凝溶胶蛋白结合剂组合物及其用途的制作方法

专利名称：凝溶胶蛋白结合剂组合物及其用途的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及凝溶胶蛋白结合剂的制备及其用途。具体地，本发明涉及识 别人血浆凝溶胶蛋白的抗原决定簇(即表位)的抗凝溶胶蛋白抗体的制备及其用于检测凝 溶胶蛋白的用途。
背景技术：
提供以下描述来帮助读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献均不被承认是 本发明的现有技术。肌动蛋白是动物细胞中最丰富的蛋白质，并且构成许多有核细胞蛋白质的 10-20%和肌肉细胞蛋白质的30%。肌动蛋白分子每个结合一个ATP分子，并自身装配成长 丝，这期间ATP被水解成ADP。损伤动物组织导致肌动蛋白释放入细胞外间隙(包括血流)中。虽然约一半的非 肌肉细胞肌动蛋白是F-肌动蛋白(自G-肌动蛋白单体装配的双螺旋的、杆状的、细丝形 式的肌动蛋白)，但是细胞外液的离子条件有利于肌动蛋白聚合，因此预期实际上所有从濒 死细胞释放入血液中的肌动蛋白会聚合成细丝(Lind，S. Ε.等，Am. Rev. Respir. Dis. 138 429-434 (1988))。在纯化的溶液中，在没有细丝缩短蛋白的情况中，肌动蛋白丝能容易地达 到数微米的长度。然而，假如自受伤细胞释放的肌动蛋白的一些部分被不可逆变性，要不然 被结合至下文所讨论的胞内肌动蛋白结合蛋白之一，那么此肌动蛋白会保持单体。有许多与肌动蛋白天然结合的蛋白质(关于肌动蛋白结合蛋白的综述，参见 Stossel 等，Ann. Rev. Cell Biol. 1 :353-402 (1985) ；Pollard 等，Ann. Rev. Biochem. 55 987-1035(1986))。然而，认为两种蛋白质，即凝溶胶蛋白和DBP (维生素D结合蛋白)主要 负责结合胞外肌动蛋白(Janmey等，Blood70 :5^-530(1987))。凝溶胶蛋白是一种肌动蛋 白结合蛋白，其是肌动蛋白丝装配和解装配的关键调节物。凝溶胶蛋白是具有6个同源亚 域(称为S1-S6)的82-kDa蛋白质。每个亚域包含一个五链β片层，侧翼有两个α -螺旋， 一个相对于这些链垂直定位，而另一个平行定位。N端(Sl-S;3)形成延伸的β片层，C端 (S4-S6)亦然(Kiselar等，PNAS 100 =3942-3947 (2003)) 该蛋白质在物种间高度保守且 高度同源。凝溶胶蛋白位于细胞内(在胞质溶胶和线粒体中)和细胞外(在血浆中)(Koya 等，J Biol Chem 275(20) 15343-15349 (2000)) 凝溶胶蛋白在调节肌动蛋白聚合方面具有数项功能。首先，凝溶胶蛋白牵涉单体 肌动蛋白结合。在存在Ca2+的情况中，凝溶胶蛋白结合两个肌动蛋白单体。凝溶胶蛋白还 能通过另一个肌动蛋白结合位点结合肌动蛋白丝。其次，凝溶胶蛋白结合两个肌动蛋白单 体以为肌动蛋白聚合形成核，并为肌动蛋白丝带刺的(barbed)末端加帽。如此，凝溶胶蛋 白能够充当肌动蛋白聚合的核，并为初生微丝的末端加帽。最后，凝溶胶蛋白具有肌动蛋白 切割活性。由于细胞中的大量肌动蛋白，从濒死细胞释放肌动蛋白提供足够肌动蛋白而对 微环境具有显著影响，其通过提高血浆的细胞外液粘度和/或通过俘获细胞或通过其它 至今尚未鉴定的毒性效应来实现。细胞外游离的肌动蛋白的输注对动物组织，尤其是对肾和心肺系统是有毒的(Harper 等，Clin. Res. 36 :625A(1988) ；Haddad 等，PNAS 87 1381-1385(1990))。急性肾衰竭是肌肉损伤的并发症，并且大鼠中的肌动蛋白输注引起血 液尿素氮(BUN)和肌酸酐水平的瞬时升高，这与肾衰竭一致。血浆中的游离肌动蛋白可 以形成细丝，其可以导致多器官功能障碍综合征(Dahl等，Shock 12(2) :102-4(1999))。 此外，因为细丝中的每个胞外肌动蛋白分子具有与其结合的ADP分子，所以血液中胞外 肌动蛋白的存在可趋向于以对宿主可能没有益处的方式诱导或提升血小板聚集(Lind 等，Am. Rev. Respir. Dis. 138 :429-434(1988) ；Scarborough 等，Biochem. Biophy. Res. Commun. 100 1314-1319 (1981))。因此，血浆凝溶胶蛋白具有清除自死亡和濒死细胞释放的 肌动蛋白的生死攸关的功能，而且血浆凝溶胶蛋白水平表现为经历外伤的患者中的早期预 后标志物(Mounzer 等，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160 :1673-81 (1999))。发明概述一般而言，本发明涉及凝溶胶蛋白结合剂的制备及其用途。具体地，本发明涉及识 别人血浆凝溶胶蛋白的抗原决定簇(即表位)的抗凝溶胶蛋白抗体的制备及其用于检测凝 溶胶蛋白的用途。一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其与由选自下组的保 藏细胞系所生成的抗体具有相同的抗原结合特异性CGMCC编号2114、2115、和2116。在 一个实施方案中，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其至少包含选自下组的重链 ⑶R3氨基酸序列或其具有一处或多处保守氨基酸替代的变体FAQGALKSED(SEQ ID NO. 2) ,SEPDGFffEAL(SEQ ID NO. :3)、和ACSNKIGRFV (SEQ ID NO. :4)，其中所述抗体或其片段特 异性结合凝溶胶蛋白。在一个实施方案中，本发明提供了编码本发明的抗体或抗原结合片 段的核酸组合物。在一个实施方案中，本发明提供了 一种载体，其包含编码本发明的抗体或 抗原结合片段的核酸组合物。所述载体可以进一步包含与所述核酸分子可操作连接的启动 子。在一个实施方案中，本发明提供了一种宿主细胞，其包含包含编码本发明的抗体或抗原 结合片段的核酸组合物的载体。在一个实施方案中，本发明提供了一种连续细胞系，其生成 单克隆抗体，其中所述单克隆抗体与由选自下组的杂交瘤细胞系所生成的抗体结合相同的 抗原决定簇=CGMCC编号2114、2115、和2116，其中所述细胞系是通过融合如下的淋巴细胞 与小鼠骨髓瘤细胞的过程生成的，所述淋巴细胞是自用癌瘤细胞或其免疫原性决定簇免疫 的小鼠衍生的。另一方面，本发明提供了一种用于制备免疫特异性结合多肽SEQ IDN0. :1的抗体 或其片段的方法，该方法包括下列步骤(a)在提供所述抗体或其片段表达的条件下培养 含有依照权利要求4的核酸的细胞；并(b)回收所表达的抗体或其片段。另一方面，本发明提供了一种分离的凝溶胶蛋白表位，其包含选自下组的氨基酸 序列FAQGALKSED (SEQ ID N0. 2), SEPDGFffEAL (SEQ IDN0. 3)、禾口 ACSNKIGRFV (SEQ ID NO. :4)，其中所述表位受到能够结合全长人凝溶胶蛋白的抗体识别。在一个实施方案中， 本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，其是通过制备含有包含选自下组的氨基酸序列 的凝溶胶蛋白表位的免疫原而生成的FAQGALKSED (SEQ ID NO. 2), SEPDGFffEAL (SEQ ID NO. :3)、和 ACSNKIGRFV (SEQ ID NO. :4)。一方面，本发明提供了一种用于测定生物学样品中凝溶胶蛋白的存在或量的方 法，包括下列步骤(a)使生物学样品与一种或多种如下的抗体或其抗原结合片段在所述 抗体或其片段特异性结合凝溶胶蛋白的条件下接触，所述抗体或其抗原结合片段具有由选自下组的保藏细胞系所产生的相同抗原结合特异性CGMCC编号2114、2115、和2116 ；并 (b)检测结合至凝溶胶蛋白的抗体或其片段的存在或量，由此测定所述样品中凝溶胶蛋白 的存在或量。