专利名称：类胰高血糖素肽的合成的制作方法
技术领域：
本发明涉及肽药物合成的领域，即一种合成GLP-1肽;敫动剂的 杀斤方法。
背景技术：
新颖种类的4唐尿病药物，GLP-1或类力夷高血糖素肽1 ^敫动剂， 是一种有前途的新颖种类的治疗性化合物。然而，其通过标准固相 肽合成技术的制备不是那么容易的。基本上，人GLP-1为一种序列 上与胰高血糖素有关的天然发生的肽。文献中已描述天然GLP-1的 各种些微地修正的设计的序列变体，目的为增加效力。
该种GLP-1肽的制备已描述于WO 05/027978和WO 02/ 90388中；然而，没有任何已利用于肽合成的方法比非常基本的标 准Fmoc固相方法好。
本发明的发明人发现先前技艺的方法不允许良好产率而为工 业制备上不可接受。显然地，发现到序列依赖性、个别的偶合步骤 是高度无效率的。
发明内容
本发明的目的为发明合成GLP-1肽激动剂的另一或改良的方 法。此目的通过本发明的方法解决，其包含在固相合成期间在独特
的内序列4立置4吏用Fmoc"叚月f氨酸(pseudoproline)乂又肽单元4、替只 使用单一 Fmoc-氨基酸。
根据本发明，发明一种制备GLP-1或GLP-1激动剂肽的方法, 其中该肽具有下式
A-(Rl)x-(R2)y國R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser誦Tyr-Le u國Glu國R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala國Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6) w-(R7)z國B
或具有下式
A-(Rl)x-(R2)y-R3國Gly-Thr画Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-B
或具有下式
A画(Rl)x-(R2)y-R3國Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser画B
或具有下式
A画(Rl)x-(R2)y-R3-Gly隱Thr-Phe陽Thr-Ser匿Asp-Val陽Ser画Ser-Tyr-L eu-Glu-Gly-B
或具有下式
A-(Rl)x画(R2)y-R3-Gly画Thr画Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-L eu-Glu-R8-Gln画Ala國Ala画Lys-Glu-Phe國Ile-Ala-Trp-Leu國Val-R4-B
或具有下式
A-(Rl)x-(R2)y匿R3-Gly画Thr-Phe國Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-L eu-Glu-R8-Gln画Ala誦Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-Gly-B
，其中
B二-OH或國NH2，
A = H-、 Ac-、 Boc-、 Fmoc-,
Rl=His、 D-His、去氨基(desamino)-组氨酸、2-氨基-组氨酸、 P-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、 a-氟曱基-组氨酸或a-曱 基-组氨酸，
R2 = -Ala、 D-Ala、 -Val、 D-Val、 Gly、 Aib (a-氨基异丁酸)，
R3 = Glu、 Asp、 Met、 Leu,优选Glu或Asp，最优选Asp，
R4 = -Lys或Arg，
R5 = -Gly、 Aib、 Ala、 D-Ala,
R6 = Arg、 Lys或Gly，
R7 = Arg、 Lys或Gly，优选Lys或Gly，
R8 = Gly或Aib,
且其中，独立i也，x、 y、 w、 z为0或l，其限制条件为当x-l 时y=l,及其限制条件为当z=l时w=l,
其中个别氨基酸可视需要具有保护基团，
其包含下列步骤
a.通过包含々i脯氨酸双肽的Fmoc-保护0见需要进一步合适地
侧链经保护)的氨基酸或双肽的逐步偶合以线性方式在固相上合成
肽，其限制条件为在独特的一个分别为-Val-Ser-及/或Val-Ser-Ser 并在上述序列式中以粗体字强调的适当序列位置，第 一个假脯氨酸 双肽系偶合至生长中的肽链，该，支脯氨酸双肽系选自由 Fmoc-Val-SerCFMe'Mepro)-OH 、 Fmoc-Val-Ser0FH'Hpro)-OH 、 Fmoc-Ser(P)-Ser0FMe，Mepro)-OH及Fmoc-Ser(P)-SerCFH'Hpro)-OH所 组成的群，且其中P为一种在至少80% TFA水溶液的强酸条件下 裂解的酸可裂解的侧链^f呆护基团，优选P在以下所定义的弱酸条4牛 下不裂解，最优选P为三级-丁基或为三苯曱基，
b. /人固相裂解肽，且^L需要将肽链去保护。
