专利名称：用于制备抗肿瘤抗体的tm4sf3蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于制备抗肿瘤抗体的TM4SF3蛋白及其应用。具体的本发明涉及用于制备抗肿瘤抗体的TM4SF3蛋白及其编码核苷酸序列；涉及抗TM4SF3蛋白的抗体及其制备方法、在生产治疗各种相关肿瘤的各种生物制剂中的用途；另外还涉及包括该抗体的药物组合物及其在体内抑制肿瘤的用途，从而达到治疗肿瘤的效果。
背景技术：
肿瘤是人类最常见的疾病之一，其死亡率在世界和我国的各种疾病中分别排在第二位和第三位，严重影响着人类的健康。在我国随着社会的发展，肿瘤的发病率还在逐年上升。我国目前有癌症患者约450万人，死亡率在30%以上，而且每年新增的患者人数高达200万人以上。有效地医治癌症已是科学研究中的当务之急。临床治疗癌症的方法主要是手术切除和放、化疗，但是，放、化疗在杀死癌细胞的同时，给人体正常细胞也带来了严重的损伤。前治疗恶性肿瘤的手术，放疗，化疗三大常规治疗手段并没有明显的降低肿瘤的死亡率，其5年生存率仅达10-30%，因此全世界各国均在始终不懈的探索，力图寻找出更有效的治疗手段。随着对肿瘤研究的不断深入，人们开始尝试采用生物方法针对肿瘤发展进程中的不同层面进行治疗并且已经取得了令人欣喜的效果，肿瘤的生物靶向治疗必将成为最有前景和最活跃的领域。癌症的靶向治疗很重要，"靶向"是癌症治疗中必须遵守的原则，高效、准确地命中癌症这个"耙"，实现有的放矢是癌症治疗的关键所在。因此，找到高效、特异的靶点是肿瘤生物靶向治疗的关键。蛋白质是生命活动的载体，临床上使用的各种药物中有80%是针对蛋白质的。当前，寻找肿瘤粑向治疗的耙点的研究主要集中在各种在肿瘤中异常表达的蛋白上。 一般认为这种白蛋须具有以下一些特性1)在肿瘤组织中特异表达。即该蛋白在肿瘤组织中表达明显高于正常组织；或该
4蛋白在肿瘤中的细胞学定位明显异于正常组织，而这一异常定位使得相关药物能较容易到达。2)该蛋白在肿瘤细胞中具有功能，药物与蛋白作用后能明显抑制肿瘤的临床进展，而对正常的组织没有明显的毒副作用。3)目前，在各种生物治疗手段中，最成功的是抗体类药物，由于抗体本身的特性，要求抗体靶向的靶点必须是膜蛋白。近年来，
治疗肿瘤的抗体药物的研究开发取得了突破性进展。Rituxan是1997年第一个获FDA批准上市的抗肿瘤抗体药物，用于治疗B细胞性非何杰金淋巴瘤。Herceptin于1998年获批准，主要用于HER-2/neu阳性的乳腺癌。Mylotarg (2000)用于治疗急性复发性髓性白血病。近年来，先后获批准用于治疗肿瘤的抗体药物还有Campath-lH、 Zevalin、Bexxer、 Erbitux和Avastin等。目前，为数众多的治疗肿瘤的抗体药物正在进行临床前与临床研究。
目前，已经公开报道的抗体内药物针对的肿瘤治疗靶点主要有以下一些。它们或者参与了肿瘤的生长过程，或者在肿瘤的转、耐药性的诱导的过程中发挥作用。已经上市的抗体类药物的靶点包括CD20,用于治疗B细胞性非何杰金淋巴瘤；Her2-neo，用于治疗乳腺癌和肺癌等；CD33，用于治疗急性复发性髓性白血病；CD52， B细胞性慢性淋巴细胞性白血病；EGRFR，用于治疗晚期直、结肠癌；VEGF，用于治疗治疗晚期结、直肠癌；CD25，用于治疗白血病；C017-1A，用于治疗结肠癌等。其他的抗体类药物的靶点还包括CEA、 CD22、 GD2、EGFR、 IGN-101、 EGF、 1D10、 CD6、 CDlla、 huJ591、 ACA-125等。(Grillo-Lopez AJ.抗CD20的单抗白血病的治疗的策略和结果。抗肿瘤治疗经验综述，2002;2:323-329; (Grillo-Lopez AJ. AntiCD20 mAbs:modifying therapeutic strategies and outcomes in the treatment oflymphoma patients, Expert Rev Anticancer Ther. 2002;2:323-329 )StadtmauerEA,使用Mylotarg联合化疗的方法治疗急性髓性白血病，临床淋巴瘤，2002;2 suppl 1:S24-S28,( Stadtmauer EA, Trials withgemtuzumab ozogamicin (Mylotarg) combined with chemotherapyregimens in acute myeloid leukemia, Clin Lymphoma, 2002;2 suppl1 :S24-S28,) Pangalis GA, Dimopoulou MN， Angelopoulou MK等，应用Campath-1H (抗CD52)单抗治疗淋巴细胞增生疾病，抗肿瘤医学，