在该方法的一个实施方案中，在ELISA中使所述样品与所述抗体或抗原结合 片段接触。在该方法的一个实施方案中，所述接触步骤包括将第一抗体结合至基片，接触所 述样品，并将第二抗体结合至所述基片，其中所述第二抗体包含可检测标记物。在该方法的 一个实施方案中，所述第一抗体与由杂交瘤细胞系CGMCC编号2115所生成的抗体结合相同 的抗原决定簇，而所述第二抗体与由选自下组的杂交瘤细胞系所生成的抗体结合相同的抗 原决定簇CGMCC编号2114和2116。一方面，本发明提供了一种用于监测哺乳动物受试者中的感染性休克的方法，该 方法包括下列步骤(a)依照本发明用于测定生物学样品中凝溶胶蛋白的存在或量的方法 来测量哺乳动物受试者中的凝溶胶蛋白水平；(b)比较第一受试者中的凝溶胶蛋白水平与 参照标准，其中所述参照标准包含未患有感染性休克的对照受试者，且其中与所述参照标 准相比所述第一受试者的凝溶胶蛋白水平降低指明所述哺乳动物受试者患有感染性休克。另一方面，本发明提供了一种为用于测定化合物预防或治疗医学状况的功效的临床 试验选择所包括的哺乳动物受试者的方法，包括下列步骤(a)依照本发明用于测定生物学样 品中凝溶胶蛋白的存在或量的方法来测量哺乳动物受试者中的凝溶胶蛋白水平；(b)比较第一 受试者中的凝溶胶蛋白水平与参照标准，其中所述参照标准包含未患有影响凝溶胶蛋白水平 的疾病或状况的对照哺乳动物受试者，并(c)选择在所述临床试验中所包括的哺乳动物受试 者，其中所述哺乳动物受试者的凝溶胶蛋白水平与所述参照标准的凝溶胶蛋白水平相似。另一方面，本发明提供了一种用于在第一哺乳动物受试者中测定与凝溶胶蛋白 多肽水平改变有关的疾病或状况的存在或素因的方法，该方法包括下列步骤(a)提供来 自第一哺乳动物受试者的测试样品；(b)使所述来自第一哺乳动物受试者的测试样品与一 种或多种结合凝溶胶蛋白多肽的化合物接触以形成化合物/凝溶胶蛋白多肽复合物，其 中所述化合物是具有由选自下组的杂交瘤细胞系所产生的相同抗原结合特异性的抗体或 其抗原结合片段CGMCC编号2114、2115、和2116 ； (c)检测化合物/凝溶胶蛋白多肽复合 物的水平；(d)量化所述来自第一哺乳动物受试者的样品中的凝溶胶蛋白多肽表达水平； 并(e)比较步骤(a)的样品中的凝溶胶蛋白多肽量与来自已知未患有所述疾病或状况 或者没有所述疾病或状况的素因的第二哺乳动物受试者的对照样品中存在的多肽量，其 中与所述对照样品相比所述第一受试者中凝溶胶蛋白多肽表达水平改变指明所述疾病或 状况的存在或素因。在该方法的一个实施方案中，在ELISA中使所述样品与所述化合物 接触。在该方法的一个实施方案中，所述接触步骤包括将第一抗体结合至基片，接触所述 样品，并将第二抗体结合至所述基片，其中所述第二抗体包含可检测标记物。在该方法的 一个实施方案中，所述第一抗体与由杂交瘤细胞系CGMCC编号2115所生成的抗体结合相 同的抗原决定簇，而所述第二抗体与由选自下组的杂交瘤细胞系所生成的抗体结合相同的 抗原决定簇=CGMCC编号2114和2116。在该方法的一个实施方案中，所述与凝溶胶蛋白 水平改变有关的疾病或状况选自下组感染性休克(septic shock)、多器官功能障碍综合 征(multiple organdy sf unction syndrome)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、 中风(stroke)、心肌梗死(heart infarction)、癌症(cancer)、系统性自身免疫性疾病 (systemicautoimmune disease)、慢性肝炎(chronic hepatitis)、化学疗法的畐O作用、禾口放射疗法的副作用。一方面，本发明提供了一种用于为受试者选择预防性或治疗性处理的方法，包括 下列步骤(a)依照本发明用于测定生物学样品中凝溶胶蛋白的存在或量的方法来测量哺 乳动物受试者中的凝溶胶蛋白水平；(b)基于所述受试者的凝溶胶蛋白水平将所述受试者 归入受试者类；并(c)基于所述受试者类选择预防性或治疗性处理。一方面，本发明提供了一种纯化凝溶胶蛋白的方法，该方法包括下列步骤(a)使 包含凝溶胶蛋白的生物学样品与至少一种固定化的抗体或其抗原结合片段在所述抗体或 其片段特异性结合凝溶胶蛋白的条件下接触以形成固定化的凝溶胶蛋白抗体复合物，其中 所述抗体或其抗原结合片段具有由选自下组的保藏细胞系所产生的相同抗原结合特异性 CGMCC编号2114、2115、和2116;并(b)自所述固定化的凝溶胶蛋白抗体复合物回收所述凝 溶胶蛋白。在该方法的一个实施方案中，所述生物学样品包含人血清。一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含一个或多个容器；一种或多种抗体或 其抗原结合片段，其具有由选自下组的保藏细胞系所产生的相同抗原结合特异性CGMCC 编号2114、2115、和2116 ；和关于使用其中的内含物的指令。一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含(a)用第一抗体包被的ELISA平板；和 (b)容器中的第二抗体，其中所述第一和第二抗体是由选自下组的保藏细胞系所生成的抗 体CGMCC编号2114、2115、和2116。在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种或多 种下列成分人血浆凝溶胶蛋白标准品、人血浆稀释缓冲液、清洗缓冲液、和底物缓冲液。附图简述

图1是对作为免疫原用于生成小鼠抗人凝溶胶蛋白单克隆抗体的人血浆凝溶胶 蛋白蛋白质的SDS-PAGE分析天然的人血浆凝溶胶蛋白(第2道)、和重组的全长凝溶胶蛋 白(第3道)、重组的N端凝溶胶蛋白片段(第4道)、和重组的C端凝溶胶蛋白片段(第 5道)。第1道中显示了分子量标志物。图2是抗凝溶胶蛋白单克隆抗体对不同形式的人凝溶胶蛋白(NG 天然凝溶胶蛋 白；GF:全长重组凝溶胶蛋白；GN:重组N端凝溶胶蛋白片段；GC:重组C端凝溶胶蛋白片 段)和BSA对照的结合特征的ELISA分析。每幅小图呈现了来自不同抗体的数据小图A， GN3E9 (图 2A)；小图 B，GF2D6 (图 2B)；小图 C，GClClO (图 2C)；和小图 D，GS2C4 (图 2D)。图3是用抗凝溶胶蛋白单克隆抗体探查两份人血浆样品的SDS-PAGE的Western 印迹分析。图4是对用抗凝溶胶蛋白抗体免疫沉淀的人血浆凝溶胶蛋白的SDS-PAGE分析。 每道中的样品如下第1道，空白对照(无血浆)；第2道，GClClO ；第3道，GF2D6 ；第4道， GN3E9 ；和第 5 道，GS2C4。图5是通过免疫沉淀(顶部小图)和Western印迹分析(底部小图)对抗凝溶胶 蛋白抗体即GClClO (图5A)、GF2D6(图5B)和GN3E9 (图5C)在七种不同物种第1道，小 鼠；第2道，猴；第3道，家兔；第4道，大鼠；第5道，牛；第6道，马；第7道，人间的交叉反 应性的分析。图6是凝溶胶蛋白C端片段的3D结构和抗凝溶胶蛋白抗体的表位位置。图7是抗凝溶胶蛋白抗体对纯化的人血浆凝溶胶蛋白的结合的F-肌动蛋白抑制 性ELISA分析。F-肌动蛋白对抗体结合凝溶胶蛋白的抑制呈现为相对于没有F-肌动蛋白的情况中的结合的百分比。图8是通过使用一对抗体，即GN3E9/GC1C10 (图8A)或GN3E9/GF2D6 (图8B)进行 的化学发光ELISA产生的人血浆凝溶胶蛋白标准曲线，将血浆凝溶胶蛋白浓度(ng/mL)显 示为检测信号(相对光单位，RLU)的函数。图9是基于样品操作条件，即向样品添加柠檬酸钠(柠檬酸盐)、肝素、或EDTAJi 血浆凝溶胶蛋白水平定量的比较。