具体实施例方式
GLP-1肽的活性对序列的改变4艮4文感，大部l分周边序列元素允 许残基的一些保守取代。显然地，较小的改变对生物稳定性或受体 结合且因此对药理活性仍可具有无法预并牛的效果。对此的良好回顾 参见Sarrauste de Menthi6re等人，European J. Medicinal Chemistry 39， 2004: 473-480。 GLP-1肽家族的核心序列部分确实不容"HM壬4可 的改变。
包含此核心部分的全长或部分肽的线性固相合成遇到个别偶 合步骤达到接近不可能的点的完全无效率的重大问题，即使重复偶 合亦如此。延长偶合时间、增高偶合温度等等使反应承担增加消旋 作用或不要的副产物的风险。
"i午多作者(Sarrauste,上述，和Adelhorst等人，J. Biol. Chem. 269 (1994)， 6275-6278)已通过二色性光镨分析天然GLP-l-肽在水溶液 中的二级结构(例如Chen等人，(1974)通过二色性光谱测定蛋白质 在水;容液中的螺4i及贝它形式。生物4匕学13, 3350-3359, Greenfield,
N.和Fasman ， G. D. (1969)用于蛋白质构形的评估的计算二色光语。 生物化学8， 4108-4116)且发现，然而，除了无^见巻曲(unorder)及螺 线结构的远较大的区域的外，仅相当低含量(10 % )的(3-折叠构型引 起肽骨架的聚集。所使用的光语法不允许将对应GLP-1序列部份配 置至该等结构元素。在技术领域中通常相信固相合成中的聚集且因 此产生的问题与|3_折叠构型的延长区域的发生有关。低P-折叠构型 含量对于大部分至少10 aa长度的肽是常见的且与任何合成方法中 的稀有问题无关。
Fmoc-假脯氨酸双肽单元可从现有商业途径获得；它们的合成 已被披露(例如Ruckle等人，Tetrahedron 1999, 55(37): 11281-11288; Keller等人，1998,丄Am. Chem. Soc. 120: 2714-2720)。该种假脯 氨酸肽最少用于在特殊的中心序列片^殳或序列位置或部分序列 國Val-Ser-Ser-中引入至少一个中心丝氨酸残基，以允i午于此序列位 置在部分序列-Val-Ser-或-Ser-Ser-使用假脯氨酸双肽，此为本发明 的要点，且除了最后进一步地在部分序歹iJ-Gly-Thr-或-Phe-Thr-中， 优选在部分序列-Gly-Thr-中，引入第二个假脯氨酸残基者的外。本 发明的该种4叚月甫氨酸为书亍生自Ser或Thr的N-Fmoc-肽基-(4S)-l,3-唑咬羧酸酯类且就本发明而言具有式I的共同结构
其中K为选自由Ser、 Val、 Phe、 Gly所组成的群的氨基酸残
基且其中Ser进一步地具有如下定义的在强酸条件下可裂解的侧链 j呆护基团P; Rll、 R12独立i也为H、曱基或乙基及RIO为H或曱 基。取代基R11和R12的性质影响肽酰胺键的顺式/反式异构化作 用唑，定为其部分且因此在合成期间正面地影响生长中的肽链的结 构的假脯氨酸沖击。
就本发明而言，使用焦谷氨酸作为假脯氨酸部分，其需要特殊 偶合及去保护化学，亦为可行但为并非优选(Tomasini， C.等人， Tetrahedron letters 2001， 42: 5211-5214)。
更优选地，只有在如上指明的GLP-1序列内的二个中心Ser残 基位置之一的该第 一个^Jf氨酸残基净皮4吏用于本合成方法中。这意 谓在合成期间没有4吏用第二个*1脯氨酸双肽单元。最优选i也，该第 一 #支脯氨酸双肽为才艮据本发明用于固相合成的 Fmoc-Val-Ser(甲Me'Me)-OH。
无益地寻求在本发明的独特假脯氨酸双肽不存在下合成GLP-1 肽的比较性实例可见实验部分中陈述，说明给与本发明动机的目的 技术问题。
用于肽合成的偶合剂在技术领域中为众所周知的(参见 Bodansky, M.,肽合成的原则(Principles of Peptide Synthesis),第2 片反，Springer Verlag Berlin/Heidelberg, 1993;也参见其中4禺合添 加剂或辅助剂的角色的讨^仑)。偶合剂可与酸酐类(例如T3P:丙烷 膦酸酐)或其它酰化剂例如活化酯类或酸卣化物(例如ICBF,异丁基 -氯曱酸酯)混合，或它们可为碳二亚胺(例如l-乙基-3-(3-二曱氨基 丙基)-碳二亚胺、二异丙基-碳二亚胺)、活化苯并三溱-衍生物类 (DEPBT: 3-(二乙氧基磷酰氧基)-l,2,3-苯并三"秦-4(3H)-酮)或苯并三 唑的脲(uronium)或鳞盐书f生物。
考虑到最佳产量，短反应时间和保护作用在链加长期间预防消 旋作用，更优选为偶合剂系选自由能够活化游离羧酸官能的苯并三 唑的脲盐类和辚盐类組成的群并且反应系在碱存在下进行。该种脲