52001;18:99-107， (Pangalis GA， Dimopoulou顧，Angelopoulou MK， etal.Campath-lH (anti-CD52) monoclonal antibody therapy inlymphoproliferative disorders, Med Oncol, 2001;18:99-107) ，Leonard JP，Link BK,使用HLL2 (epratuzumab， 一种抗CD22单抗)和人1D10(apolizumab)治疗非何杰金氏淋巴瘤，抗肿瘤研究，2002;29(1 suppl2):81-86， (Leonard JP， Link BK, Immunotherapy of non-Hodgkin'slymphoma with hLL2 (epratuzumab, an anti-CD22 monoclonal antibody)and HulDIO (apolizumab), Semin Oncol.2002;29(1 suppl 2):81-86)Slamon DJ, Clark GM, Wong 等人乳腺癌的复发与预后与HER-2/neu癌基因扩增的相关性，科学,1987;235:177-182，(Slamon DJ,Clark GM, Wong SG， et al， Human breast cancer: correlation of relapse andsurvival with amplification of the HER-2/neu oncogene, Science,1987;235:177-182) Mendelsohn J, Baselga J. EGF受体家族作为肿瘤耙向治疗的耙点，癌基因，2000;19:6550-6565， (The EGF receptor familyas targets for cancer therapy, Oncogene, 2000;19:6550-6565) Rosen LS,
应用血管生成抑制因子的临床经验聚焦血管内皮细胞生长因子，肿瘤
控制，2002;9(2 s卿l):36-44, (Rosen LS, Clinical experience withangiogenesis signaling inhibitors: focus on vascular endothelial growthfactor (VEGF) blockers, Cancer Control, 2002;9(2 suppl):36-44 )Schwartzberg LS， Edrecolomab的临床经验 一种治疗结肠癌的单抗，抗肿瘤血液学的综述，2001;40:17-24 (Schwartzberg LS， Clinical experiencewith edrecolomab: a monoclonal antibody therapy for colorectal carcinoma:Crit Rev Oncol Hematol, 2001;40:17-24) Foon KA， Lut勿J, Baral RN,等用抗独特型抗体模拟CD2抗原作为疫苗免疫进展性黑色素瘤的临床和免疫反应。临床抗肿瘤杂志，2000;18:376-384, (Foon KA, Lutzky J,Baral RN, et al, Clinical and immune responses in advanced melanomapatients immunized with an anti扁idiotype antibody mimickingdisialoganglioside GD2, J Clin Oncol.2000;18:376-384))