图10显示了使用抗体对GN3E9/GC1C10的ELISA测定法中光密度对凝溶胶蛋白多 肽浓度的图，其中所述凝溶胶蛋白多肽是NG，天然凝溶胶蛋白；GF，全长重组凝溶胶蛋白； GN,重组N端凝溶胶蛋白片段；或GC，重组C端凝溶胶蛋白片段。图11显示了在ELISA测定法中光密度对血浆凝溶胶蛋白的图，所述ELISA测定法 使用GN3E9/GC1C10(图11A)或GN3E9/GF2D6 (图11B)抗体对来测量没有肌动蛋白的凝溶 胶蛋白(对照)或与肌动蛋白复合的凝溶胶蛋白(+肌动蛋白)。图12是使用本发明的凝溶胶蛋白ELISA测定法在健康对照(n = 291)和I⑶(病 危护理)患者(n = 22)中测量的血清凝溶胶蛋白浓度的图。图13是正常患者和展现出不活动形式和活动形式的系统性红斑狼疫(SLE)的患者中 的血清凝溶胶蛋白浓度(ug/mL)的图，如使用本发明的凝溶胶蛋白ELISA测定法所测定的。图14是正常患者和患有慢性肝炎的患者中的血清凝溶胶蛋白浓度(μ g/mL)的 图，如使用本发明的凝溶胶蛋白ELISA测定法所测定的。图15是对化学疗法对血浆凝溶胶蛋白水平的影响的Western印迹分析。图15A 是Western印迹的照片，而图15B是通过密度测定法对Western印迹进行的定量分析。图16是化学疗法后对血浆凝溶胶蛋白的时间依赖性消减的Western印迹分析。 图16A是接受阿霉素(adriamycin)后在多个时间点时的小鼠血清样品的^iestern印迹的 照片。图16B是通过密度测定法对图16A的Western印迹的定量分析。图16C是接受泰素 (Taxol)后在多个时间点时的小鼠血清样品的Western印迹的照片。图16D是通过密度测 定法对图16C的Western印迹的定量分析。图17的图显示了化学疗法中5名患者的血菜凝溶胶蛋白水平。顺钼化学疗法后患有 卵巢癌的患者组中的时间依赖性降低，如使用本发明的凝溶胶蛋白ELISA测定法所测定的。图18的图显示了在体内鼠模型中全长重组凝溶胶蛋白在降低化学疗法诱导的体 重减轻(图18A)和死亡率(图18B)方面的治疗功效。图19是通过本发明的GC1C10、GN3E9、和GC2D6抗体亲和纯化的人血浆凝溶胶蛋 白的 SDS-PAGE。图20是用3种代表性抗凝溶胶蛋白抗体对不同形式的人血浆凝溶胶蛋白的 Western印迹分析。小图A是仅与90kDa形式的人血浆凝溶胶蛋白起反应的一组抗体的代 表(图20A)。小图B是仅与50kDa凝溶胶蛋白样多肽起反应的一组抗体的代表(图20B)。 小图C是与90kDa和50kDa这两种免疫反应性形式都起反应的一组抗体的代表(图20C)。图21是用抗凝溶胶蛋白抗体对具有或没有凋亡的人胰腺癌细胞系的胞内凝溶胶 蛋白的Western印迹分析。将人胰腺癌细胞，即MIAcapa在对照培养基中(第1道)或者 在存在lOOOng/ml抗DR5抗体(CTB006)的情况中培养4小时(第2道)。用凝溶胶蛋白C 端片段特异性抗体GClClO (图21A)或凝溶胶蛋白N端片段特异性抗体GN3E9(图21B)探查总细胞溶胞物的Western印迹。图22是4名健康对照患者(Ni至N4)和4名癌症患者(Cl至C4)的第一项研究 (图22A)和4名健康对照患者(N5至N8)和4名癌症患者(C5至C8)的第二项研究(图 22B)中对免疫沉淀的血浆凝溶胶蛋白的SDS-PAGE分析(顶部小图)和对总血浆凝溶胶蛋 白的Western印迹分析(底部小图)。图23是正常患者与患有类风湿性关节炎的患者相比的血清凝溶胶蛋白浓度 (ug/mL)的图，如使用本发明的凝溶胶蛋白ELISA测定法所测定的。发明详述总论。应当领会的是，下文以多种水平详细描述了本发明的某些方面、模式、实施 方案、变化形式和特征，以便提供对本发明的实质理解。一般而言，本发明提供了能结合凝溶胶蛋白多肽的凝溶胶蛋白结合剂(例如抗 体)。因而，本发明的多个方面涉及凝溶胶蛋白结合剂的制备、表达和表征。本发明的凝溶 胶蛋白结合剂对于检测测试样品中的凝溶胶蛋白多肽(也称为靶多肽)以及在用于纯化 天然凝溶胶蛋白蛋白质(包括来自生物学样品的天然凝溶胶蛋白多肽)的方法中是有用的 (单独地或组合地)。凝溶胶蛋白结合剂可用于在有所需要的受试者中诊断凝溶胶蛋白相 关医学状况。表1显示了人凝溶胶蛋白多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO. :1)。
表ι 人凝溶胶蛋白多肽序列
~MAPHRPAPALLCALSLALCALSLPVRMTASRGASQAGAPQGRVPEARPNSMVVEHPEFLKAGKEPGLQIWRVEKFDLVPVPTNLYGDFFTGDAYVILKTVQLRNGNLQYD LHYffLGNECSQDESGMAIFTVQLDDYLN GRAVQHREVQGFESATFLGYFKSGLKYKKGGVASGFKHVVPNEVVVQRLFQVKGRRVVRATEVPVSWESF NNGDCFILDLGN NIHQWCGSNSNRYERLKATQVSKGIRDNERSGRARVHVSEEGTEPEAMLQVLGPKPAL PAGTEDTAKEDAANRKLAKLYKVSNGAGTMSVSLVADENPFAQGALKSEDCFILD HGKDGKIFVffKGKQA NTEERKAALKTASDFITKMDYPKQTQVSVLPEGGETPLFKQFFKNWRDPDQTDGLGLSYLSSHIANVERV PFDAATLHTSTAMMQHGMDDDGTGQ KQIffRIEGSNKVPVDPATYGQFYGGDSYIILYNYRHGGRQGQII YNWQGAQSTQDEVMSAILTAQLDEELGGTPVQSRVVQGKEPAHLMSLFGGKPMIIYKGGTSREGGQTA P ASTRLFQVRANSAGATRAVEVLPKAGALNSNDAFVLKTPSMYLWVGTGASEAEKTGAQELLRVLRAQPV QVAEGSEPDGFWEALGGKMYRTSPRLKDKKMDAHPPRLF ACSNKIGRFVIEEVPGELMQEDLATDDVML LDTffDQVFVWVGKDSQEEEKTEALTSAKRYIETDPANRDRRTPITVVKQGFEPPSFVGWFLGWDDDYffSV DPLDRAMAELAA (SEQ ID NO. 1)_在一些实施方案中，本发明的凝溶胶蛋白结合剂(例如抗凝溶胶蛋白或抗凝溶胶 蛋白样抗体)检测有活性的、或未结合的形式的凝溶胶蛋白。虽然不希望限于理论，游离的 和复合的(与肌动蛋白)凝溶胶蛋白分子在其功能特性上有所不同。虽然游离的凝溶胶蛋 白能切割肌动蛋白丝，但是复合物中的肌动蛋白-凝溶胶蛋白不能。凝溶胶蛋白的切割活 性受到微摩尔Ca2+活化，而且已经显示了受到磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇一磷 酸(PIP)抑制。因为胞外的Ca2+浓度处于毫摩尔水平，而细胞外液正常情况下不含处于抑 制凝溶胶蛋白的形式的PIP或PIP2,所以血浆凝溶胶蛋白在细胞外液中是组成性有活性的。本发明的多个方面进一步涉及如下诊断方法和试剂盒，它们使用本发明的凝溶胶蛋白 结合剂来鉴定有医学状况素因的个体或关于药物响应性、副作用、或最佳药物剂量来对个体分 类。在其它方面，本发明提供了用于从生物学样品纯化凝溶胶蛋白或凝溶胶蛋白样多肽(包括例 如自血浆纯化天然人凝溶胶蛋白)的方法。因而，随后为例示这些方面的多个具体的实施方案。在下文附随的描述中列出本发明的一个或多个实施方案的详情。虽然可以在本发 明的实施或测试中使用与那些在本文中所描述的类似或等同的任何方法和材料，但是现在 描述优选的方法和材料。本发明的其它特征、目的、和优点从说明书和权利要求书出发会是 显而易见的。