实验结果以超螺旋DNA(FormI)转化为缺刻型DNA(FormII)和线型DNA(FormIII)表示。图1中，lanel为单独的DNA的实验结果图，lane2为氮杂冠醚在H202存在时裂解DNA的实验结果图，lane3、lane5、lane7为C^+在H202存在时裂解DNA的实验结果图，其浓度分别为35uM、54uM、70wM，lane4、lane6、1&加8为氮杂冠醚铜配合物在11202存在时裂解DNA的实验结果图，其浓度分别为35uM、54uM、70uM。从图中可知，氮杂冠醚铜配合物比单独的氮杂冠醚或012+的切割效果好许多。实验中选用的CTDNA的长度为30kb，CTDNA浓度为200uM，溴酚蓝在O.6y。的琼脂糖中迁移的速度与长度为3000bp的线性DNA迁移速度相当。从图中lane8可以看到当铜配合物的浓度为70uM时，37'C保温10分钟就可以将CTDNA切割成了长度小于3000bp的DNA。图2中，lanel是单独的DNA的实验结果图，lane2是DNA在^02存在时的实验结果图，lane3，lane4，lane5，lane6分别是50uM氮杂冠醚铜、钴、镍、锌配合物在HA存在时切割质粒pBR322DNA(浓度为0.0167ug/uL)的实验结果图。实验结果显示四种配合物在低浓度(50uM)、与DNA作用较短的时间(15分钟)的情况下就可以将环状DNA(FormI)完全切割成缺刻型DNA(FormII)，氮杂冠醚钴配合物甚至还可以将部分缺刻型DNA切割成线性DNA(FormIII)。图3中，lanel、5是浓度分别为100uM、200yM的氮杂冠醚铜配合物切割质粒pBR322DNA(0.0167ug/yL)的实验结果图，lane2、6是浓度分别为100uM、200uM氮杂冠醚钴配合物切割pBR322DNA(0.0167ug/uL)的实验结果图，lane3、7是浓度分别为lOOuM、200uM的氮杂冠醚镍配合物切割pBR322DNA(0.0167ug/uL)的实验结果，lane4、8是浓度分别为100yM、200uM是氮杂冠醚锌配合物切割pBR322DNA(0.0167ug/uL)的实验结果。从实验结果我们可以看到，在无催化剂的情况下，这四种配合物和pBR322DNA作用10小时后仍然可以切割DNA，而且切割效果远强于文献报道的类似的氮杂冠醚配合物。权利要求1、一类氮杂冠醚配合物作为核酸切割试剂的应用，其特征在于所述氮杂冠醚配合物为氮杂冠醚与金属离子配位而成，氮杂冠醚为1，12-二氮杂-3，4，9，10-二苯并-5，8-二氮杂环十五烷-N，N’-二乙酸，分子式为C23O6N2H28，结构如下所述金属离子可以为Cu2+、Ni2+、Co2+或Zn2+中任一种。2、根据权利要求1所述的氮杂冠醚配合物作为核酸切割试剂的应用，其特征在于采用琼脂糖凝胶电泳法检测核酸切割试剂的切割结果，具体步骤如下(1)将琼脂糖加入到锥形瓶中，再加入lxTBE电泳缓冲液，对于切割pBR322DNA选用的琼脂糖浓度为0.8wt%，切割CTDNA的选用的琼脂糖的浓度为0.6wt%，将装有琼脂糖和lxTBE缓冲液的锥形瓶放在微波炉中加热使琼脂糖颗粒溶解，冷却至55-6(TC时，倒入带梳子的水平槽中，室温下放置30-40分钟，然后将水平槽放入电泳槽中；(2)加入lxTBE电泳缓冲液到水平电泳槽中，加入量以淹没胶面i以上即可，然后取出梳子，令样品孔自然充满缓冲液；(3)在EP管中加入电泳样品，然后将EP管放入恒温箱内，在37'C温度下，在有11202存在时作用9-ll分钟，无&02存在时作用9.5-10小时作用一段时间后，依样品量加入适量lxDNA上样缓冲液中止反应；(4)将混匀的样品用微量进样器加入到凝胶样品孔中并盖上电泳槽，在室温下采用4V/cm电压槽电泳，电压为55—65V，使DNA向阳极移动，观察溴酚蓝显示的电泳情况，当样品到达阳极时中止电泳；(5)取出凝胶，在染色剂中浸泡染色30分钟，水中脱色10分钟后，在凝胶成像仪中观察并拍摄下电泳结果图片；(6)实验结果以超螺旋DNA转化为缺刻型DNA和线型DNA表示；其中，所述Tris缓冲溶液的配制取50mMTris和18mMNaCl的缓冲液，用1M盐酸调至pH为7.2;所述10XTBE电泳缓冲溶液的配制108gTris，55gH3B03，9gEDTA溶解于1L蒸馏水中，得到IOXTBE的缓冲液。使用时取出适量稀释10倍，使溶液终浓度为89mMTris，>89mMH3B03fP2mMEDTA，即得到lxTBE电泳缓冲液；所述6XDNA上样缓冲液的配制0.0254g溴酚蓝，3mL甘油，加入灭菌蒸馏水配成10mL溶液，置于4'C冰箱中。使用时取出适量稀释6倍，即得到lxDNA上样缓冲液；所述染色剂将溴化乙锭溶于三重蒸馏水中，控制溴化乙锭的最终浓度为0.51.0ug/L，避光保存。全文摘要本发明属于生物化学和分子生物学
技术领域：
，具体涉及一类氮杂冠醚配合物作为核酸切割试剂的应用。所述氮杂冠醚配合物为氮杂冠醚与金属离子配位而成，氮杂冠醚为1，12-二氮杂-3，4，9，10-二苯并-5，8-二氮杂环十五烷-N，N’-二乙酸，所述金属离子可以为Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺或Zn²⁺等中任一种。本发明可以采用琼脂糖凝胶电泳法检测核酸切割试剂的切割结果，本发明为进一步合成DNA定点识别及切割试剂的研究提供了良好的基础和有效的途径，具有重要的意义。文档编号C07H21/00GK101157713SQ200710047968公开日2008年4月9日申请日期2007年11月8日优先权日2007年11月8日发明者姚天明,景欣欣,李凤莲申请人:同济大学