尽管已经有了几十种针对不同的蛋白耙点的抗肿瘤单抗药物，对临床的需要来说仍然是远远不够的，仍然需要发展更多的抗体类抗肿瘤药物。这主要是由于肿瘤发生发展是一个多因素，多基因突变的过程，仅仅一两种针对各别信号通路的抗体并不能阻止肿瘤的进展，而
6只能延缓这一过程；另外不同的肿瘤有不同的发病机理，需要有不同 的治疗药物。
本发明人的研究表明TM4SF3位于肿瘤的细胞膜上，并且参与了肿 瘤的生长和转移过程，因此该蛋白具有作为抗肿瘤药物靶标的潜力。
发明内容
基于在治疗肿瘤领域中目前的需要，为了发展能够更好用于研发 和制备治疗肿瘤的药物，本发明一方面公开了具有氨基酸序列如SEQ IDNO:l、 2、 3或4所示的TM4SF3蛋白或其片段，该TM4SF3位于 人肿瘤细胞膜上，并能够作为制备抗肿瘤药物的人肿瘤细胞抗原；另 外本发明提供的TM4SF3蛋白或其片段作为靶标可以用于筛选多种抗 肿瘤药物。
另一方面，本发明提供了以TM4SF3蛋白或其片段作为抗原而制 备的抗体及其衍生物。所述的抗体衍生物优选是核素偶联抗体、1311标 记抗体或纳米磁性颗粒偶联抗体。所述的抗体及其衍生物可以用于制 备用于治疗肿瘤复发、转移的药物。
再一方面，本发明提供了通过TM4SF3蛋白或其片段作为耙标筛 选得到的具有抗肿瘤活性的组分。该组分优选是抗体、多肽、小分子 化合物。
第四方面，本发明提供了抑制TM4SF3蛋白或其片段活性的组分 在制备治疗哺乳动物包括人的肿瘤发生、生长或转移的药物中的用途。 所述组分优选是抗体、多肽、小分子化合物；所述的肿瘤优选是食管 癌或其他阳性表达TM4SF3蛋白的肿瘤。
第五方面，本发明提供了一种包括由TM4SF3蛋白制备的抗体及 其衍生物或者由TM4SF3蛋白筛选得到的抗肿瘤的组分的药物组合物， 以及所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的发生、生长或转移的药物中 的用途。所述的肿瘤优选是食管癌或其他阳性表达TM4SF3蛋白的肿 瘤。
本发明的有益效果在于以本发明提供的TM4SF3蛋白及其片段 作为抗原，制备得到的抗体具有良好的抗肿瘤生长、转移和复发的作 用；以本发明的提供的TM4SF3蛋白及其片段可以作为抗肿瘤免疫导向治疗的靶位，筛选得到潜在的或具有良好抗肿瘤生长、转移和复发 的药物组分，并进而获得具有抗肿瘤活性的药物组合物。
图1显示Western Bloting检测TM4SF3在食管癌(T)及其配对正 常组织(N)中表达情况，P-肌动蛋白确保恒定上样量的内参。结果 表明TM4SF3蛋白在食管癌组织高频表达上调。
图2显示抗TM4SF3抗体对食管癌肺转移的作用，结果表明抗 TM4SF3抗体治疗组中，癌细胞基本没有转移，而在用PBS处理的对 照组中和正常鼠IgG治疗组中，癌细胞存在明显的肺转移。
具体实施例方式
本发明提供一种具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的蛋白。所 述的蛋白是人肿瘤细胞抗原。所述的蛋白是通过宿主细胞表达而获得。 所述的蛋白，作为抗原位于肿瘤细胞的细胞膜，其具有免疫原性。其 特征在于该抗原部分多肽序列位于肿瘤细胞膜外。
本发明还提供一种以具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的蛋 白制得的抗体或其他针对该蛋白的药物的方法。该抗体是抗肿瘤抗体。 该抗体可以是兔、羊、马、鼠源的多克隆抗体或单克隆抗体。根据业 界公知的方法，以蛋白TM4SF3作为靶位还可以筛选多种抗肿瘤药物， 如抗体、多肽、小分子等药物。
本发明还提供含有如SEQ ID NO:l所述的氨基酸序列的蛋白或者 融合蛋白。
本发明进一步提供一种由所述的抗体衍生而来的抗体衍生物，该 衍生物为核素-抗体偶联物、化学药物-抗体偶联物、毒素-抗体偶联物、 前体药物酶-抗体偶联物、纳米颗粒-抗体偶联物。
本发明还提供所述的抗体在制备治疗肿瘤及抑制肿瘤生长、复发、 转移的药物中的应用。