一般而言，依照制造商的说明书来实施酶促反应和纯化步骤。在实施本发明中，使用分子生物学、蛋白质生化、细胞生物学、免疫学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。这些技术是公知的，而且记载于例如Current Protocols in Molecular Biology,卷 I-III, Ausubel 编(1997) ；Sambrook 等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版(Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)) ；DNA Cloning =APractical Approach，卷 I 和卷 II，Glover 编(1985)； Oligonuchotide Synthesis, Gait 编(1984) ；Nucleic Acid Hybridization, Hames 禾口 Higgins 编(1985) ；Transcription and Translation, Hames 禾口 Higgins 编(1984) ；Animal Cell Culture, Freshney 编(1986) ；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986)； Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning ；丛书 Meth. Enzymol. , (Academic Press, Inc. ,1984) ；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller 禾口 Calos编 (ColdSpring Harbor Laboratory, NY, (1987))；及 Meth. Enzymol.，第 154 卷和第 155 卷， 分别由mi和Grossman，及mi编。用于检测和测量多肽基因表达产物的水平(即基因翻译 水平)的方法是本领域中公知的，并且包括使用多肽检测方法诸如抗体检测和量化技术。 还可参见 Strachan 禾口 Read, Human MolecularGenetics,第二版(John Wiley and Sons, Inc.，NY, (1999))。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语一般与本发明所属领域普通 技术人员通常的理解具有相同的含义。如本说明书和所附的权利要求书中所使用的，单数 形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指物，除非内容另有明确指明。例如，提及“一个 /种细胞”包括两个/种或更多个/种细胞的组合等。一般而言，本文中所使用的术语和下 文所描述的细胞培养、分子遗传学、有机化学、分析化学和核酸化学和杂交的实验室规程是 那些本领域中公知且通常采用的。本文通过提及而完整且出于所有目的收录本文中所引用 的所有参考文献，其程度就像出于所有目的明确且单独通过提及而完整收录每篇单独的出 版物、专利、或专利申请一样。定义。下文提供了如本说明书中所使用的某些术语的定义。其它术语的定义可见 于 Illustrated Dictionary of Immunology，第 2 片反(Cruse, J. Μ.和 Lewis，R.E.编，Boca Raton,FL=CRC Press，1995)。除非另有指明，术语“凝溶胶蛋白”在本文中使用时指人蛋白 质和基因。如本文中所使用的，向受试者“施用”药剂或药物包括向受试者导入或投递化合 物以执行其预期功能的任何路径。施用可以通过任何合适的路径来实施，包括口服、鼻内、 胃肠外(静脉内、肌肉内、腹膜内、或皮下)、直肠、或表面。施用包括自我施用和由他人施 用。还应当领会的是，如所描述的医学状况的治疗或预防的各种模式意图意味着“基本上的 /实质性的”(substantial)，其包括总体的，但还包括小于总体的治疗或预防，及其中实现 一些生物学或医学有关结果的。如本文中所使用的，术语“氨基酸”包括天然存在的氨基酸和合成的氨基酸，以及 氨基酸类似物和以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的氨基酸模拟物。天然存在的 氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，以及那些随后进行修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、 Y -羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在的氨基酸相同的基本 化学结构(即与氢、羧基基团、氨基基团、和R基团结合的α-碳)的化合物，例如高丝氨 酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经过修饰的R基团(例如 正亮氨酸)或经过修饰的肽主链，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有不同于氨基酸一般化学结构的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方 式发挥功能的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过它们通常所知道的三字母符号或通过 由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过其通常 接受的单字母密码来提及。如本文中所使用的，术语“抗体”指特异性结合和识别抗原(例如凝溶胶蛋白多 肽)的包含来自免疫球蛋白基因的框架区的多肽或其片段。术语抗体的使用意图包括完整 抗体(包括单链完整抗体)及其抗原结合片段。术语“抗体”包括双特异性抗体和多特异 性抗体，只要它们展现出想要的生物学活性或功能。如本文中所使用的，术语“抗体相关多肽”指可以包含单独的或与全部或部分下 列多肽元件组合的可变区的抗原结合抗体片段(包括单链抗体)抗体分子的铰链区、CHp CH2、和CH3域。本发明中还包括的是可变区与铰链区、CHp CH2、和CH3域的任意组合。作 为本发明的结合剂有用的抗体相关分子包括例如但不限于i^ab、Fab'和F(ab’)2、Fd、单链 Fv (scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fv (sdFv)和包含\域或Vh域的片段。例子包括(i) Fab片段，即一种由Vl域、Vh域、Cl域和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2片段，即一种 包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由Vh域和 CH1域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的\域和Vh域组成，(v)dAb片段(Ward等，Nature 341 =544-546,1989)，其由Vh域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。因此，“抗体片段” 可以包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、 Fab’、F(ab’)2、和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和自抗体片段形成的多特异 性抗体。