专利名称：：5’-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法
技术领域：
：本发明涉及一种5'-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法。
背景技术：
：5'-胞苷酸可用作于生产核苷酸类药物的原料、中间体以及食品添加剂等，如用于合成三磷酸胞苷(CTP)、聚肌胞(PolyIC)、阿拉胞苷(Ara-C)、2',3'-二脱氧胞苷(DDC)、胞二磷胆碱(CDP-choline)的原料以及与其它核苷酸混合后作为保健品和食品添加剂。在5'-胞苷酸的生产过程中，会产生大量的盐，对产品的纯度有较大的影响，尤其在母液回收中大量的盐大幅降低了回收率和回收产品的质量，所以对于5'-胞苷酸的脱盐纯化是至关重要的。现有的脱盐技术有浓縮结晶法、溶剂法、炭柱交换法等，但是它们都存在着一些缺点1、浓缩结晶法是通过蒸发除去溶剂以提高溶液浓度，溶液中溶质的溶解度下降，溶质便会析出。但是，浓縮结晶法只能实现部分脱盐，而且脱除氯化钠效果很差，若浓縮至浓度太高的话，溶液中的5'-胞苷酸也会一并析出，影响收得率。2、溶剂法是利用溶质在有机溶剂中的溶解度极小的原理，在溶液中加入一定量的有机溶剂，以降低溶质在溶液中的溶解度，溶质便会析出。溶剂法亦存在浓缩结晶法类似的缺点，而且有机溶剂在使用过程中损耗较大，溶剂回收成本较高。3、炭柱交换法是通过活性炭吸附有机物而不吸附无机物的特性达到分离脱盐的目的。基本操作过程是吸附、水洗、洗脱、浓缩结晶等。吸附是将溶液流经活性炭柱，有机物被活性炭吸附，而无机物则随水流出。水洗是用水将残留液洗去。洗脱是利用合适的洗脱剂将吸附在活性炭上的有机物脱附下来。浓縮是将浓度较低的洗脱液蒸发除去溶剂，以提高浓度，再以合适的方式进行结晶，必要时还要脱色。虽然从理论上讲该方法是可行的，但是存在很多的缺点，比如操作过程太长，设备规模庞大，生产周期长，生产成本高，而且每次都要经过酸碱再生，会产生大量的废水和废炭。膜分离技术是20世纪60年代以来发展起来的一项新兴分离技术，是一种利用一张特殊的具有选择性能的薄膜，在外力推动下对混合物进行分离、提纯、浓縮的一种分离方法。根据截留的组分不同，通常将膜分离过程分为微滤(MF)、超滤(UF)、纳滤(NF)、反渗透(RO)、渗析(D)、电渗析(ED)、气体分离(GP)、渗透气化(PV)等。其中纳滤(Nanofiltration)是20世纪80年代末发展起来的介于反渗透和超滤之间的一种新型的压力驱动的膜分离技术，对于分子量介于2002000以上的有机物具有良好的截留性能，对于单价离子和小分子物质的截留率相对较低。
发明内容本发明提供的一种5'-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法，将纳滤膜分离技术应用于5，-胞苷酸及其衍生物的分离和纯化，具有分离过程不发生相变、不发生任何化学反应、不破坏生物活性、无需加热常温操作、步骤简单、选择性高、能耗低等优点，特别适合热敏性物质例如果汁、蛋白质、多肽、氨基酸、药品等的分级分离和浓缩。为了达到上述目的，本发明提供了一种5，-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法，将纳滤膜分离技术应用于5'-胞苷酸及其衍生物的分离和纯化，该方法包含以下步骤步骤l、配制待分离溶液；待分离溶液应达到以下要求溶液应清澈透明，不含异物(如有异物或浑浊应预先过滤)，浓度20%以下，pH值2U，要求脱氯处理；步骤2、将待分离溶液倒入料液槽内；步骤3、进行脱盐操作；步骤3.1、运行设备，压力调节装置调节压力至L02.0MPa，使待分离溶液通过纳滤膜；步骤3.2、收集渗透液，截留液返回料液槽；步骤3.3、控制物料浓度并保持物料在料液糟中的液位，即，当料液糟中的料液减少多少重量(即渗透液收集了多少重量)，就补加相同重量的蒸馏水;步骤3.4、每隔30120分钟分别取渗透液和料液糟内的浓縮液来测定电导率和吸光度(OD)，并且测定料液槽内的物料温度；步骤3.5、连续36次测得料液糟内浓縮液的电导率小于100010000ps/cm时脱盐结束；步骤4、进行浓缩操作；步骤4.1、将料液槽内物料补足到进行步骤2时的初始重量；步骤4.2、运行设备，压力调节装置调节压力至1.02.0MPa,使待分离溶液通过纳滤膜；步骤4.3、收集渗透液，截留液返回料液槽；步骤4.4、每隔30120分钟分别测定渗透液和料液糟内浓縮液的电导率和吸光度，以及料液槽内的物料温度；步骤4.5、流速低于1050L/h或料液槽内溶液体积就剩下1/51/3时停止浓縮操作。在上述5'-胞苷酸及其衍生物的分离纯化过程中，料液槽夹套以冷却水降温，使温度控制在2050'C。