本发明再提供一种药物组合物，其特征在于包括本发明的抗体或 者本发明的抗体衍生物的肿瘤化疗药物。
换言之，根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种新的人肿瘤细胞抗原及其多肽序列，所述抗原多肽具有以下氨基酸残基序列
(SEQ ID NO:l)。
包含该抗原的蛋白TM4SF3在肿瘤细胞的细胞膜表达，抑制该抗 原的功能就能够抑制肿瘤细胞在体内的生长和转移。因此，该抗原可 作为抗人肿瘤免疫导向治疗的靶位。根据业界公知的方法，以蛋白 TM4SF3作为靶位还可以筛选多种抗肿瘤生长、转移、复发的药物，如 抗体、多肽、小分子等药物。
本发明还涉及一种编码如上述抗原的氨基酸残基序列的DNA序 列以及以该DNA序列为耙设计生产各种核酸药物的方法。根据业界公 知的方法，可以设计出针对该DNA序列的小RNA药物及以病毒载体 为载体的其他核酸药物。
在本发明中，所述的抗原是指包含上述氨基酸残基序列的任何蛋 白质或融合蛋白质；编码该抗原的DNA是指任何根据公认的三联密码 子翻译后编码含有上述氨基酸残基序列。
本发明所述的抗原是通过使用TM4SF3蛋白的多克隆抗体作免疫 组织化学和免疫细胞荧光时发现该蛋白表达于肿瘤细胞膜上。 ' 本发明另外还涉及一种制备抗肿瘤的抗体的方法。
根据本发明提供的新的抗肿瘤抗原，采用本领域技术人员公知的 方法和技术很容易获得其相应的单克隆抗体及衍生物。采用该抗原免 疫小鼠，在检测鼠血清中相应的特异抗体的含量后，处死动物获得脾 细胞，经过与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，再经抗原特异性试验筛选， 即可获得鼠单克隆抗体。将鼠单克隆抗体的可变区基因克隆，并与相 应的人恒定区正确连接后，再次克隆入真核表达载体并导入真核细胞 表达，即可获得人-鼠嵌合抗体。采用该抗原筛选人噬菌体抗体库，或 采用人外周血单核细胞嵌合小鼠技术，可获得相应的全人抗体。
本发明还提供了所述的抗体或衍生物在制备的药物或含有该抗体 的药物组合在治疗人肿瘤中的应用。
该肿瘤抗原的相应抗体或其衍生物可以用来免疫导向治疗肿瘤。 根据本领域技术人员公知的原理可以推断任何人类肿瘤，只要在此类 肿瘤细胞膜上表达该蛋白，即该肿瘤抗原存在于肿瘤细胞膜上，就可 以使用该肿瘤抗原的相应抗体或其衍生物进行免疫导向治疗。该抗体
9或其衍生物可以直接通过各种方式注入患者的体内，与位于肿瘤细胞 表面的抗原，抑制肿瘤的生长。标记有核素或化疗药物的抗体可以将 核素或化学药物带到肺癌组织局部，从而减少核素或化疗药物的毒性， 大大增加它们杀伤肺癌细胞的作用。纳米磁性颗粒偶联的抗体将纳米 磁性颗粒浓聚于肺癌病灶局部，高频交变磁场的作用下发热，杀伤周 围的癌细胞，起到治疗癌症的目的。将该抗原相应抗体与效应分子融 合，如毒素PE40，可以将效应分子浓聚于癌病灶，使效应分子最大程 度地发挥作用，起到治疗人肿瘤的作用。
总之，利用本发明提供的前述人肿瘤抗原相应抗体，就可以方便地 生产目前已知的各种衍生物用于肿瘤的治疗。
下面将参照附图结合实施例详细说明本发明所涉及的发明主题以 及应用本发明中的新肿瘤抗原、其相应抗体以及各种衍生物来实施肿 瘤的治疗等具体实施方式
。
实施例
实施例l:新的人肿瘤抗原的制备
按照本领域的现有技术，以TM4SF3基因的cDNA序列作为模板， 采用引物5'-ATAGATATCGACAAGCCTGTAACGAA-3，(正向引物， 含有 EcoRV 酶切位点和 Xhol 酶切位点)和 5'-GATCTCGAGGTTCCCGATCTGG-3，(反向引物含有XhoI酶切位点)， 通过PCR技术克隆TM4SF3基因的cDNA编码序列。对克隆得到的 PCR产物经测序验证为正确的TM4SF3基因的cDNA序列后，按照本 领域常规技术将该序列构建在表达载体PET-30b中，获得重组载体 PET-30b- M4SF3。然后将所述的重组载体PET-30b-TM4SF转化原核细 胞，获得相应的重组原核细胞，并在适合该重组载体表达的条件下使 得TM4SF3基因表达从而获得TM4SF3蛋白。
表达得到的TM4SF3蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO: 1。