单链抗体分子可以包含具有许多个体分子的聚合物，例如二聚物、三聚物或其它聚 合物。如本文中所使用的，术语“生物学样品”指自活细胞衍生的或由活细胞接触的样品 材料。术语“生物学样品”意图包括自受试者分离的组织、细胞和生物学液体，以及存在于 受试者内的组织、细胞和液体。本发明的生物学样品包括例如但不限于全血、血浆、精液、唾 液、泪液、尿液、粪便材料、汗液、口腔、皮肤、脑脊髓液、和毛发。生物学样品还可以获自内脏 活组织检查或者获自癌症。生物学样品可以获自受试者(用于诊断或研究)，或者可以获自 未患病个体(作为对照或用于基础研究)。如本文中所使用的，术语“CDR嫁接抗体”指如下的抗体，其中“受体”抗体的至少 一个CDR用来自拥有想要的抗原特异性的“供体”抗体的CDR “嫁接物”替换。如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”指如下的抗体，其中来自一个物种的单克隆 抗体的Fc恒定区(例如小鼠Fc恒定区)使用重组DNA技术用来自另一个物种的抗体的 Fc恒定区(例如人Fc恒定区)替换。一般而言，参见Robinson等，PCT/US86/02^9 ；Akira 等，欧洲专利申请184，187 ；Taniguchi，欧洲专利申请171，496 ；Morrison等，欧洲专利申请 173，494 ；Neuberger 等，W086/01533 ；Cabilly 等，美国专利 No. 4，816，567 ；Cabilly 等，欧 洲专利申请 125,023 ；Better 等，Science 240 1041-1043，1988 ；Liu 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :3439-3443,1987 ；Liu 等，J. Immunol 139 :3521-3526,1987 ；Sun 等，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 84 :214-218,1987 ;Nishimura 等，Cancer Res 47 :999-1005,1987 ； Wood 等，Nature 314 :446-449,1885 ；及 Shaw 等，J. Natl. Cancer Inst. 80 :1553-1559, 1988。
如本文中所使用的，术语“临床响应”指任何或所有以下各项不利的响应(即副 作用)、无响应、和响应的定量测量。如本文中所使用的，术语“临床试验”指设计用于收集关于对特定处理的响应的临 床数据的任何调查研究，并且包括但不限于I期、II期、和III期临床试验。使用标准方法 来限定患者群体和登记受试者。如本文中所使用的，术语“共有FR”指共有免疫球蛋白序列中的框架(FR)抗体区。 抗体的FR区不接触抗原。如本文中所使用的，术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该 片段包含同一多肽链中相连接的重链可变域(Vh)与轻链可变域(VhVl) 0通过使用短 得不能容许同一条链上的两个域之间配对的接头，迫使这些域与另一条链的互补域配对， 并创建两个抗原结合位点。双抗体更全面地记载于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :6444-6448 (1993)。如本文中所使用的，术语“效应细胞”指牵涉免疫应答的效应器阶段(与免疫应答 的认知和活化阶段形成对比)的免疫细胞。例示性的免疫细胞包括骨髓或淋巴起源的细 胞，例如淋巴细胞(例如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤 细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜曙红细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞、和 嗜碱细胞。效应细胞表达特定的Fc受体，并实施特定的免疫功能。效应细胞能诱导抗体依 赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，例如能够诱导ADCC的嗜中性粒细胞。例如，表达Fc α R 的单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、和淋巴细胞牵涉特异性杀伤靶细胞，并 将抗原呈递至免疫系统的其它成分，或结合呈递抗原的细胞。效应细胞还能吞噬靶抗原、靶 细胞、转移癌细胞、或微生物。如本文中所使用的，术语“表位”指能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通 常由有化学活性的表面分组分子诸如氨基酸或糖侧链组成，而且通常具有特定的三维结构 特征，以及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别在于在存在变性溶剂的情况中 丧失对前一种而非后一种的结合。在一个实施方案中，凝溶胶蛋白的“表位”是凝溶胶蛋白 蛋白质中与本发明的凝溶胶蛋白结合剂结合的区域。在本发明挑选的实施方案中，此表位 在跨越SEQ ID NO. :1中自约321至约330、自约636至约645、或自约661至670氨基酸残 基的域中。为了筛选结合表位的凝溶胶蛋白结合剂，可以实施常规的交叉阻断测定法，诸如 记载于 Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow 和David Lane (1988)的。可以使用此测定法来测定凝溶胶蛋白结合剂是否与本发明的凝 溶胶蛋白抗体结合相同位点或表位。或者/另外，可以通过本领域中已知的方法来实施表 位作图。例如，可以通过诸如丙氨酸扫描来诱变抗体序列以鉴定接触残基。在一种不同的 方法中，可以在用多种测试抗体或用一种测试抗体和一种具有已表征或已知表位的抗体进 行的竞争测定法中使用与凝溶胶蛋白的不同区域对应的肽。如本文中所使用的，组合物的术语“有效量”或“药学有效量”或“治疗有效量”指 足以实现想要的治疗和/或预防效果的数量，例如，导致所治疗的疾病(例如与靶多肽(例 如凝溶胶蛋白或凝溶胶蛋白样多肽)有关的疾病或医学状况)有关的症状的预防或减少/ 减轻的量。向受试者施用的本发明组合物的量会取决于疾病的类型和严重性，并取决于个体的特征，诸如一般健康、年龄、性别、体重和对药物的耐受。它还会取决于疾病的程度、严 重性和类型。熟练技术人员会能够根据这些和其它因素来确定合适的剂量。还可以与一种 或多种别的治疗化合物组合施用本发明的组合物。在本发明的方法中，可以向具有由疾病 或外伤状况引起的凝溶胶蛋白水平降低的受试者施用凝溶胶蛋白，由此提高受试者中血浆 凝溶胶蛋白的水平。例如，凝溶胶蛋白的“治疗有效量”指最少游离的胞外肌动蛋白的毒性 效应得到改善的水平。如本文中所使用的，“表达”包括但不限于以下一项或多项基因转录成前体mRNA ； 对前体mRNA的剪接和其它加工以生成成熟mRNA ；mRNA稳定性；成熟mRNA翻译成蛋白质 (包括密码子选择和tRNA可用性)；和对翻译产物的糖基化和/或其它修饰，若正确的表达 和功能需要的话。如本文中所使用的，术语“凝溶胶蛋白”指一种多功能性肌动蛋白结合蛋白。在哺 乳动物中，凝溶胶蛋白包含两种同等型胞质变体和胞外变体。人血浆凝溶胶蛋白与细胞凝 溶胶蛋白的不同之处仅在于向该分子的N端添加约25个氨基酸，并且两种凝溶胶蛋白都是 单基因的产物。血浆凝溶胶蛋白具有三个肌动蛋白结合位点，而且以高亲和力结合G-肌动 蛋白或F-肌动蛋白。“凝溶胶蛋白，，还指重组形式的哺乳动物多肽。如本文中所使用的，术语“基因”指含有关于RNA产物受调节的生物合成的所有信 息的DNA区段，包括启动子、外显子、内含子、及其它控制表达的非翻译区。