本发明提供的一种5'-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法，将纳滤膜分离技术应用于5，-胞苷酸的脱盐和浓縮是十分可行的，而且适用于工业化生产。具体实施例方式以下具体说明本发明的较佳实施例1、试剂1)、5，-胞苷酸(上海新浦化工厂有限公司生产)，纯度大于98%;2)、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、磷酸二氢钠，均为分析纯；3)、蒸馏水，电导率小于10us/cm;4)、对照溶液20%5，-胞苷酸溶液，用10。/。氢氧化钠溶液调pH5;10%5，-胞苷酸溶液，用10M氢氧化钠溶液调pH5;4%5，-胞苷酸溶液，用10n/。氢氧化钠溶液调pH5;1%氯化钠溶液；2、仪器-DDS-IIA型电导率仪(上海雷磁仪器厂)来测定电导率；pHS-2F型pH计(上海雷磁仪器厂)来测定pH值；757型紫外-可见分光光度计(上海分析仪器厂)来测定吸光度；LC-10ATVP高效液相色谱仪(岛津仪器公司)来测定纯度(HPLC);3、实验设备纳滤膜元件NF2540;实施例1步骤l、配制待分离溶液；取5'-胞苷酸1.5kg，氯化钠1.5kg，磷酸二氢钠lkg，加蒸馏水35kg，用30%氢氧化钠溶液将pH值调到5.0±0.1后加蒸馏水至总重量38kg;步骤2、将待分离溶液倒入料液槽内；步骤3、进行脱盐操作；步骤3.1、运行设备，压力调节装置调节压力至1.21.5MPa,使待分离溶液通过纳滤膜；步骤3.2、收集渗透液，截留液返回料液槽；步骤3.3、控制物料浓度并保持物料在料液糟中的液位，即，当料液糟中的料液减少重量10kg(即渗透液收集10kg)时补加蒸馏水10kg;步骤3.4、每隔30分钟，分别取渗透液和料液糟内的浓縮液来测定电导率和吸光度(OD)，并且测定料液槽内的物料温度；步骤3.5、连续三次测得料液糟内浓縮液的电导率小于1000(^s/cm时脱盐结束；步骤4、进行浓縮操作；步骤4.1、将料液槽内物料补足到进行步骤2时的初始重量；步骤4.2、运行设备，压力调节装置调节压力至1.21.5MPa,使待分离溶液通过纳滤膜；步骤4.3、收集渗透液，截留液返回料液槽；步骤4.4、浓度每上升1%(30120分钟)，分别测定渗透液和料液糟内浓缩液的电导率和吸光度，以及料液槽内的物料温度；步骤4.5、流速低于10L/h或重量低于12Kg时停止浓縮操作。实验结果参照下表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例2步骤l、配制待分离溶液；取5，-胞苷酸车间粗制合成生产中萃取分层后的水相15Kg，加蒸馏水22Kg稀释，用30%氢氧化钠溶液将pH值调到5.0±0.1，此溶液中约含5，-胞苷酸2.65kg，无机盐主要是氯化钠和磷酸二氢钠；步骤2、将待分离溶液倒入料液槽内；步骤3、进行脱盐操作；步骤3.1、运行设备，压力调节装置调节压力至1.21.5MPa，使待分离溶液通过纳滤膜；步骤3.2、收集渗透液，截留液返回料液槽；步骤3.3、控制物料浓度并保持物料在料液糟中的液位，g卩，当料液糟中的料液减少重量10kg(即渗透液收集10kg)时补加蒸馏水10kg;步骤3.4、每隔30分钟，分别取渗透液和料液糟内的浓缩液来测定电导率和吸光度(OD)，并且测定料液槽内的物料温度；步骤3.5、连续三次测得料液糟内浓缩液的电导率小于lOOOO^is/cm时脱盐结束；步骤4、进行浓縮操作；步骤4.1、将料液槽内物料补足到进行步骤2时的初始重量；步骤4.2、运行设备，压力调节装置调节压力至1.21.5MPa，使待分离溶液通过纳滤膜；步骤4.3、收集渗透液，截留液返回料液槽；步骤4.4、浓度每上升1%(30120分钟)，分别测定渗透液和料液糟内浓縮液的电导率和吸光度，以及料液槽内的物料温度；步骤4.5、流速低于10L/h或重量低于12Kg时停止浓縮操作。实验结果参照下表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4、结果讨论1)、纳滤膜分离技术应用于5'-胞苷酸及其衍生物的分离和纯化中的脱盐效果测定对照溶液的电导率，得到如下20%5'-胞苷酸溶液(pH5)电导率约为8500iis/cm;10%5'-胞苷酸溶液(pH5)电导率约为7800ys/cm;4%5，-胞苷酸溶液(pH5)电导率约为7000us/cm;1%氯化钠溶液电导率约为7600Ps/cm;故本实验以连续三次测得料液糟内浓縮液的电导率小于10000us/cm为脱盐操作的终点，视为无机盐基本脱除。从表1和表2中看出浓縮液的电导率接近对照溶液的电导率，渗透液中电导率表明氯化钠低于1%，即脱盐率达99%以上，无机盐基本脱除，脱盐效果很明显。2)、纳滤膜分离技术应用于5，-胞苷酸及其衍生物的分离和纯化中的截留效果纳滤的截留效果以截留率来表示，通过测定实验前后溶液的吸光度以及重量来计算截留率。