或鐵偶合盐类的适当且和同样地优选的例子为例如HBTU(O-lH-苯 并三唑-l-基)-N,N,N，，N，-四曱基脲六氟磷酸盐)、BOP (苯并三唑-l-基-氧基-三-(二曱基氨基)-鳞六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-l-基-氧基-三吡咯p定基鳞六氟磷酸盐)、PyAOP、 HCTU(0-(lH-6-氯-苯并 三唑-l-基)-l，l,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TCTU(0-lH-6-氯苯并三 唑-l-基)-l，l，3,3-四曱基脲四氟硼酸盐)、HATU(0-(7-氮杂苯并三唑 -1-基)-1，1，3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TATU(0-(7-氮杂苯并三唑画l画 基)-l,l，3，3-四曱基脲四氟硼酸盐)、TOTU(O-[氰基(乙氧羰基)亚曱基 氨基]-N，N,N，,N，,-四甲基脲四氟硼酸盐)、HAPyU(O-(苯并三唑-l-基) 氧基双-(吡咯啶基)-脲六氟磷酸盐。
优选地，石威试剂为一种其共辄酸具有从7.5至15的pKa,更优 选从7.5至10的pKa的pKa值，且排除肽或氨基酸或氨基酸衍生 物的01-氨基官能的弱>喊，且该>喊优选三级位阻胺。该种及进一步地 优选的例子为Hiinig-石威(N,N-二异丙基乙基胺)、具有》克基为直链或 支链Cl-C4烷基的N，N，-二烷基苯胺、2,4，6-三烷基吡。定、2,6-三烷 基吡啶或N-烷基-吗福林，更优选其为N-甲基吗福林(NMM)或柯林 碱(2,4，6-三曱基吡啶)，最优选其为柯林碱。
偶合添加剂(特别是苯并三唑类型的偶合添加剂)的<吏用，也 是已知的(参见Bodansky,上述)。当j吏用高活化的前述该种脲或辚 盐偶合剂时，他们的使用为特别优选。因此进一步优选偶合剂添加 剂为一种能够形成活化酯的亲核性羟基化合物，更优选具有酸亲核 性N-羟基官能，其中N为酰亚胺或为N-酰基或N-芳基取^的三氮 烯基，最优选偶合添加剂为N-羟基-苯并三唑衍生物(或1-羟基-苯并 三唑书f生物)或为N-羟基-苯并三n秦书f生物。该种偶合添加剂N-羟基
化合物已大量且广泛i也描述于WO 94/07910和EP-410 182中且 其个别4皮露以引用的方式纳入本文。例子为例々0 N-羟基-琥珀酰亚 胺、N-羟基-3，4-二氢-4-侧氧基-l,2,3-苯并三n秦(HOOBt)、 1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)和N-羟基-苯并三唑(HOBt)。 N-羟基-苯并三"秦 衍生物为特佳，在一最优选具体实例中，偶合剂添加剂为羟基-3,4-二氢-4-侧氧基-l，2,3-苯并三嗓。偶合添加剂的铵盐化合物为已知且 它们于偶合化学的用途已被披露于例如US4806641中。
伴随其作为偶合辅助剂的角色，例如HOBt,也可能使用其作 为在合成期间保护Arg侧链的离子对试剂，作为对Arg的共价侧链 保护的选项。在该情况中，充份地高浓度的HOBt必须在整个固相 合成的所有循环处理步骤中维持。
在进一步特别优选的具体实例中，脲或鳞盐偶合试剂为脲盐试 剂且优选HCTU、 TCTU或HBTU及甚至更优选与N-羟基-3,4-二 氢-4-侧氧基-l，2,3-苯并三。秦或其盐组合使用于反应中。对于在除去 碱不稳定Na-保护基团的后用于链肽合成的伸长步骤，此具体实例 为主要优选的，一f旦在侧链环化作用期间也可l吏用于内酰胺化 (lactamization)反应。
就本发明而言，应注意HCTU和TCTU定义为净皮术语"脲盐试 剂"包含，如普遍在技术领域中所了解的，尽管这些化合物和可能 的类似物经由晶体结构分析已显示包含异亚硝'基部分而非脲部分 (O. Marder, Y. Shvo,和F. Albericio "HCTU和TCTU:新颖偶合剂 发展和工业应用，，，ChimicaOggi2002， 20: 37-41),替代地，在杂 环核心上的N-酰氨基耳又代基引起胍(guanidium)结构。在本上下文 中，该类的化合物称为根据本发明的脲盐试剂的'胍型次类，。
碱不稳定Na的去保护作用可如技术领域中例行地进行般进 行，例如用在N-甲基吗福林(NMP)、 二氯甲烷(DCM)或二曱基甲酰 胺(DMF)中的20%旅，定。有机非极性非质子溶剂溶剂皆例行地用于 技术领域中的所有固相合成的步骤。NMP为优选溶剂。
Fmoc氨基酸或双肽优选每当量的结合反应性固相的氨基官能 与正常1-3当量，更优选只与1-2当量的该Fmoc氨基酸试剂偶合， 例如通过Kaiser试-验测定。偶合温度通常在/人15至30。C的范围， 尤其是在使用鳞或脲型偶合剂的情形。典型地，约20至25。C的温 度被用于偶合。-本发明方法的优点为已发明一种允许产物的高产 率或GLP-1产物的优异纯度净而没有强迫^f吏用过量珍贵的生物危 险试剂(基本上在反应流出物中大部分的过量物被浪费掉)的合成方 法。