如本文中所使用的，术语“人序列抗体”包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生 的可变区和恒定区(若存在的话)的抗体。本发明的人序列抗体可以包括不由人种系免 疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变 引入的突变)。可以在非人转基因动物中生成此类抗体，例如如记载于PCT公开文本号WO 01/144M和WO 00/37504的。然而，如本文中所使用的，术语“人序列抗体”并不意图包括 如下抗体，其中已经将自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系衍生的CDR序列嫁接至 人框架序列上(例如人源化抗体)。如本文中所使用的，非人(例如鼠)抗体的术语“人源化”形式指最低限度含有衍 生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指如下的人免疫球蛋 白，即受体的高变区残基用具有期望特异性、亲和力、和能力的非人物种(供体抗体)诸如 小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物的高变区残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的 Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体中或在 供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体的性能诸如结合亲和力。一 般而言，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上如下的整个可变域，其中所有或基本 上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白 序列的那些，尽管FR区可以包含一处或多处改善结合亲和力的氨基酸替代。FR中这些氨基 酸替代的数目通常在H链中不超过6处，而在L链中不超过3处。人源化抗体任选还会包 含免疫球蛋白恒定区(Fe)(通常是人免疫球蛋白的)的至少一部分。更多细节参见Jones 等，Nature 321 :522-525(1986) ；Reichmann 等，Nature 332 :323-329(1988)；和 Presta， Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。涵盖对本文中所描述的凝溶胶蛋白抗体的“氨基酸序列修饰”。例如，可能想要改 善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将合适的核苷酸变化引入抗体核酸中，或者通过肽合成来制备凝溶胶蛋白抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如凝溶胶蛋 白抗体氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。进行删除、插入、和替代的任 意组合以获得感兴趣的抗体，只要所获得的抗体拥有想要的特性。修饰还包括蛋白质糖基 化样式的改变。一种对鉴定优选的诱变位置有用的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如记载于 Cunningham和Wells，于kience，244 :1081-1085(1989)的。然后对突变抗体筛选想要的 活性。本发明包括具有由杂交瘤GC1C10、CN3E9、或GF2D6所限定的氨基酸序列的一处或 多处氨基酸添加、删除和/或替代的抗体变体，倘若所述抗体变体拥有想要的特性，所述杂 交瘤分别具有CGMCC编号2114、2115、2116。如本文中所使用的，术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。一般而 言，高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，\中大约残基M-34(L1)、 50-56 (L2)和 89-97 (L3)附近及 Vh 中大约残基 31-35B (HI)、50_65 (H2)和 95-102 (H3)附近 (Kabat 等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第 5 版Public Health Service, National Institutes ofHealth,Bethesda,MD. (1991))和/或那些来自“高变环” 的残基(例如\中的残基沈-32 (Li)、50-52 (L2)和91-96 (L3)及Vh中的残基^_32(H1)、 52A-55(H2)和 96-101(H3)(Chothia和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901-917 (1987))。如本文中所使用的，术语“相同的”或百分比“同一性”在两种或更多种核酸或多 肽序列的语境中使用时指根据用下文所描述的缺省参数使用BLAST或BLAST 2. 0序列比较 算法，或者通过手动比对和目视检查(参见例如NCBI网站)的测量，两种或更多种序列或 亚序列相同或具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在为实现最大对应而在比 较窗或指定区域里比较和比对时，在规定区域(例如，编码本文中所描述的抗体的核苷酸 序列或本文中所描述的抗体的氨基酸序列)里约60%同一性，优选65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高的同一性)。然后此 类序列被说成是“基本上相同的”。此术语还指，或者可以应用于测试序列的互补物。该术 语还包括具有删除和/或添加的序列，以及那些具有替代的序列。如下文所描述的，优选的 算法可以考虑缺口等。优选地，在长至少约25个氨基酸或核苷酸的区域里，或者更优选地， 在长50-100个氨基酸或核苷酸的区域里存在同一性。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物学活性部分是基本上没有细胞物质或来自衍 生凝溶胶蛋白结合剂的细胞或组织来源的其它污染性多肽，或者在化学合成时基本上没有 化学前体或其它化学品。例如，分离的凝溶胶蛋白结合剂(其是抗凝溶胶蛋白或抗凝溶胶 蛋白样抗体)会没有会干扰该药剂的诊断或治疗用途的物质。此类干扰性物质可以包括 酶、激素和其它蛋白质性质的和非蛋白质性质的溶质。或者，分离的凝溶胶蛋白或凝溶胶蛋 白样多肽(其与本发明的凝溶胶蛋白结合剂有免疫反应性)会基本上没有会干扰该多肽 的诊断或治疗用途的物质。如本文中所使用的，术语“完整抗体”指具有通过二硫键相互联结的至少两条重 (H)链多肽和两条轻(L)链多肽的抗体。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为HCVR或 Vh)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个域，即CHp CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可 变区(在本文中缩写为LCVR或^和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域，即Q构成。 可以将Vh区和\区进一步细分成高变性区域(称作互补决定区(CDR))，其散布有更保守 的区域(称作框架区(FR))。每个V1^Pt由三个CDR和四个FR构成，从氨基端至羧基端以如下次序排列=FRpCDI^FRy CD&、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互 作用的结合域。抗体的恒定区能介导免疫球蛋白对宿主组织或因子的结合，包括免疫系统 的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