另一方面，可以将TM4SF3基因的cDNA全长序列克隆到其他含 有特定序列的载体上，从而形成TM4SF3蛋白的衍生物。本发明所指 的TM4SF3蛋白的衍生物是指通过对TM4SF3蛋白取代、缺失或添加
10变TM4SF3蛋白功能的蛋白衍生物，即不改 变本发明公开的TM4SF3蛋白的用于制备抗肿瘤抗体的功能。所述的
衍生物可以是(1)其中一个或多个氨基酸被保守或非保守的氨基酸 残基取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；
(2) 是其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团所取代；
(3) 是属于成熟多肽与其他化合物融合，或者与其他诸如前导序列、 分泌序列、用于纯化此序列的序列等构成融合多肽。例如将TM4SF3 基因的cDNA全长序列克隆到含有GST标签的载体上，例如PGEX-3X 载体，从而获得GST-TM4SF3融合蛋白，即在该蛋白的N端加上了G ST的序列，但这并不改变TM4SF3蛋白的性质。还可以将本蛋白的 c DNA序列克隆到含有其他表达标签的载体，如含有H i s标签的 PET载体等中，已构成TM4SF3蛋白的其他衍生物。
另外，也可以将TM4SF3蛋白中的实现本发明要求保护的TM4SF3 蛋白功能的关键序列(胞外区序列，如SEQIDNo.2和SEQIDNo.5) 单独表达或连接到含有标签的载体中构成融合蛋白，而不表达该蛋白 全序列，这也构成本发明要求保护的TM4SF3蛋白的一类衍生物。如 将本蛋白胞外端氨基酸序列(SEQIDNo.2)对应的c DNA序列克隆 到含有GS T标签的载体中，然后进行表达，则获得GST与TM4SF3 胞外区序列肽段的融合蛋白。例如，还可以合成本蛋白中的关键肽段，
(SEQIDNO: 4)，然后在一端或两端添加半胱氨酸后偶联于匙孔血蓝 蛋白(KLH)上，用于动物免疫制备抗体或其他小分子靶向药物， 这也属于本发明的蛋白衍生物的一类。本领域技术人员可以理解， TM4SF3蛋白的衍生物并不限于上述内容，还包括对TM4SF3蛋白的 其他修饰和改变。
实施例2: TM4SF3在食管癌组织高表达
通过Westen检测，本发明人发现TM4SF3蛋白在食管癌组织中高 频表达上调。
Westen检测14对食管癌(T)及其配对的癌旁正常食管上皮组织 标本(N)中TM4SF3蛋白的表达情况。提取每例组织总蛋白，用
iiSDS-PAGE电泳和Westen检测对获得的各个组织的总蛋白进行检测。 SDS-PAGE电泳上样的每例组织样品的总蛋白为50ug。 Westen检测结 果表明所有14对食管癌及其配对的癌旁正常食管上皮组织中有11例 食管癌组织中的TM4SF3表达上调，上调率达到78.6% (图1)。因此， TM4SF3蛋白是特异的人肿瘤抗原，可用于进一步的制备抗肿瘤抗体的 研制中。
实施例3:新的人肿瘤抗原相应抗体的制备
采用实施例1得到的200吗人肿瘤抗原(TM4SF3蛋白)或其片段， 等体积混合完全福氏佐剂共200ul，采用皮下免疫的方式免疫新西兰家 兔，2周后采用200pg抗原蛋白或其片段混合不完全福氏佐剂皮下加强 免疫，1周后采用完全弗氏佐剂乳化50-60mg卡介苗蛋白双侧脚掌注 射，1周后采用200(ag抗原蛋白或其片段等体积混合不完全福氏佐剂共 200ul两侧胭窝淋巴结内注射，10天后采血使用常规方法测效价，发 现血清的效价>1:108，处死动物，收集兔血清，使用本领域技术人员已 知的方法，例如采用抗原亲和纯化法从兔血清中纯化抗TM4SF3或其 片段的抗体。
实施例4:新的人肿瘤抗原相应抗体衍生物的制备
(一)核素-抗体偶联物
(1) ^Re标记新的人肿瘤抗原相应鼠单抗
SnCl2直接还原法标记实施例3获得的抗体，立即快速薄层层析 (ITLC)测定抗体的标记效率及放化纯度。标记后，ITLC实验表明188Re-抗体标记率为91%，放化纯度大于94。/。。"SRe-抗体比活为347MBq/mg。 ELISA测得^Re-抗体免疫活性为66%。标记抗体的体外稳定性实验 表明，抗体在37。C孵育24hr，无论是在生理盐水还是人血清白蛋白中， 放射性脱落都小于5%，示其在体外稳定。