保护基团及其用途，主要地用于氨基酸侧链或Na-端^^基团 的保护，为本领域熟知(cp. Bodanzsky,上述)。Glu、 Asp的常用羧 基-保护基团为例如Mpe、 O-l-金刚烷基、O-苯曱基及甚至可使用简 单烷基酯，虽然较不常使用。为了容易的缘故，典型且优选地系使 用三级-丁基基团。酪氨酸可被不同保护基团，例如三级-丁基醚或 Z-或更优选2-溴-Z酯保护。同样地可能使用三苯甲基醇(alkohol ) 保护基团例如2-氯-三苯甲基或4-曱氧基或4,4，甲氧基-三苯甲基基 团。优选地，其为三苯曱基或三级-丁基保护基团。更佳地，其为三 级丁基(tBu)保护基团，表示酪胺酰基侧链被修改至三级-丁基醚。tBu 基团只有在强酸条件下有效率地除去。精氨酸保护基团优选可选自 由2，2,4，6，7-五曱基二氢苯并呋喃基-5-磺酰基(Pbf)、金刚烷氧基-羰 基及异冰片基(isobornyl)-氧基-羰基、2，2，5,7，8-五亚曱基口克垸磺 酰基-6-磺酰基(Pmc)、 4-曱氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基(Mtr)及其4-三级-丁基-2，3，5，6-四曱基同系物(Tart)或Boc组成的群，其等只在如 上述所定义的强酸条件下裂解。更优选i也，其为Pbf、 Pmc、 Mtr, 最优选地，其为Pbf;在侧链在强酸条件下(通常水性介质中)的 总体去保护后，用Pmc、 Mtr且特别是Pbf没有观察到去保护的酪
氨酸的旁^L者(bystander)烷基化作用。Pbf裂解率为至今最高的。 特别对使用HOBt的可选择的离子对保护才莫式的谙示。Ser、 Thr典 型可系典型地且优选地经例如三级-丁基或三苯曱基，最优选三级-丁基保护。其它保护的模式同样地能实行的，例如用苯曱基，虽然 较不佳，因为最后需要氢解除去或延长在强酸培养下的培养期，两 者同^f都不符合要求。相似的考虑适用于Lys或正-或高-赖氨酸的 4呆护作用；典型且优选地，Lys系用Boc ^f呆护。Trp必须在固相合 成期间不需要^皮保护，虽然典型地用Boc保护为优选。关于侧链保 护基团，对于天然L-氨基酸(amind acids )以及其D-同系物前述皆 为有效。
固相S应^皮理解为总计固体、非可溶性撑体材并牛，该控制孔径 玻璃、硅石或更常见的聚合有机树脂如例如Merrifield所使用的标 准聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂(PS树脂)与连接肽至其的羟苯甲基-苯 基整体连结子部份一起或Wang所使用的PS树脂与直接键联树脂 的羟基-苯曱基-对-苯曱氧基部分。该种用于肽的连接的能官位置在 此上下文中^皮称连结子，且应理解在本上下文中以术i吾'固相，被心 照不宣地推i仑为强制性的特;f正。如果需要，其它连结子部分如例如 更特化的(例如更酸不稳定)的连结子可纟皮进一步地」接枝至在预制 固相上的该第 一个整体连结子且在4支术领i或中时常称为"柄 (handle)"。该等为连结子-或柄-树脂复合物的进一步例子为分别 地以O或N-键联至肽部分的(4-甲氧基苯基)-氨基甲基-或-羟基曱基 及(4-甲基苯基)-氨基曱基-或-羟基甲基-PS固相(Atkinson等人， 2000, J. Org. Chem. 65, 5048 )，允许在从树脂最终裂解肽时产生 C-端酸或曱酰氨基团。为了本发明，固相树脂，使用在合成中，强 制性地包含至少一个整体连结子或柄，其为固相核心材料的部分； 该连结子或柄可一皮i人为是一种固定的4呆护基团(Guillier等人， Chem.Rev. 100， 2091-2157， 2000)。典型地，给定包含惰性固体 撑体或树脂的固相系凭借其允许用氨基酸或肽的酰化作用的柄基
团的连结子的化学性质而处理。更复杂的PEG-接枝聚苯乙烯树脂 例如基于特他凝胶(tentagel)的Novasyn TG (Novabiochem， Merck Biosciences,德国)，其可以结合不同^r枝柄或连结子的形式获得， 比标准PS树脂更具两亲性(amphilic),且也冲击合成效率。就本发 明而言，^f吏用由连结子或柄部分和全无PEG或其它聚氧化烯区4炎的 PS树脂所制备的固相为优选。整体或接枝PEG或聚氧化烯树脂且 因此固相为较不佳及优选本发明所排除。
本发明中所使用的树脂具有标准筛孔大小(美国标准局)，其为 约50-500网目，更4尤选100至400网目。
4吏用光可裂解连结子，如例如4皮露于Holmes等人，1995， J. Org. Chem.60, 2318中的产生甲酰胺的光可裂解连结子系可能的。在另 一优选具体实例中，本发明的固相允"i午在强酸条件下从固相裂解 肽。定义上，根据本发明，与弱酸条件相反的强酸条件表示在溶剂 中施用至少50。/。(v/v)三氟乙酸(TFA)。进一步，相反地， 一种除 去时需要强酸条件的保护基团为一种，至少，可被80。/。TFA除去的 保护基团。因此，就本发明而言，甚至需要更强酸例如HF的保护 基团不在前述定义下。弱酸条件定义为具有0.01%(v/v)_^< 50% TFA，优选具有0.1 %至30%TFA。术语"酸不稳定"指在二氯曱烷 中的2-10%TFA中于室温下经至少一'J、时以基本上定量裂解。