如本文中所使用的，术语“免疫应答”指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细 胞、和由上述细胞或肝脏生成的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子、和补体)的协同作用， 其导致选择性损害、破坏、或消除人体中的癌性细胞、转移性肿瘤细胞、恶性黑素瘤、侵入性 病原体、受到病原体感染的细胞或组织，或者(在自身免疫或病理学炎症的情况中)正常的 人细胞或组织。 如本文中所使用的，术语“免疫学交叉反应性”和“免疫学反应性”可互换使用，指 抗原与使用相同(“免疫学反应性”)或不同(“免疫学交叉反应性”)抗原生成的抗体有 特异性反应性。一般而言，抗原是凝溶胶蛋白多肽，其变体或亚序列。如本文中所使用的，术语“免疫学反应性条件”指容许针对抗原的特定表位生成的 抗体以可检测出的如下程度结合该表位的条件，所述程度大于该抗体结合基本上所有其它 表位，一般至少超出背景结合两倍，优选至少超出背景五倍。免疫学反应性条件依赖于抗 体结合反应的形式，并且通常是那些在免疫测定方案中利用的。关于免疫测定法形式和条 件的描述参见 Harlow 禾口 Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, NewYork,1988)。如本文中所使用的，术语“淋巴细胞”指血液、淋巴、和淋巴样组织中找到的任何单 个核的、非吞噬的白细胞，例如B和T淋巴细胞。如本文中所使用的，术语“医学状况”包括但不限于如想要治疗和/或预防的一种 或多种身体和/或心理症状所表现的任何状况或疾病，并且包括先前和新近鉴定的疾病和 其它病症。例如，医学状况可以是肝炎、SLE、癌症、感染性休克、中风、心肌梗死、及化学疗法 和放射疗法的副作用。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体， 即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能的天然存在突变外。例如， 单克隆抗体可以是自单一克隆(包括任何真核、原核、或噬菌体克隆)衍生的抗体，而非生 成其的方法。单克隆抗体组合物展示针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。单克隆抗 体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不 同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修 饰语“单克隆”指明如自一群基本上同质的抗体获得的抗体的特征，而不应解释为要求通过 任何特定方法来生成抗体。可以使用本领域中已知的极其多种技术来制备单克隆抗体，包 括例如但不限于杂交瘤、重组、和噬菌体展示技术。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体 可以通过最初由Kohler等，Nature 256 =495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通 过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利No. 4，816，567)。“单克隆抗体”还可以使用例 如 Clackson 等，Nature 352 :624-628 (1991)及 Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581-597 (1991) 中记载的技术从噬菌体抗体库分离。如本文中所使用的，术语“药学可接受载体”意图包括与药学施用相容的任何和所 有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌化合物、等张和吸收延迟化合物等。如本文中所使用的，术语“多克隆抗体”指自至少两种(2)不同抗体生成细胞系衍生的抗体的制备物。此术语的使用包括至少两种( 抗体的制备物，其含有特异性结合抗 原的不同表位或区域的抗体。如本文中所使用的，术语“多核苷酸，，或“核酸”指任何RNA或DNA，其可以是未修 饰的或经修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA，单链和双链区混合物 的DNA、单链和双链RNA、单链和双链区混合物的RNA、和包含DNA和RNA的杂合分子，其中所 述DNA和RNA可以是单链或者(更典型地)双链或单链和双链区的混合物。另外，多核苷 酸指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个 经修饰的碱基的DNA或RNA和具有经修饰的主链的DNA或RNA，所述修饰是出于稳定性或出 于其它原因。在一个具体的实施方案中，多核苷酸含有来自凝溶胶蛋白基因的多核苷酸序 列。如本文中所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指包含两 个或更多个彼此由肽键或修饰的肽键(即肽等排体)相连接的氨基酸的聚合物。多肽指短 链(通常称为肽、糖肽或寡聚物)和较长的链(通常称为蛋白质)两者。多肽可以含有20 种由基因编码的氨基酸以外的氨基酸。多肽包括通过天然过程(诸如翻译后加工)或通过 本领域中公知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此类修饰详细记载于基础教科书和更详 细的专著，以及多卷的研究文献中。在一个具体的实施方案中，多肽含有来自凝溶胶蛋白蛋 白质的多肽序列。如本文中所使用的，术语“群体”可以是至少两个个体的任何组。群体可以包括例 如但不限于参照群体、群体组、家族群体、临床群体、和相同性别的群体。如本文中所使用的，术语“重组”在提及例如细胞、或核酸、蛋白质、或载体使用时 指明已经通过引入异源核酸或蛋白质或对天然核酸或蛋白质的改变而修饰的细胞、核酸、 蛋白质或载体，或者该物质衍生自如此修饰的细胞。如此，例如重组细胞表达在天然(非重 组)形式的细胞内没找到的基因或者表达在其它情况中异常表达、表达不足或根本不表达 的天然基因。如本文中所使用的，术语“参照标准”指施用化合物前在参照标准群体或单一受试 者中观察到的一种或多种基因或蛋白质的表达样式。如本文中所使用的，短语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgGp IgG2, IgG3、或IgG4)Fc区中负责延长IgG分子的体内血清半衰期的表位。为了延长抗体的血清 半衰期，可以将补救受体结合表位引入抗体(特别是抗体片段)中，如记载于例如美国专利 5，739，277 的。如本文中所使用的，术语“单链抗体”或“单链Fv(SCFV) ”指Fv片段的两个域(即 八和Vh)的抗体融合分子。虽然Fv片段的两个域(即由分开的基因编码，但是它们 可以使用重组方法通过使它们能够以单一蛋白质链制备的合成接头连接，在所述单一蛋白 质链中I和配对以形成单价分子(称为单链Fv(ScFv))。参见例如Bird等，Science 242 :423-426,1988 ；及 Huston 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :5879-5883,1988。此类单
