专利名称：修饰有核苷酸的微小管的合成方法和保存方法
修饰有核苷酸的微小管的合成方法和保存方法 技术领域泛泛地说，本发明涉及微小管的合成，特别是涉及以不依赖于生物素-抗生物素蛋白结合的方法而合成修饰了核苷酸(DNA或RNA)的微小 管的方法，以及与此相伴的保存、再合成的方法。
背景技术：
在真核细胞中，作为细胞骨架的肌动蛋白丝和微小管发达，以这些 为轨道，在其上通过驱动蛋白和动力蛋白等马达蛋白质来传输细胞内小 器官和运输小泡等运输分子。此外，驱动蛋白和微小管的相互作用所代 表的分子运输机制也可在生物体外再构建，并且使微小管在固定于基板 上的驱动蛋白上进行滑走运动的滑动试验(gliding assay)系统也广为人们 所知。作为将这种优异的生物功能在工程学上应用于人工的分子运输系统 的尝试，以下实例己有报告通过对进行滑走运动的微小管表面进行生 物化学修饰来实现功能化(例如，参见非专利文献l)。在该尝试中，已成 功地将进行滑走运动的微小管表面的一部分生物素化，并使其与表面修 饰有链霉抗生物素蛋白的微珠(microbeads)等运输分子发生生物素-抗生 物素蛋白结合，由此将运输分子装载在微小管上来进行传输。但是，在 生物系统的相互作用中，生物素-抗生物素蛋白结合是具有最高亲和力的 结合之一，这点是广为人们所知的， 一旦将运输分子装载到微小管上， 则存在本质上不可能卸载这样的问题。相对于此，公开了以下系统通过将进行滑走运动的微小管表面的 一部分生物素化，并使其与末端修饰有链霉抗生物素蛋白的单链DNA发 生生物素-抗生物素蛋白结合，由此制作出修饰有单链DNA的微小管； 通过微小管与具有互补的碱基序列的DNA的杂交来进行装载，并通过添加限制酶来切割DNA而进行卸载(例如，参见专利文献1和2)。但是，存在以下问题点只能使单链DNA结合在得到生物素化的位 点上，而且由于抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白是分子量较大(60 kDa 67 kDa)的分子，因此不能自由设定单链DNA对微小管的修饰比例(标记 率)。因而，若为某恒定值以上的标记率，则也可能妨碍微小管的滑走运 动。非专利文献1: H. Hess等，"Light-Controlled Molecular Shuttles Made from Motor Proteins Carrying Cargo on Engineered Surfaces，，，Nano Letters, Vol.1, no.5, pp. 235-239, 2001.专利文献1:日本特开2006-204241号公报专利文献2:日本特开2006-271323号公报在本件专利申请之前，本发明人提出了以下系统制作出修饰有 DNA的微小管，对于该修饰有DNA的微小管而言，不仅利用了生物素-抗生物素蛋白结合，而且还着手使用了化学交联剂，并仅利用杂交就实 现了对运输分子选择性且自律性的装载和卸载的机制(未公开的日本特愿 2005-307880)。但是，在该提案中，对于修饰有DNA的微小管的具体合 成方法没有提及。于是，本发明的课题在于，提供以不依赖于常用的生物素-抗生物素 蛋白结合的方法而合成修饰有核苷酸的微小管的方法以及与此相伴的保 存、再合成的方法。发明内容为了实现上述课题，在本发明中，使(a)聚合后己稳定的微小管、(b) 具有琥珀酰亚胺部分和马来酰亚胺部分的化学交联剂与(c) 3'末端或5'末 端被巯基化(千才一^化)的核苷酸反应，合成出微小管-化学交联剂-核苷酸复合体。作为反应的一个实例，首先，使微小管的氨基与上述化学交联剂的 琥珀酰亚胺部分反应，合成出微小管-化学交联剂的复合体，然后使该复 合体的马来酰亚胺部分与上述末端被巯基化的核苷酸反应，由此合成出微小管-化学交联剂-核苷酸的复合体(修饰有核苷酸的微小管)。