(2) 1311标记新的人肿瘤抗原相应鼠单抗
氯胺T法标记抗体，立即快速薄层层析(ITLC)测定抗体的标记效率 及放化纯度。标记后，ITLC实验表明1311-抗体标记率为91%，放化纯度大于93%。 '311 -抗体比活为77MBq/mg， ELISA测得1311 -抗体免疫 活性64.3%。
(二)纳米磁性颗粒-抗体偶联物
以纯水将直径约20-50nm的铁氧化物磁性颗粒超声分散，形成胶体 状。按0.2g纳米磁性颗粒加入16mg抗体的比例加入溶于纯水的抗体， 迅速搅拌混合，5min后加入终浓度为1%的BSA，离心并采用1%的 BSA洗涤后备用。
实施例5:采用实施例3得到的人肿瘤抗原相应抗体抑制肿瘤的生
长(以食管癌为例)
取荷人食管癌裸小鼠24只，测量并计算肿瘤体积后，按肿瘤体积 随机分为3组，每组8只。第一组为PBS对照组，每只腹腔注射 200|ilPBS;第二组为正常鼠IgG对照组，每只腹腔注射0.2mg正常鼠 IgG;第三组为新肿瘤抗原相应抗体治疗组，每只腹腔注射实施例得 到的0.2mg肿瘤抗原相应抗体。每两天给药一次，治疗后10次后，处 死动物，分离肿瘤，称取肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组瘤重 量一治疗组瘤重量)/对照组瘤重量X100。/。。显著性检验采用t检验。
结果显示PBS组瘤重1.24士0.47g，正常鼠IgG对照组1.13士0.37g， 新肿瘤抗原相应抗体治疗组0.66士0.25g，新肿瘤抗原相应抗体的抑瘤 率为47.2%， P值小于O.Ol。这些结果显示新肿瘤抗原相应抗体在免疫 导向治疗食管癌癌中有重要的应用价值。
实施例6:采用实施例3得到的人肿瘤抗原相应抗体抑制肿瘤的转
移(以食管癌为例)
取荷人食管癌裸小鼠24只，测量并计算肿瘤体积后，按肿瘤体积 随机分为3组，每组8只。第一组为PBS对照组，每只腹腔注射 200)alPBS;第二组为正常鼠IgG对照组，每只腹腔注射0.2mg正常鼠 IgG;第三组为新肿瘤抗原相应抗体治疗组，每只腹腔注射实施例1得 到的0.2mg肿瘤抗原相应抗体。治疗的第一个月每星期给药两次，一 个月后每五天给药一次，治疗后50天后次后，处死动物，解剖动物
13观察个脏器肿瘤转移情况。显著性检验采用t检验。
结果显示PBS组8只小鼠有7只有明显肺转移，正常鼠IgG对照组 8只小鼠有6只有明显肺转移，新肿瘤抗原相应抗体治疗组8只小鼠有 1只有明显肺转移，新肿瘤抗原相应抗体的能明显抑制食管癌的肺转 移，P值小于0.01 (图2)。这些结果显示新肿瘤抗原相应抗体在免疫 导向治疗食管癌转移中有重要的应用价值。
实施例7:采用新的人肿瘤抗原相应抗体衍生物体内靶向并抑制肿 瘤(以食管癌为例)
取荷人食管癌裸小鼠24只，测量并计算肿瘤体积后，按肿瘤体积 随机分为3组，每组8只。第一组为PBS对照组，每只腹腔注射 200filPBS;第二组为正常鼠IgG对照组，每只腹腔注射9.2MBq(200pl) "il-正常鼠IgG;第三组为偶联1311的新肿瘤抗原相应抗体治疗组，每 只腹腔注射9.2MBq(200|il) 1311-抗体。治疗后10天，处死动物，分离 肿瘤，称取肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组瘤重量—治疗组瘤 重量)/对照组瘤重量X 100%。显著性检验采用t检验。
结果PBS瘤重1.16士0.35g，人IgG对照组1.12土0.41g，标记抗体 治疗组0.41士0.15g，标记抗体的抑瘤率为64.6%， P值小于O.Ol。这 些结果显示新肿瘤抗原相应抗体(实施例3的多克隆抗体)偶联核素 在免疫导向治疗食管癌中有重要的应用价值。
实施例8:采用实施例2得到的人肿瘤抗原相应抗体抑制肿瘤的生
长(以结肠癌为例)