在本发明的特定上下文中，上述乂人固相裂解且大部份或完全地 去保护的GLP-1肽以最常用的溶剂或溶剂混合物产生泡沫凝月交溶 液。处理该凝月交溶液容易地导致可XC的材并牛损失，特别是在为了从 固相分离的过滤操作中。在一优选具体实例中，固相为一种可在如 上述所定义的弱酸条件下裂解出仍被保护的肽的固相，使用酸不稳 定固相。在该才莫式中，首先乂人固相裂解肽JU妾着，在第二个步骤中， 在如上述所定义的强酸条件下侧链去^f呆护。在一进一步地优选具体实例中，GLP-1肽被从树脂释放为C-端曱酰胺。该种产生曱酰胺的树脂的例子为例如PAL树脂(5-(4-氨基-甲基-3,5-二羟基苯氧基)戊酸酯)、Sieber树脂(Sieber， P. 1987, Tetrahedron Lett, 28, 2107)或相关的口山基酰胺类型树脂(例如 US5306562)、 Rink酰胺树月旨(Rink, H. 1987, Tetrahedron Lett. 28: 3787)、 BAL树脂(4-(4-曱酰基-3，5-二曱氧基苯氧基)-丁酸酯， Tetrahedron Lett. 43: 3543)，优选地可^f吏用产生酸不稳定曱酰胺的 树脂，如例如Sieber树脂或其它口山基酰胺类型树脂或BAL树脂， 其也为最优选具体实例。
在另一优选具体实例中，固相为酸不稳、定固相，其/人固相裂解 经保护的肽时释放C-端羧酸。该等的实例及进一步地优选具体实例 皆为2，-氯-三苯曱基、4-曱氧基或4，4'-二曱氧基-三苯甲基、4-甲基 三苯曱基树脂或相关但不同的通过用Bayer的4-羧基三苯曱基连结 子酰化而从氨基-或羟基官能化树脂衍生，且例如以Novasyn TG树 脂品牌销售的2-(4-羟基-苯基)-2,2-二苯基-乙酰基树脂。进一步地例 子为例如酸不稳定Rink酸树脂(4-(2，,4，-二甲氧基苯基-羟甲基)苯 氧基，Rink等人，1987， Tetrahedron Lett 28, 3787 )和HMPB國树 月旨(Sieber等人，1987, Tetrahedron Lett. 28， 6147; HMPB: 4-#5 曱基-3-曱氧基苯氧基丁酰基，通常偶合至rink酰胺树脂或其衍生物 作为第二个柄。
最优选地，根据本发明的肽为羧基端偶合至树脂或树脂柄(S= 固相或树脂，视需为要具有柄的树脂)。
进一步地优选如下所述的特定肽序列及各个肽-固相结合物，其 系单独或与上述进 一 步地优选具体实例组合
1，
A画His-Ala画Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser國Tyr隱Le
u-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys—Glu-phe-Ile画Ala-,Trp-Leu画val-Lys-Gly-Ar
g-S &
A-His-Ala画Glu—Gly-Thr-phe-Thr-ser-ASP-val—ser-ser-Tyr-Leu-Glu-Gl
y—Gln-Ala—Ala-Lys-Glu-phe-Ile-Ala-Trp-Leu-val-Lys画Gly-Arg-NK22.
A-His-Ala-Glu画Gly-Thr-phe-Thr-ser-ASP-val-ser画ser-Tyr-Le
u-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-phe-Ile-Ala-,Trp-Leu-val-Arg-Gly-Ar
g-Gly-S il
A-His-Ala-Glu-Gly-,Thr-phe-Thr-ser-ASP-val-ser-ser-Tyr-Leu-Glu-Gl
y-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-phe-Ile—Ala-TYP-Leu—val-Arg-Gly—Arg—Gly-o
H ，NH23.
A—His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-phe-Thr-ser—ASP-val-ser-ser-Tyr-
Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-phe-Ile-Ala-Ttp-Leu-val—Lys-Gly-
Gly-S il
A-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr—phe-Thr-ser-ASP-val—ser—ser-Tyr-Leu-Glu-
Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-phe-Ile-Ala-T;rp-Leu-val-Lys-Gly-Gly-OH払.
