专利名称：：一种制备吩噻嗪类免疫抗原及其抗体的方法
技术领域：
：本发明属于抗原抗体制备领域，特别的，属于利用抗原免疫动物制备抗体。
背景技术：
：吩噻嗪类镇静剂常用在动物的运输过程中，在将动物从养殖场运输到屠宰厂的工程中，动物常常无法适应环境变化的压力，在运输过程中造成由于心脏疾病而死亡。同时还可能产生动物肌肉代谢改变并且带来屠宰后检疫问题，如灰白水样肉。因此为了避免这种情况的发生，在运输前给动物注射镇静剂以减轻动物的压力情绪。由于这些化合物往往是在动物屠宰之前的数小时注射使用，因此，这些化合物相对于其他的兽用药物可能对消费者造成的健康风险更大。长期食用含有该类药物残留的动物组织，会带来许多副作用，同时还会造成对药物的依赖性。食用高浓度残留的动物组织，甚至会造成急性中毒或死亡。目前欧盟已经完全禁止了吩噻嗪类镇静剂药物在食源性动物中的使用。氯丙嗪是吩噻嗪安定类药物中具有代表性的一种，该类药物用于治疗神经病人。氯丙嗪是作用于中枢神经系统的药物，在大型牲畜的养殖中有广泛的应用。例如治疗猪中暑时，按每千克体重肌注盐酸氯丙嗪1-3毫克可以有效地控制过度兴奋时。给牲畜注射盐酸氯丙嗪250-375毫克每头，可以使其进入反应迟钝，进入熟睡状态，可以辅助治疗牲畜患疾病。由于镇静剂的药物作用，在不当摄入后，容易引起许多毒副作用。例如正常阳光照射，可引起皮肤和眼睛的不适(Epsteinetal.，1957)，除了光毒性作用外还有其光过敏反应的报道。药代研究证明，90%与血浆蛋白结合。脑中浓度比血浓度高10倍。可通过胎盘屏障，进入胎儿体内。在肝脏以氣化或与葡萄糖醛酸结合,代谢产物中7—羟基氣丙嗪仍有药理活性。主要经肾脏排出，排泄较慢。tl/2约为69小时。停药6个月后，仍可从尿中检出氣丙嗪代谢物。长期使用，对肝脏有一定影响。目前的方法有多种方法制备免疫原，如鞣酸的直接交联载体蛋白，静电吸附到红细胞上，使用重氮化方法将丙酰丙嗪或氣丙嗪与重氮化的对氨基苯甲酸反应生成的衍生物，再经活化酯方法与牛血清白蛋白结合制成免疫原。但这些方法都存在着不同的缺陷。当鞣酸作用于载体蛋白时会产生蛋白质的凝集现象，不易测定小分子半抗原与载体蛋白是否成功交联和交联的比例，另一方面由于其分子量在1701.2，结构重复多，容易使免疫动物产生仅抗鞣酸的抗体而屏蔽目的抗体。使用静电吸附红细胞的方法不仅很难确定交联情况，同时非共价结合的会使之后的免疫失败率大大升高。利用重氮化方法，由于连接了对贫基苯甲酸桥，使用的交联方法是活化酯法，按方法只能将半抗原结合在蛋白质的赖氨酸(60个)侧链上，无法提高交联的比例，同时对氨基苯甲酸桥同样会造成免疫压力，影响目标抗体的成功产生。1993年，Broeke等人，利用体外紫外照射的方法研究氣丙嗪的光解机制。实验证明，在不同的波长照射下，光解产物遵循相同机制，即在辐射照射下CPZ(氣丙嗪)经去氣基，形成最终的产物。在有氧的液态环境下，2位的氣解离，650/o生成PZOH，5。/。生成PZH，2。/。生成CPZSO。
发明内容一方面，本发明提供一种制备免疫抗原的方法，包括一种制备免疫抗原的方法，包括用波长为10nm—400nm的光照射含有吩噻嗪类化合物和蛋白分子的溶液。紫外线被定义为10nm—400nm辐射的总称。在一个优选的实施方式中，吩噻嗪类化合物为氣丙嗪，氣丙嗪(CPZ)经光活化后，可以和甲醇反应，生成PZ或2-甲氧基-PZ。反应通过加氢或亲核进攻机制，在有蛋白或核酸存在的液体环境中，被光激发的CPZ可以和这些生物大分子共价结合。类似于与甲醇的反应，蛋白质的氨基酸侧链中存在大量的可以作为亲核试剂进攻光活化的普马嗪正离子。这些氨基酸包括半胱氛酸35个，酪氨酸21个，丝氨酸32个，苏氨酸35个。具有吩噻嗪共同特异性结构位点的其它物质都可以具有与氯丙嗪(CPZ)相同的性质，因为他们具有共同的结构式。较优的，所述的波长为100nm—350nm。更优的，所述的波长为200nm—300nm。最优的，所述的波长为250nm—260nm。在另一个优先的技术方案中，吩噻嗪类化合物可以选自于乙酰丙嗪、末莱嗪、普马嗪、异丙嗪或丙酰吩噻嗪中的一种或者几种；其中所述的蛋白分子选自于核酸、非兔源血清白蛋白、钥蓝蛋白或卵清蛋白中地一种或几种o在另一个优先的技术方案中，辐射强度为1—400iiW/cm2;较优的，辐射强度为50-300nW/cm2。在一个优先的实施方式中，照射的时间为l一24小时，较优地为6-20个小时，最优的，照射的时间为8-14小时。