取荷人结肠癌裸小鼠24只，测量并计算肿瘤体积后，按肿瘤体积 随机分为3组，每组8只。第一组为PBS对照组，每只腹腔注射 200 1PBS;第二组为正常鼠IgG对照组，每只腹腔注射0.2mg正常鼠 IgG;第三组为新肿瘤抗原相应抗体治疗组，每只腹腔注射实施例1得 到的0.2mg肿瘤抗原相应抗体。每两天给药一次，治疗后10次后，处 死动物，分离肿瘤，称取肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率=(对照组瘤重 量一治疗组瘤重量)/对照组瘤重量X 100%。显著性检验采用t检验。 结果PBS组瘤重1.45士0.37g，正常鼠IgG对照组1.53士0.39g，新肿瘤
14抗原相应抗体治疗组0.73士0.21g，新肿瘤抗原相应抗体的抑瘤率为
49.7%， P值小于O.Ol。这些结果显示新肿瘤抗原相应抗体在免疫导向 治疗结肠癌中有重要的应用价值。序列表
<110>中国医学科学院肿瘤研究所
< 120>用于制备抗肿瘤抗体的TM4SF3蛋A及其应用
<160> 5
<170> Patentln version 3.4
<210> 1 <211> 237 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Gly Val Ser Ala Cys lie Lys Tyr Ser Met Phe Thr Phe Asn 1 5 10 15
Phe Leu Phe Trp Leu Cys Gly lie Leu lie Leu Ala Leu Ala lie Trp 20 25 30
Val Arg Val Ser Asn Asp Ser Gin Ala lie Phe Gly Ser Glu Asp Val 35 40 45
Gly Ser Ser Ser Tyr Val Ala Val Asp lie Leu lie Ala Val Gly Ala 50 . 55 60
lie He Met lie Leu Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala lie Lys Glu 65 70 75 80
Ser Arg Cys Met Leu Leu Leu Phe Phe He Gly Leu Leu Leu lie Leu 85 90 95
Leu Leu Gin Val Ala Thr Gly lie Leu Gly Ala Val Phe Lys Ser Lys 100 105 110
Ser Asp Arg lie Val Asn Glu Thr Leu Tyr Glu Asn Thr Lys Leu Leu 115 120 125
Ser Ala Thr Gly Glu Ser Glu Lys Gin Phe Gin Glu Ala lie lie Val 130 135 140
Phe Gin Glu Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Val Asn Gly Ala Ala Asp 145 150 155 160
Trp Gly Asn Asn Phe Gin His Tyr Pro Glu Leu Cys Ala Cys Leu Asp165 170 175
Lys Gin Arg Pro Cys Gin Ser Tyr Asn Gly Lys Gin Val Tyr Lys Glu 180 185 190
Thr Cys lie Ser Phe lie Lys Asp Phe Leu Ala Lys Asn Leu lie lie 195 200 205
Val lie Gly lie Ser Phe Gly Leu Ala Val lie Glu lie Leu Gly Leu 210 215 220
Val Phe Ser Met Val Leu Tyr Cys Gin lie Gly Asn Lys 225 230 235
<210> 2
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Lys Ser Lys Ser Asp Arg lie Val Asn Glu Thr Leu Tyr Glu Asn Thr 15 10 15
Lys Leu Leu Ser Ala Thr Gly Glu Ser Glu Lys Gin Phe Gin Glu Ala 20 25 30 .