A-D-Ala-Glu-Gly-Thr画phe-Thr-ser-ASP-val-ser-ser-Tyr-Leu-
Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-phe-Ile-Ala-TFP-Leu-val-Lys-Gly..Arg-
Lys-S il
A-D-Ala,Glu-Gly-Thr-phe-Thr-ser-ASP-val-ser-ser-Tyr-Leu-Glu-Gly
-Gln-Ala—Ala-Lys-Glu-phe-Ile-Ala-TYP-Leu-val-Lys-Gly-Arg-Lys-NK
2
Glu—Gly-Thr-phe-Thr-ser—ASP-val-ser-ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-
Gln-Ala-Ala画Lys-Glu-phe-Ile-Ala-TYP画Leu-val-Lys画Norval-Arg-s
A-Glu-Gly-Thr-Phe曙Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu画Glu-Gly-Gln-A la-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile画Ala-Trp-Leu-Val曙Lys-NorVal-Arg-NH2 且 NorVal为正-l-缬氨酸，其为a-氨基异丁酸或a-甲基丙氨酸，为筒 称为缩写字-Aib。
实验
实施例1 :使用Fmoc-Val-Ser0FMe'Mepro)-OH 的 H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val誦Ser-Ser-Tyr-Leu画Glu画Gl y-Gln陽Ala画Ala曙Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu画Val-Arg-Gly-Arg-Gly醫O H的合成
上述肽系通过线型Fmoc合成获得。所有偶合的氨基酸皆为商 业上可获得的Fmoc-单氨基酸，除了其中在合成期间一个^f叚脯氨酸 双肽Fmoc-Val-SerCFMeMepro)-OH (得自Merck Biosciences GmbH， Schwalbach /德国，Novabiochem名片皁产品)净皮偶合至N画端序列 Ser-Tyr-Leu-Glu-的偶合步骤的外。另一例外，最后的His残基偶合 成Boc-His残基；没有赋予His-侧链保护作用。使用侧链保护基团； 为了容易列举，没有进一步地才是及N-端Fmoc ^f呆护的l吏用 Arg(Pbf)、 Asp(tbu)、 Gln(Trt)、 Glu(tbu)、 Lys(Boc)、 Ser(tbu)、 Thr(tbu)、 Trp(Boc)、 Tyr(tbu)。
在Fmoc-Gly-2-氯三苯曱基聚苯乙烯树脂(也就是预先加载 Fmoc-甘氨酸的2-CTC树脂，订单编号RAA-1039,载入> 0.5毫 摩尔/亳升，100-200网目，得自CBL-Patras,希腊)上开始3毫摩 尔等级的合成。最初，用二氯曱烷润胀树脂。为了偶合使用2至2.5 当量的Fmoc氨基酸的标准Fmoc合成，使用于二氯曱烷-N-曱基吗 福啉(DCM: NMP=1: 3)溶剂系统中在二异丙胺/ HOBt存在下于 25。C经30分钟的氨基酸的HBTU活化作用。没有进行预活化但所 有试剂以单一步骤简单混合。Fmoc去保护作用系通过在NMP中的
20 % (w / w)哌喷j妻着NMP洗涤至完全除去石咸性试剂而达成。洗涤 效率系通过四氯苯醌试-睑评估；在偶合的前重复洗涤直到不再^L察 到呈蓝色。所有偶合皆良好地进行且不需要再偶合，除了端基 Boc-His的外，可能是由于在DCM中的溶解度的问题，其可通过加 入少量DMSO作为共溶剂而减少。偶合效率可适当地进一步地通过 于位置Gln-17 4吏用非侧链保护的Fmoc-Gln替 Fmoc-Gln(Trt)而改 良。
在第一个步-骤中，在DCM中的2。/。TFA于0。C经至少10-30分 钟从树脂裂解仍经Boc保护的肽；15分钟的三次重复TFA循环被 显示效果最好，每一个4妄着p比，定处理及润洗。使用1。/。(w/w)三乙 基硅烷(TES)作为捕捉剂(scavenger)。通过氮起泡搅拌反应。裂 解的后，通过将反应浓汁(broth)倒进稀吡咬(p比咬/乙醇1: 9 (v /v))中而使用吡啶中和TFA。树脂用DCM润洗且通过过滤脱掉 溶剂。通过在真空下蒸馏掉DCM进行滤液从DCM至乙醇的溶剂 交才奐，且通过加水沉淀最后经保护的肽及过滤。用水洗涤滤々并三次 且在真空下于RT干燥肽。在此阶段，获得总计77%产率的具有约 77.3 %面积(以HPLC评估)的纯度的物质。以HPLC-MS》见察到 的分子质量对应于理^仑上预期的质量。此产物在标准溶剂例如 DCM中的溶解度是完美的。
在第二个步骤中，在用裂解混合物('CC，)稀释的DCM中进 行总体去保护作用，DCM: 'CC，-1: 10(v/v)。对于GLP-1肽， 发现为了在去保护作用期间将肽的溶解度最佳化，每份纯DCM加 入O，l最多至1份的三氟乙醇而非純DCM是最优选的。'CC，系以 混合比(Q/。w/w): 89: 2.5: 2.5: 5.0: 1.0的TFA/大茴香石克醚/ 酚/水/ TES所制成。在室温下将得自前述裂解步骤的干燥产物溶 解在10毫升如上所述用'CC，稀释的DCM中且搅拌5小时。接着通 过加入50毫升曱基-三级-丁基-醚(MTBE, Fluka Chemie， Buchs /