另一方面，本发明还提供一种制备抗体的方法，该方法包括用波长为10nrn—400nm的光照射含有吩噻嗪类化合物和蛋白分子的溶液制备免疫抗原，用该免疫抗原制备抗体。在一个优选的方式中，用该免疫抗原免疫兔子制备抗体。利用光化学反应的方法制备免疫原，可以用于免疫实验动物。免疫的方法有很多种，本发明使用兔作为实验动物，可以是但不限于中国家兔、日本大耳白、新西兰白，免疫方案为一般方案。本发明用同样的方法将氣丙嗪和兔血清白蛋白结合，不限于使用其他蛋白或载体如核酸，非兔源血清白蛋白，钥蓝蛋白，卵清蛋白等。包被抗原可以利用载体作为桥，将氣丙嗪分子固定在酶标板上。筛选的分子包括，阳性筛选化合物包括7-羟基化氣丙嗪、氧硫基氣丙嗪、氮氧基氣丙嗪、去甲基氣丙嗪混合溶液、氣丙嗪、乙酰丙嗪、末莱嗪、普马嗪、异丙嗪、丙酰吩噻嗪、氯丙咪嗪，和阴性筛选化合物包括羟基安定、溴替唑仑、甲苯噻嗪、三唑仑、安定、卡拉洛尔、氮哌酮、地托咪定、心得安、3-二甲氨基-l-丙醉、二甲氨基丙二胺。有益效果本发明利用吩噻嗪类物质和蛋白分子在波长为10-400nm照射下制备免疫抗原。氯丙嗪作为吩噻嗪类镇静剂药物的代表，生产识别表位在10位叔氨部位包括1位，9位的碳，和叔胺烴链上的a，e碳，和它们所构成的立体结构的抗体。这种技术操作简单，获得的抗体特异性强，灵敏度高。图l.氯丙嗪的特征光吸收图谱图2.没有氣丙嗪存在的情况下，经紫外辐射的BSA的特征光吸收图谱图3.有氣丙嗪存在的情况下，经紫外辐射的BSA的特征光吸收图谱详细描述为了进一步说明本发明的效果和实施方式，现以实验加以说明。这些具体的实施例子仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。实验l氣丙嗪免疫抗原的制备3.5umol的BSA(牛血清白蛋白)溶解在0.1MpH6.5的磷酸缓冲溶液中，边搅拌边加入170umolDTT，在室温下搅拌2小时。反应结束后，将混合物充分透析，透析液为0.01MpH6.5的磷酸缓冲溶液。取出透析好的BSA，边搅拌边加入3S0umol的氯丙嗪。立即在紫外灯下照射，紫外辐射波长为254urn,辐射强度为100uW/cm2。搅拌不停止，直到反应12小时，停止辐射，在完全避光条件下，充分透析，透析液为0.01M的pH7.4的磷酸缓冲溶液。所得到的交联物质为透明的淡紫红色液体。利用紫外、可见光分光光度计扫描，确定氣丙嗪的交联情况。特征吸收光谱结果如下(见附图1-3):图l.氣丙嗪的特征光吸收图谱；图2.没有氯丙衡氯丙嗪的化学结构嗪存在的情况下，经紫外辐射的BSA的特征光吸收图谱；图3.有氯丙嗪存在的情况下，经紫外辐射的BSA的特征光吸收图谱。根据氯丙嗪在308mn处有特征吸收峰，而BSA没有，利用该处的交联物与BSA自身紫外辐射物在该波长的光吸收质计算，得到交联的比例为氣丙嗪BSA=30:1,即一个载体分子上连接有30个氣丙嗪小分子。实验2免疫方法本实验使用新西兰白兔作为实验动物，具体为，4只免疫前耳縁静脉取血5-20ml,并分离血清作为阴性独照。首先将500微克的氣丙嗪载体交联物与等体积弗氏完全佐剂混合乳化，待乳化完全后，采用背部皮下注射免疫。3周后，用200微克的氣丙嗪载体交联物与弗氏不完全佐剂混合，皮下注射免疫。以后每隔2周免疫一次，共免疫4次后，血清效价达到64000，使用500微克的氣丙嗪载体交联物耳縁静脉注射，4天后颈动脉取全血，无菌取脾脏。将免疫的兔子的脾脏与240E细胞融合，融合前取240E细胞培养上清作为阴性上清对照。使用50%的PEG将无菌取免疫兔脾脏细胞与生长在对数期的240E细胞融合。用HAT作为选择性培养基对融合后的细胞进行培养，分装于加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置37'C，6。/。C02培养箱内培养。三周后，用简介ELISA法筛选出阳性克隆，将初检阳性的杂交瘤细胞转移到24孔细胞培养板中。1周后,采用间接ELISA，间接竞争ELISA法和IgG定量等方法筛选出分泌抗体亲和力强，细胞生长状态良好的杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞在液氮中保存1份，另一份做梯度稀释进行克隆化获得杂交癯细胞上清液体。实验3单克隆抗体筛选包被抗原为卵淸蛋白氣丙嗪交联物，交联方法同实验l相同。