lie lie Val Phe Gin Glu Glu Phe Lys Cys Cys Gly Leu Val Asn Gly 35 40 45
Ala Ala Asp Trp Gly Asn Asn Phe Gin His Tyr Pro Glu Leu Cys Ala 50 55 60
Cys Leu Asp Lys Gin Arg Pro Cys Gin Ser Tyr Asn Gly Lys Gin Val 65 70 75 80
Tyr Lys Glu Thr Cys He Ser Phe lie Lys Asp Phe Leu Ala Lys Asn 85 90 95
<210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial
<220> <223>
<400> 3
17<formula>formula see original document page 18</formula>
权利要求
1、TM4SF3蛋白或其片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO1、2、3或4所示。
2、 如权利要求1所述的TM4SF3蛋白或其片段在制备抗体中的用途。
3、 如权利要求1所述的TM4SF3蛋白或其片段作为靶标在筛选多种抗 肿瘤药物中的用途。
4、 以权利要求1所述的TM4SF3蛋白或其片段作为抗原而制备的抗体 及其衍生物。
5、 根据权利要求4所述的抗体及其衍生物，其中所述的抗体衍生物是 核素偶联抗体、1311标记抗体或纳米磁性颗粒偶联抗体。
6、 如权利要求4所述的抗体及其衍生物在制备用于治疗肿瘤复发、转 移的药物中的用途。
7、 以权利要求1所述的TM4SF3蛋白或其片段作为靶标筛选得到的具 有抗肿瘤活性的组分。
8、 根据权利要求7所述的组分，其是抗体、多肽、小分子化合物。
9、 如权利要求7所述的具有抗肿瘤活性的组分在制备治疗哺乳动物包 括人的肿瘤发生、生长或转移的药物中的用途。
10、 根据权利要求9所述的用途，其中所述组分是抗体、多肽、小分 子化合物。
11、 根据权利要求9或10所述的用途，其中所述的肿瘤是食管癌、结 肠癌或阳性表达TM4SF3蛋白的肿瘤。
12、 一种药物组合物，其特征在于包括如权利要求4所述的抗体及其 衍生物或者包括如权利要求7所述的组分。
13、 如权利要求12所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的发生、生长或 转移的药物中的用途。
14、 根据权利要求13所述的用途，其中所述的肿瘤是食管癌、结肠癌 或阳性表达TM4SF3蛋白的肿瘤。
全文摘要
本发明涉及可用于制备抗肿瘤抗体的TM4SF3蛋白及其应用。具体的本发明涉及用于制备抗肿瘤抗体的TM4SF3蛋白及其编码核苷酸序列；涉及抗TM4SF3蛋白的抗体及其制备方法、在生产治疗各种相关肿瘤的各种生物制剂中的用途；另外还涉及包括该抗体的药物组合物及其在体内抑制肿瘤的用途，从而达到治疗肿瘤的效果。
文档编号C07K16/30GK101497662SQ20081005702
公开日2009年8月5日 申请日期2008年1月29日 优先权日2008年1月29日
发明者冉宇靓, 杨治华, 海 胡 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所