瑞士)，于水浴中在搅拌下将反应经30分钟冷却至0°C,且过滤掉已 同时形成的盐沉淀物来回收产物。用MTBE润洗滤饼数次，其然后 在室温下干燥，产生0.8克的以HPLC测定的约95 %纯度的并l产物。 经过步骤2和3的总产率为约75 % 。
实 施例 2 : 比津交 实 例 -N- 端 片 萃殳 H-His-Ala-Glu-Gly-Thr画Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gl y-OH (片段1至16)在假脯氨酸不存在下的合成
最初，基本上如实施例1所述进行该小片段的固相合成，除了 只着手合成專交短片断的外。各偶合反应4吏用2.5至3当量的氨基酸， 氨基酸15至9全部轻易地偶合。然而，下列Fmoc氨基酸8至1 有严重问题Y义在二个位置，偶合类似容易地进4亍。所有的其它位 置需要至少二个偶合的重复循环但仍不允许大于30 %纯度的满意 的产率。为了评估问题的严重性，且忽视一般已知的不适当消旋的 方面，剪力偶合方法使用4当量的氨基酸，增加至少一般较少消旋 倾向的氨基酸的偶合的温度至30至4(TC及^f吏用更具活性的 6-Cl-HOBt替代。然而，仍然需要稳定再偶合且无法观察到偶合效 率本身的显著改良。如实施例1中所述在2。/。TFA中在第一个步骤 中进行从树脂裂解，除了片段被证明具有非常独特的溶解度性质的 外。加入吡咬的后，经保护的未裂解片断形成凝肠(gelt)。结果在过 滤步骤的后需要将吡啶仅加至滤液；发现因为凝胶起泡而使DCM 蒸馏非常困难，到处留下固体且大幅减少产率。在加入水后，形成 可被单离的固体。然而，溶解该固体产物其后再次证明是困难的 经保护的片段为极不溶于DCM、 THF、乙腈及其混合物中。加入 在THF中的LiCl没有改善〗容解度。证明该肽孩t溶于NMP、 DMF 或DMSO中，于更合理的浓度产生凝胶状外观，且因此要求在很稀 的溶液中才喿作，发现其对于产率为次佳的。
权利要求
1. 一种制备GLP-1或GLP-1激动剂肽的方法，其中该肽具有下式A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-R5-(R6)w-(R7)z-B或具有下式A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-B或具有下式A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-B或具有下式A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-B或具有下式A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-B或具有下式A-(R1)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-R4-G1y-B，其中B＝-OH或-NH2，A＝H-、Ac-、Boc-、Fmoc-，R1＝His、D-His、去氨基(desamino)-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸或α-甲基-组氨酸，R2＝-Ala、D-Ala、-Val、D-Val、Gly、Aib(α-氨基异丁酸)，R3＝Glu、Asp、Met、Leu，优选Glu或Asp，最优选Asp，R4＝-Lys或Arg，R5＝-Gly、Aib、Ala、D-Ala，R6＝Arg、Lys或Gly，R7＝Arg、Lys或Gly，优选Lys或Gly，R8＝Gly或Aib，且其中，独立地，x、y、w、z为0或1，其限制条件为当x＝1时y＝1，及其限制条件为当z＝1时w＝1，及进一步地其中个别氨基酸可视需要具有保护基团，其包含下列步骤:
2.P-羟基-组氨酸、高组氨酸(homohistidine)、 a-氟曱基-组氨酸或 a-曱基-组氨酸，R2 = -Ala、 D-Ala、 -Val、 D國Val、 Gly、 Aib (a-氨基异丁卧复)，R3 = Glu、 Asp、 Met、 Leu, 优选Glu或Asp， 最优选Asp，R4 = -Lys或Arg,R5 = -Gly、 Aib、 Ala、 D-Ala，R6 = Arg、 Lys或Gly,R7 = Arg、 Lys或Gly，优选Lys或Gly,R8 = Gly或Aib,且其中，独立地，x、 y、 w、 z为O或l,其限制条件为当x-l 时y-l,及其限制条件为当z=l时w=l,及进一步地其中个別 氨基酸可视需要具有保护基团，其包含下列步骤a, 通过包含，U甫氨酸(pseudoproline)双肽的Fmoc4呆护(i见需要 进一步合适地侧链经保护)的氨基酸或双肽的逐步偶合以线 性方式在固相上合成肽，其限制条件为在一个适当序列位 置， 一 选自由 Fmoc-Val画Ser(甲Me'Mepro)-OH 、 Fmoc-Val-Ser(甲H'Hpro)國OH、 Fmoc-Ser(P)-Ser0FMeMepro)-OH 及Fmoc-Ser(P)-SerCFH，Hpro)-OH所组成的群的第 一个布支脯氨 酸双肽一皮偶合至生长肽链，其中P为一种在至少80% TFA 的强酸条件下裂解的酸可裂解的保护基团，优选P为三级-丁基或为三苯甲基，b. 