作为上述化学交联剂，优选使用MBS(间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-MBS(间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯磺 酸钠)、SMPB(4-(对马来酰亚胺苯基)琥珀酰亚胺丁酸酯)、 Sulfo-SMPB(4-(对马来酰亚胺苯基)琥珀酰亚胺丁酸酯磺酸钠)、 GMBS(N-(Y-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-GMBS(N七-马来 酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯磺酸钠)、EMCS(N-(e-马来酰亚胺己酰氧基) 琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-EMCS(N-(e-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺酯磺 酸钠)中的任意交联剂。这些化学交联剂的分子量比抗生物素蛋白或链霉 抗生物素蛋白的分子量小两个数量级，约为280 Da 460 Da，因此单链 DNA对微小管的修饰比例(标记率)的设定范围较宽。对于上述核苷酸，例如，使用具有单链部分的脱氧核糖核酸(DNA) 或具有单链部分的核糖核酸(RNA)。为了保存这样合成得到的修饰有核苷酸的微小管，通过将修饰有核 苷酸的微小管溶液冷却或向修饰有核苷酸的微小管溶液中添加解聚剂， 生成修饰有核苷酸的微管蛋白，将其急速冷冻并以该状态保存。为了再合成出被保存的修饰有核苷酸的微小管，将急速冷冻的修饰 有核苷酸的微管蛋白的溶解液、鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)和镁离子混合， 将该混合溶液加热，由此使修饰有核苷酸的微管蛋白再聚合，从而再合 成出修饰有核苷酸的微小管。作为优选例，也可以向上述混合溶液中添加未修饰有核苷酸的野生 型微管蛋白或者添加具有与上述修饰有核苷酸的微管蛋白不同的碱基序 列的修饰了核苷酸的微管蛋白，使它们再聚合。此外，也可以在将修饰有核苷酸的微管蛋白进行急速冷冻前，将修 饰有核苷酸的微管蛋白的聚合、以及修饰有核苷酸的微小管的解聚重复 进行2次以上。根据本发明，能够以不依赖于常用的生物素-抗生物素蛋白结合的方 法合成出修饰了核苷酸的微小管，并可以自由设定核苷酸对微小管的标记率。此外，能够保存所合成的修饰有核苷酸的微小管，并进行再合成， 因此也可以再次合成出修饰了高密度且多种类的单链核苷酸的微小管，并也能够提高微小管在模式化(patterning)时的取向性。这样的修饰有核苷酸的微小管能够提高分子传送和分子运输中的效 率性、多功能性。此外，使感测特定的DNA和RNA的能力较高的基因诊断成为可能。
图1是表示微小管-化学交联剂的复合体的合成步骤的图。图2是表示微小管-化学交联剂-核苷酸的复合体的合成步骤的图。图3是使用透过TAMRA的荧光的滤光器和不透过TAMRA的荧光的滤光器时的荧光显微镜观察照片。图4是表示由本发明的实施例得到的修饰有DNA的微小管与野生型微小管的滑动试验结果的曲线图。
具体实施方式
下面，参照附图对本发明的优选实施方式进行说明。在以下的实施 例中，作为化学交联剂，使用Sulfo-GMBS，作为核苷酸，利用5'末端被 巯基化的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)。实施例1作为本发明的一个实施方式的修饰有核苷酸的微小管的合成方法如下。(微小管的制备)向从猪脑等提取、提纯得到的a-,p-微管蛋白溶液(40 pM 60 pM)中 加入1 mM的GTP、 1 mM的MgS04并进行混合，在37。C下培养30分 钟。其后，加入80pM紫杉醇(夕* V—A)，从而使聚合得到的微小管稳 定，在室温下静置。