计算方法为截留率=(实验后物料的吸光度X重量)/(实验前物料的吸光度X重量)X100°/o。结果表明，实施例1的截留率为98.44%，实施例2的截留率为97.84%，截留效果非常好。3)、纳滤膜分离技术应用于5，-胞苷酸及其衍生物的分离和纯化中的纯化效果实验前后，分别对溶液进行高压液相色谱分析，结果见下表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结果表明，通过纳滤膜分离纯化后，溶液的纯度明显上升，纯化效果明显。4)、纳滤膜分离技术应用于5'-胞苷酸及其衍生物的分离和纯化中的浓缩效果纳滤浓縮过程中由于物料的浓度越来越高，膜的通量也越来越低，通过实验发现对于5，-胞苷酸在1.5MPa压力下纳滤的浓度可以达到20%以上，如果需要更高的浓度，只需调高压力即可，由此可见纳滤的浓縮效果也是非常好的。浓縮的方法很多，常用的是减压蒸发浓缩，相比之下纳滤浓縮更具有不需加热，不破坏物料本身结构，操作简单，能耗低等优势。5)、压力对于纳滤性能的影响纳滤属于压力驱动型膜分离技术，浓度不变的情况下，压力越高膜的通量越大，也就是透过的越快。为了平衡浓度上升引起的通量下降必须适时提高运行的压力，以保证合适的通量。但是压力并不是越高越好，过高的压力会使膜的寿命下降，而且截留率也会下降，通过实验我们选定压力控制在1.02.0MPa是比较合适的，不会产生任何影响。6)、温度对于纳滤性能的影响由于泵的运行以及膜的渗透会使物料温度上升，温度上升会影响膜分离的效果，截留效果会有所下降，所以应在夹套以低温冷却水循环降温，以确保料温在较低的情况下进行，运行温度定为2050°C。权利要求1.一种5’-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法，其特征在于，将纳滤膜分离技术应用于5’-胞苷酸及其衍生物的分离和纯化，该方法包含以下步骤步骤1、配制待分离溶液；步骤2、将待分离溶液倒入料液槽内；步骤3、进行脱盐操作；该步骤中，包含待分离溶液通过纳滤膜的步骤；步骤4、进行浓缩操作；该步骤中，包含待分离溶液通过纳滤膜的步骤。2.如权利要求1所述的5'-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法，其特征在于，所述的步骤l中，待分离溶液应达到以下要求溶液应清澈透明，不含异物，如有异物或浑浊应预先过滤，浓度20%以下，pH值211，要求脱氯处理。3.如权利要求1所述的5，-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法，其特征在于，所述的步骤3包含以下步骤步骤3.1、运行设备，压力调节装置调节压力至1.02.0MPa，使待分离溶液通过纳滤膜；步骤3.2、收集渗透液，截留液返回料液槽；步骤3.3、控制物料浓度并保持物料在料液糟中的液位，即，当料液糟中的料液减少多少重量，就补加相同重量的蒸馏水；步骤3.4、每隔30120分钟分别取渗透液和料液糟内的浓縮液来测定电导率和吸光度，并且测定料液槽内的物料温度；步骤3.5、连续36次测得料液糟内浓縮液的电导率小于100010000|is/cm时脱盐结束。4.如权利要求1所述的5，-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法，其特征在于，所述的步骤4包含以下步骤步骤4.1、将料液槽内物料补足到进行步骤2时的初始重量；步骤4.2、运行设备，压力调节装置调节压力至L02.0MPa，使待分离溶液通过纳滤膜；步骤4.3、收集渗透液，截留液返回料液槽；步骤4.4、每隔30120分钟分别测定渗透液和料液糟内浓縮液的电导率和吸光度，以及料液槽内的物料温度；步骤4.5、流速低于1050L/h或料液槽内溶液体积就剩下1/51/3时停止浓縮操作。5.如权利要求3或4所述的5'-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法，其特征在于，在5，-胞苷酸及其衍生物的分离纯化过程中，料液槽夹套以冷却水或冷冻盐水降温，使温度控制在2050°C。6.—种将纳滤膜分离技术应用于对5'-胞苷酸及其衍生物进行分离纯化的新用途。全文摘要本发明提供一种5’-胞苷酸及其衍生物的分离纯化方法，将纳滤膜分离技术应用于5’-胞苷酸及其衍生物的分离和纯化，分离纯化过程包含脱盐操作和浓缩操作。本发明具有分离过程不发生相变、不发生任何化学反应、不破坏生物活性、无需加热常温操作、步骤简单、选择性高、能耗低等优点。文档编号C07H19/00GK101648984SQ20081004419公开日2010年2月17日申请日期2008年12月25日优先权日2008年12月25日发明者杰杨,瞿国良,莹苏申请人:上海新浦化工厂有限公司