链抗体被包
权利要求
1.一种抗体或其抗原结合片段，其与由选自下组的保藏细胞系所生成的抗体具有相同 的抗原结合特异性CGMCC编号2114、2115、和2116。
2.一种抗体或其抗原结合片段，其至少包含选自下组的重链CDR3氨基酸序列或其具 有一处或多处保守氨基酸替代的变体FAQGALKSED(SEQID NO. 2), SEPDGFffEAL(SEQ ID NO. :3)、和ACSNKIGRFV(SEQ IDNO. :4)，其中所述抗体或其片段特异性结合凝溶胶蛋白。
3.—种连续细胞系，其生成单克隆抗体，其中所述单克隆抗体与由选自下组的杂交瘤 细胞系所生成的抗体结合相同的抗原决定簇CGMCC编号2114、2115、和2116，其中所述细 胞系是通过融合如下的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞的过程生成的，所述淋巴细胞是自用癌 瘤细胞或其免疫原性决定簇免疫的小鼠衍生的。
4.一种分离的核酸，其编码权利要求1-2任一项的抗体或其抗原结合片段。
5.一种载体，其包含权利要求4的核酸。
6.权利要求5的载体，其进一步包含与所述核酸分子可操作连接的启动子。
7.一种宿主细胞，其包含权利要求5的载体。
8.一种用于制备免疫特异性结合多肽SEQ ID NO. :1的抗体或其片段的方法，该方法 包括(a)在提供所述抗体或其片段表达的条件下培养含有依照权利要求4的核酸的细胞；并(b)回收所表达的抗体或其片段。
9.一种分离的凝溶胶蛋白表位，其包含选自下组的氨基酸序列FAQGALKSED(SEQ ID NO. 2) ,SEPDGFffEAL (SEQ ID NO. :3)、和ACSNKIGRFV(SEQ ID NO. :4)，其中所述表位受到能 够结合全长人凝溶胶蛋白的抗体识别。
10.一种抗体或其抗原结合片段，其是通过制备含有权利要求9所述的表位的免疫原 而生成的。
11.一种用于测定生物学样品中凝溶胶蛋白的存在或量的方法，包括(a)使生物学样品与一种或多种如下的抗体或其抗原结合片段在所述抗体或其片段特 异性结合凝溶胶蛋白的条件下接触，所述抗体或其抗原结合片段具有由选自下组的保藏细 胞系所产生的相同抗原结合特异性=CGMCC编号2114、2115、和2116 ；并(b)检测结合至凝溶胶蛋白的抗体或其片段的存在或量，由此测定所述样品中凝溶胶 蛋白的存在或量。
12.权利要求11的方法，其中在ELISA中使所述样品与所述抗体或抗原结合片段接触。
13.权利要求12的方法，其中所述接触步骤包括将第一抗体结合至基片，接触所述样 品，并将第二抗体结合至所述基片，其中所述第二抗体包含可检测标记物。
14.权利要求13的方法，其中所述第一抗体与由杂交瘤细胞系CGMCC编号2115所生成 的抗体结合相同的抗原决定簇，而所述第二抗体与由选自下组的杂交瘤细胞系所生成的抗 体结合相同的抗原决定簇CGMCC编号2114和2116。
15.一种用于在第一哺乳动物受试者中测定与凝溶胶蛋白多肽水平改变有关的疾病或 状况的存在或素因的方法，该方法包括下列步骤(a)提供来自第一哺乳动物受试者的测试样品；(b)使所述来自第一哺乳动物受试者的测试样品与一种或多种结合凝溶胶蛋白多肽的化合物接触以形成化合物/凝溶胶蛋白多肽复合物，其中所述化合物是具有由选自下组的 杂交瘤细胞系所产生的相同抗原结合特异性的抗体或其抗原结合片段CGMCC编号2114、 2115、和 2116 ；(c)检测化合物/凝溶胶蛋白多肽复合物的水平；(d)量化所述来自第一哺乳动物受试者的样品中的凝溶胶蛋白多肽表达水平；并(e)比较步骤(a)的样品中的凝溶胶蛋白多肽量与来自已知未患有所述疾病或状况或 者没有所述疾病或状况的素因的第二哺乳动物受试者的对照样品中存在的多肽量，其中与 所述对照样品相比所述第一受试者中凝溶胶蛋白多肽表达水平改变指明所述疾病或状况 的存在或素因。
16.权利要求15的方法，其中在ELISA中使所述样品与所述化合物接触。
17.权利要求16的方法，其中所述接触步骤包括将第一抗体结合至基片，接触所述样 品，并将第二抗体结合至所述基片，其中所述第二抗体包含可检测标记物。
18.权利要求17的方法，其中所述第一抗体与由杂交瘤细胞系CGMCC编号2115所生成 的抗体结合相同的抗原决定簇，而所述第二抗体与由选自下组的杂交瘤细胞系所生成的抗 体结合相同的抗原决定簇=CGMCC编号2114和2116。
19.权利要求15的方法，其中所述与凝溶胶蛋白水平改变有关的疾病或状况选自下 组感染性休克、多器官功能障碍综合征、类风湿性关节炎、中风、心肌梗死、癌症、系统性自 身免疫性疾病、慢性肝炎、化学疗法的副作用、和放射疗法的副作用。
20.一种用于监测哺乳动物受试者中的感染性休克的方法，该方法包括下列步骤(a)依照权利要求11的方法来测量哺乳动物受试者中的凝溶胶蛋白水平；(b)比较第一受试者中的凝溶胶蛋白水平与参照标准，其中所述参照标准包含未患有 感染性休克的对照受试者，且其中与所述参照标准相比所述第一受试者的凝溶胶蛋白水平 降低指明所述哺乳动物受试者患有感染性休克。
21.一种为用于测定化合物预防或治疗医学状况的功效的临床试验选择所包括的哺乳 动物受试者的方法，包括下列步骤(a)依照权利要求11的方法来测量哺乳动物受试者中的凝溶胶蛋白水平；(b)比较第一受试者中的凝溶胶蛋白水平与参照标准，其中所述参照标准包含未患有 影响凝溶胶蛋白水平的疾病或状况的对照哺乳动物受试者，并(c)选择在临床试验中所包括的哺乳动物受试者，其中所述哺乳动物受试者的凝溶胶 蛋白水平与所述参照标准的凝溶胶蛋白水平相似。
22.一种用于为受试者选择预防性或治疗性处理的方法，包括下列步骤(a)依照权利要求11的方法来测量哺乳动物受试者中的凝溶胶蛋白水平；(b)基于所述受试者的凝溶胶蛋白水平将所述受试者归入受试者类；并(c)基于所述受试者类选择预防性或治疗性处理。
23.—种纯化凝溶胶蛋白的方法，该方法包括下列步骤(a)使包含凝溶胶蛋白的生物学样品与至少一种固定化的抗体或其抗原结合片段在所 述抗体或其片段特异性结合凝溶胶蛋白的条件下接触以形成固定化的凝溶胶蛋白抗体复 合物，其中所述抗体或其抗原结合片段具有由选自下组的保藏细胞系所产生的相同抗原结 合特异性=CGMCC编号2114、2115、和2116 ；并(b)自所述固定化的凝溶胶蛋白抗体复合物回收所述凝溶胶蛋白。
24.权利要求23的方法，其中所述生物学样品包含人血清。
25.—种试剂盒，其包含 一个或多个容器；一种或多种具有由选自下组的保藏细胞系所产生的相同抗原结合特异性的抗体或其 抗原结合片段=CGMCC编号2114、2115、和2116 ；和关于使用其中的内含物的指令。
26.—种试剂盒，其包含(a)用第一抗体包被的ELISA平板；和(b)容器中的第二抗体，其中所述第一和第二抗体是由选自下组的保藏细胞系所生成 的抗体CGMCC 编号 2114、2115、和 2116。
27.权利要求26的试剂盒，其进一步包含一种或多种下列成分人血浆凝溶胶蛋白标 准品、人血浆稀释缓冲液、清洗缓冲液、和底物缓冲液。
全文摘要
一般而言，本发明涉及能结合凝溶胶蛋白多肽的凝溶胶蛋白结合剂(例如抗体)。本发明的凝溶胶蛋白结合剂可单独或组合用于检测测试样品中的凝溶胶蛋白多肽(也称为靶多肽)以及用于纯化天然凝溶胶蛋白蛋白质。凝溶胶蛋白结合剂还可用于在有所需要的受试者中诊断凝溶胶蛋白相关医学状况。本发明提供了用于检测生物学样品中的凝溶胶蛋白的试剂盒。
文档编号C07K16/00GK102119173SQ200780101031
公开日2011年7月6日 申请日期2007年8月15日 优先权日2007年8月15日
发明者余征, 周敏, 沈恩允, 郭菲 申请人:北京同为时代生物技术有限公司