(微小管-化学交联剂的复合体的合成)向按上述步骤制备得到的微小管溶液中，加入利用例如无水DMSO(二甲亚砜(dimethyl sulphoxide》进行了浓度调整的2.5 mM的 Sulfo-GMBS(22324， PIERCE公司制造)并进行混合，以遮光状态在室温 下培养30分钟。其间，如图1所示，微小管的氨基和Sulfo-GMBS的琥 珀酰亚胺部分发生化学反应。接着，利用超速离心分离机，将该混合溶液离心分离(30krpm， 25°C， 10分钟)，在利用缓冲溶液A(50 mM PIPES-KOH pH7.0， 4 mM MgC12、 20 pM紫杉醇)将离心分离后的粒状(pellet)成分漂洗后，利用缓冲溶液A 进行悬浮。由此，可得到微小管-化学交联剂的复合体溶液。(微小管-化学交联剂-核苷酸的复合体的合成)将按上述步骤制备出的微小管-化学交联剂的复合体溶液与具有相 同程度的浓度的5'末端被巯基化的ssDNA混合，以遮光状态在室温下培 养90分钟。其间，如图2所示，标记于微小管上的Sulfo-GMBS的马来 酰亚胺部分与ssDNA的巯基发生化学反应。此外，ssDNA的链长和碱基 序列可以是任意的，也可以是3'末端被巯基化的ssDNA。此外，如果预 先在未被巯基化的其它末端上连接TAMRA或FITC等荧光染料，则可利 用荧光显微镜视觉上确认核苷酸被标记在微小管上的结果，因此该确认 方法较为便利。利用巯基或荧光染料进行了末端修饰的ssDNA可从 SIGMA公司或OPERON公司等委托合成公司容易地得到，但多数情况 是以带有用于防止二硫化物结合的保护基的状态交付，因此在进入本合 成步骤之前，需要以各公司推荐的方法脱去保护基。此外，在所交付的 ssDNA浓度较低的情况下，需要经冷冻干燥步骤进行浓縮。接着，向培养后的复合体溶液中加入利用缓冲溶液A进行了浓度调 整的50 mM的Tris-HCl(pH7.0)，并加入利用缓冲溶液A进行了浓度调整 的10 mM的P-巯基乙醇，以遮光的状态在室温下培养20分钟。此夕卜，利用超速离心分离机，将该复合体溶液离心分离(30krpm，25。C， IO分钟)，在利用缓冲溶液A将离心分离后的粒状成分漂洗后，利用缓冲 溶液A进行悬浮。由此，可得到微小管-化学交联剂-核苷酸的复合体溶 液。(对合成出的修饰有核苷酸的微小管的评价)关于核苷酸被标记在微小管上的结果，只要在核苷酸的一侧的末端 标记上荧光染料，就可通过进行荧光显微镜观察而在视觉上加以确认。例如，如果通过透过TAMRA的荧光的滤光器CWIG)对ssDNA标记 到微小管上的结果进行荧光显微镜观察，则如图3(a)所示，可确认到纤维 状的微小管，所述ssDNA的5'末端被巯基化、3'末端标记有荧光染料 TAMRA并且该ssDNA具有10个碱基的单链部分。另一方面，即使通过 不透过TAMRA的荧光的过滤器(NIBA)进行荧光显微镜观察，如图3(b) 所示，也没有任何映像。由这些情况从视觉上可知，核苷酸已被标记在 微小管上。此外，从对微小管、核苷酸、化学交联剂的吸光度测定或浓度测定 等的实验结果算出微小管与核苷酸的浓度比例，从而也能够将核苷酸对 微小管的标记率进行定量。在上述的实例中，标记率达到0.61，计算出 每2分子的微管蛋白异源二聚体，最少结合有l根核苷酸，由此可知以 相当高的密度标记有核苷酸。此外，调整与聚合后得到稳定的微小管反 应的Sulfo-GMBS和核苷酸的浓度，从而可以自由设定标记率。并且，进行滑动试验，在该试验中，使驱动蛋白、动力蛋白等马达 蛋白质吸附在载玻片上，并使修饰了核苷酸的微小管在其上进行滑走运 动，由该试验可评价修饰有核苷酸的微小管的滑走运动速度。图4是表示未标记有核苷酸的野生型微小管(Wild type MTs)和如上 所述以高密度标记了核苷酸的微小管(ssDNA-labeled MTs)的滑动试验的 结果的曲线图。在该测定中，作为马达蛋白质，使用以大肠杆菌表达、 提纯来自大鼠的驱动蛋白表达质粒而得到的重组型驱动蛋白rk430。