将包被好的卵清蛋白抗原(卵清蛋白-氣丙嗪)以50ng/孔的包被在96孔板中，包被液为碳酸缓冲溶液，pH9.5。在4匸下过夜静止放置，再用(M)1。/。BSAPBSpH7.4封闭待用。将检测物，即将每个用来进行灵敏度筛选和特异性筛选的那些化学物质配置成10000ng/ml、1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml的浓度梯度，向固定有包被抗原的96孔板的孔中每孔加100ul。灵敏度筛选化合物包括7-羟基化氯丙嗪、氧硫基氣丙嗪、氮氧基氣丙嗪、去甲基氣丙嗪代谢物混合液、氣丙嗪、乙酰丙嗪、末莱嗪、普马嗪、异丙嗪、丙酰吩噻嗪、氯丙咪嗪。特异性筛选化合物包括羟基安定、溴替唑仑、甲苯噻嗪、三唑仑、安定、卡拉洛尔、氮哌酮、地托咪定、心得安、3-二甲氨基-l-丙醇、二甲氨基丙二胺。将每个待筛选即杂交瘤细胞的上清液体，以每孔10ul加入。簾荡均匀后，在37'C下孵育1小时。孵育结束后，用含0.05%TWEEN20,0.015MTris的洗液洗板，充分拍干后，每孔加入100ul10ug/ml的联有辣根过氧化物酶的羊抗兔抗体，371C下孵育0.5小时。孵育结束后，用含0.05%TWEEN20,0.015MTris的洗液洗板，充分拍干后，加入四甲基联苯胺底物溶液，在37*0反应5分钟，使用0.1M的硫酸终止反应，在450nm测定吸收值。筛选原则为，对于灵敏度筛选化合物选择IC50的检测物浓度最低；对于特异性筛选化合物选择IC50的检测物浓度最髙；经过如上方法筛选一共得到3个单克隆抗体CPZ"1，CPZ"2和CPZ"3，他们的特异性和灵敏度都比较髙。它们的最终灵敏度和特异性数据如下<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>心得安>10000ng/ml>10000ng/ml>10000ng/ml3-二甲氨基-1-丙醇>10000ng/ml>10000ng/ml>10000ng/ml二甲氨基丙二胺>10Q00ng/ml>10000ng/ml>10000ng/ml根据以上数据判断，如上三株抗体均可用于诊断试剂盒的进一步开发。权利要求1.一种制备免疫抗原的方法，其特征在于用波长为10nm-400nm的光照射含有吩噻嗪类化合物分子和蛋白或载体分子的溶液，让吩噻嗪类化合物分子和蛋白分子或载体分子形成具有免疫活性的免疫抗原。2.—种如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的波长为IOOnm—350nmc3.—种如权利要求2所述的方法，其特征在于其中所述的波长为200nm—300nm<>4.一种如权利要求3所述的方法，其特征在于其中所述的波长为250nm—260nm。5.—种如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述吩噻嗪类化合物分子选自于氯丙嗪、乙酰丙嗪、末莱嗪、普马嗪、异丙嗪或丙酰吩噻嗪中的一种或者几种；其中所述的蛋白分子选自非兔源血清白蛋白、钥蓝蛋白、牛血清白蛋白或卵清蛋白中的一种或几种。6.—种如权利要求1所述的方法，其特征在于辐射强度为1一400uW/cm207.—种如权利要求1所述的方法，其特征在于照射的时间为1一24小时。8.—种制备抗体的方法，其特征在于用波长为10nm—400nm的光照射含有吩噻嗪类化合物分子和蛋白分子的溶液制备免疫抗原，让吩噻嗪类化合物分子和蛋白分子形成具有免疫活性的免疫抗原，用该免疫抗原制备抗体。9.一种如权利要求8所述的制备抗体方法，其特征在于所述的吩噻嗪类化合物分子为氯丙嗪，蛋白分子为牛血清白蛋白，所述的波长为250nm-260nmc10.—种如权利要求1或8所述的方法，其特征在于在所述的溶液中还全文摘要本发明提供一种制备免疫抗原的方法，用波长为10nm-400nm的光照射含有吩噻嗪类化合物和蛋白分子的溶液，让吩噻嗪类化合物和蛋白主要以共价键连接形成稳定的免疫抗原。本发明还提供以该方法获得的免疫抗原来免疫动物获得特异抗体的方法。利用本发明制备具有免疫活性的抗原成本低廉，利用该抗原获得的抗体稳定，灵敏度高，特异性强。文档编号C07K14/795GK101550187SQ20081006159公开日2009年10月7日申请日期2008年5月19日优先权日2008年5月19日发明者宏俞,孙少民,范慧群,黄云坚申请人:杭州华安生物技术有限公司