从固相裂解肽，且视需要将肽链去保护。如权利要求1所述的方法，其特征在于至少一个环氧丙基残 基，其进一步i也可以Fmoc环氧丙基残基或以Fmoc-胺酰基环 氧丙基残基的形式偶合，系在其骨架Na上另以N-(o,p-二烷氧 基-苯曱基)或以N-(o-羟基-p-烷氧基-苯曱基)或以N-(o-酰氧基-p-烷氧基-苯甲基)而进一步N-保护，且酰氧基和烷氧基独立 地分别为Cl-C4-烷氧基和Cl-C4-酰氧基，其限制条件为该环 氧丙基残基不包含在序歹'J -Gly-ThrC^Me'Mepro)-或 -Gly-ThrCFH'Hpro)-中且与另 一假脯氨酸或Na画保护的环氧丙基 残基以至少2个介于其中的氨基酸残基分隔。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于使用二个假脯氨酸双 肽，其中该第二个与所述第一个以至少四个介于其中的氨基酸 残基分隔且优选Fmoc-Gly-ThrCFMe'Mepro )-OH。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于合成中只有使用一个假 月甫氨酸双肽单元，优选Fmoc-Val-SerCFMe'Mepro)—OH被用于偶 合至生长中的肽链。
5. —种结合固相的GLP-1或GLP-1激动剂肽，其中该肽具有下 式A-(Rl)x画(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-L eu-Glu-R8-Gln画Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp陽Leu-Val-R4-R5 陽(R6)w-(R7)z-S或具有下式A-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr画Phe-Thr-Ser-Asp-Val画Ser-S或具有下式A-(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr画Ser-Asp-Val陽Ser誦Ser-S或具有下式A画(Rl)x-(R2)y-R3-Gly-Thr-Phe-Thr國Ser-Asp-Val-Ser-Ser國Tyr-L eu-Glu-Gly-S或具有下式A-(R1 )x-(R2)y-R3 -Gly墨Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val曙Ser-Ser-Tyr-L eu-Glu-R8-Gln-Ala画Ala-Lys-Glu-Phe画Ile-Ala-Trp画Leu-Val-R4-S或具有下式A-(Rl)x-(R2)y隱R3-Gly-Thr誦Phe陽Thr-Ser-Asp-Val-Ser画Ser画Tyr-L eu-Glu-R8-Gln-Ala-Ala画Lys-Glu-Phe画Ile曙Ala画Trp-Leu-Val-R4-Gl y隱S，其中S=经由好o酯、酯或酰氨基基团c-端共价或，在c-端氨基酸为赖氨酸的情形，选择性地由该赖氨酸的s-氨基官能共价键结至 肽基部分的固才目，A = H-、 Ac-、 Boc-、 Fmoc画,Rl=His、 D-His、去氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、P-羟基-组 氨酸、高组氨酸、a-氟甲基-组氨酸或a-曱基-组氨酸，R2 = -Ala、 D-Ala、画Val、 D画Val、 Gly、 Aib (a國氨基异丁酸)，R3 = Glu、 Asp、 Met、 Leu, 优选Glu或Asp， 最优选Asp,R4 — -Lys或Arg,R5 = -Gly、 Aib、 Ala、 D-Ala,R6 = Arg、 Lys或Gly，R7 = Arg、 Lys或Gly，优选Lys或Gly,R8-Gly或Aib，且其中，独立i也，x、 y、 w、 z为0或l，其限制条件为当x-l 时乂=1，及其限制条件为当z=l时w=l,其中至少Lys、 Thr、 Ser、 Glu、 Asp的个别侧链具有非石威不稳定，优选酸可裂解的 保护基团，其在Thr或Ser的情形中保护基团可为假脯氨酸保 护基团及其中一个在独特序列片段-Val-Ser-Ser中的Ser为丝氨 酸的假脯氨酸-唑啶衍生物，优选自由-SerCFMe，Mepro)-或 -SerCFH，Hpro)-所组成的群。
6. 如权利要求5所述的结合固相的肽，其特征在于该SerCF-pro)-假脯氨酸为肽中仅有的假脯氨酸-保护的残基。
7. 如4又利要求5所述的结合固相的肽，其特征在于该肽包 含至少 一 个第二个假脯氨酸保护的残基，其为 画Thr(^Me'Mepro)-或为 Thr(^H'Hpro)-且位于独特序列 片段-Gly-Thr，优选该肽只包含二个假脯氨酸-保护的 残基，即所述第 一 个和第二个假脯氨酸残基。
全文摘要
发明一种合成GLP-1肽的新颖方法。
文档编号C07K7/08GK101379075SQ200780004655
公开日2009年3月4日 申请日期2007年1月11日 优先权日2006年2月8日
发明者卡斯滕·迈宁豪斯, 史蒂芬·瓦尔瑞, 奥列格·韦布特斯基, 马蒂厄·吉罗 申请人:隆萨股份公司