尽管 与未标记有核苷酸的野生型微小管(Wildtype MTs)相比，高密度标记了核 苷酸的微小管(ssDNA-labeled MTs)的滑走运动速度降低约一半，但是其 可以平滑地进行滑走运动。如果降低核苷酸的标记率，则微小管的滑走 运动速度与野生型的速度接近。此外，即使将马达蛋白质替换成动力蛋白(例如HFB380)，也可使修饰有核苷酸的微小管进行滑走运动，并能够以驱动蛋白的数倍速度使修 饰有核苷酸的微小管滑走。在这种情况下，即使是以高密度标记了核苷酸的微小管，其滑走运动速度也大大超过1.0 |nm/SeC。下面，对合成出的修饰有核苷酸的微小管的保存与再合成进行说明。 (修饰有核苷酸的微小管的解聚和保存)利用超速离心分离机将按上述步骤制备出的微小管-化学交联剂-核苷酸的复合体溶液进行离心分离(30 krpm， 25°C， 10分钟)，以经冰冷的 缓冲溶液B(80 mM PIPES-KOH pH6.8， 1 mM MgC12， 1 mM EGTA)将离 心分离后的粒状成分悬浮，在4。C下培养30分钟。此外，也可以通过加 入秋水仙胺(3^^S O等解聚剂，使修饰有核苷酸的微小管解聚。接着，利用超速离心分离机进行离心分离(80krpm， 2°C， 10分钟)， 将其上清成分回收。此时，必要时也可以进行分注。利用液氮使回收溶 液(修饰有核苷酸的微管蛋白)急速冷冻，并在液氮库中保存。此外，也可 以在对修饰有核苷酸的微管蛋白进行急速冷冻前，按如下所示的步骤使 修饰有核苷酸的微管蛋白聚合，并使聚合得到的修饰有核苷酸的微小管 解聚，通过将该过程重复进行2次以上，提高具有活性的修饰有核苷酸 的微管蛋白的纯度，然后再进行保存。(修饰有核苷酸的微小管的再合成)将按上述步骤保存的修饰有核苷酸的微管蛋白的溶液溶解，加入缓 冲溶液B、 1 mM的GTP、 1 mM的MgS04并进行混合，在37。C下培养 30分钟。此时，也可以根据需要再加入甘油以提高聚合能力。此外，如 果适度混合未修饰有核苷酸的野生型微管蛋白，则能够自由改变核苷酸 对微小管的标记率。此外，如果还适度混合具有与修饰有核苷酸的微管 蛋白不同的碱基序列的修饰了核苷酸的微管蛋白，则可合成出具有两种 以上的碱基序列的修饰了核苷酸的微小管。其后，加入80pM紫杉醇以使聚合得到的微小管稳定，通过超速离 心分离机进行离心分离(30krpm， 25°C， 10分钟)，利用缓冲溶液A将离 心分离后的粒状成分悬浮。由此，可得到再合成出了修饰有核苷酸的微 小管的溶液。以上，基于特定的实施例说明了本发明，但是本发明不限于这些实施例。例如，在上述的实施例中，作为化学交联剂，给出了使用Sulfo-GMBS的实例，但也可以使用MBS(22311， PIERCE公司制造)、 Sulfo-MBS(22312， PIERCE公司制造)、SMPB(22416， PIERCE公司制造)、 Sulfo-SMPB(22317， PIERCE公司制造)、GMBS(22309， PIERCE公司制 造)、EMCS(22308， PIERCE公司制造)、Sulfo-EMCS(22307， P正RCE公司制造)等。此外，在上述的实施例中，作为核苷酸，给出了使用脱氧核糖核酸 (DNA)的实例，但也可使用核糖核酸(RNA)。
权利要求
1.一种修饰有核苷酸的微小管的合成方法，其特征在于，该方法包括如下步骤使聚合后已稳定的微小管与具有琥珀酰亚胺和马来酰亚胺的化学交联剂、以及3’末端或5’末端被巯基化的核苷酸反应，合成出微小管-化学交联剂-核苷酸复合体。
2. 如权利要求1所述的修饰有核苷酸的微小管的合成方法，其特征 在于，该方法包括如下步骤使所述已稳定的微小管的氨基与所述化学交联剂的琥珀酰亚胺反 应，合成出微小管-化学交联剂复合体；和使所述微小管-化学交联剂复合体的马来酰亚胺与所述核苷酸反应， 合成出所述微小管-化学交联剂-核苷酸复合体。
3. 如权利要求1所述的修饰有核苷酸的微小管的合成方法，其特征 在于，所述化学交联剂选自MBS、 Sulfo-MBS、 SMPB、 Sulfo-SMPB、 GMBS、 Sulfo-GMBS、 EMCS和Sulfo-EMCS中，其中所述MBS为间马 来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、所述Sulfo-MBS为间马来酰亚胺 苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯磺酸钠、所述SMPB为4-(对马来酰亚胺苯 基)丁酸琥珀酰亚胺酯、所述Sulfo-SMPB为4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸琥 珀酰亚胺酯磺酸钠、所述GMBS为N-(，马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚 胺酯、所述Sulfo-GMBS为N-(Y-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯磺酸 钠、所述EMCS为N-(e-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺酯、所述 Sulfo-EMCS为N-(s-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺酯磺酸钠。
4. 如权利要求1所述的修饰有核苷酸的微小管的合成方法，其特征 在于，所述核苷酸为具有单链部分的脱氧核糖核酸或核糖核酸，其中所 述脱氧核糖核酸表示为DNA，所述核糖核酸表示为RNA。
5. —种修饰有核苷酸的微小管的保存方法，其特征在于，该方法包 括如下步骤通过将所述微小管-化学交联剂-核苷酸复合体的溶液进行冷却或者 向所述复合体的溶液中加入解聚剂，使权利要求1所述的修饰有核苷酸的微小管解聚，以制成修饰有核苷酸的微管蛋白；和 将所述修饰有核苷酸的微管蛋白急速冷冻。
6. 如权利要求5所述的修饰有核苷酸的微小管的保存方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤在进行所述急速冷冻之前，将所述修 饰有核苷酸的微管蛋白的聚合和所述修饰有核苷酸的微小管的解聚重复进行2次以上。
7. —种修饰有核苷酸的微小管的再合成方法，其特征在于，该方法 包括如下歩骤在权利要求5或6所述的经急速冷冻的修饰有核苷酸的微管蛋白的溶液中混合鸟嘌呤核苷三磷酸和镁离子，以得到混合溶液，其中鸟嘌呤核苷三磷酸表示为GTP;和将所述混合溶液加热，使所述修饰有核苷酸的微管蛋白再聚合，由 此再合成出所述修饰有核苷酸的微小管。
8. 如权利要求7所述的修饰有核苷酸的微小管的再合成方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤向所述混合溶液中添加未修饰有核苷酸的野生型微管蛋白。
9. 如权利要求7所述的修饰有核苷酸的微小管的再合成方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤向所述混合溶液中添加修饰有核苷酸的微管蛋白，其中所述修饰有核苷酸的微管蛋白具有与所述经急速冷 冻的修饰有核苷酸的微管蛋白不同的碱基序列。
全文摘要
本发明涉及修饰有核苷酸的微小管的合成方法和保存方法。本发明提供以不依赖于生物素-抗生物素蛋白结合的方法而合成修饰了核苷酸(DNA或RNA)的微小管的方法。修饰有核苷酸的微小管的合成方法如下使聚合后已稳定的微小管、具有琥珀酰亚胺和马来酰亚胺的化学交联剂与3’末端或5’末端被巯基化的核苷酸反应，从而合成出微小管-化学交联剂-核苷酸的复合体。
文档编号C07K1/00GK101265287SQ20081008262
公开日2008年9月17日 申请日期2008年2月27日 优先权日2007年2月27日
发明者桧山聪, 森谷优贵, 须田达也, 须藤和夫 申请人:株式会社Ntt都科摩;国立大学法人东京大学