庆大霉素与载体蛋白偶联产物和庆大霉素抗体制备的方法及用途的制作方法

专利名称：庆大霉素与载体蛋白偶联产物和庆大霉素抗体制备的方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫化学生物技术领域，尤其是涉及一种庆大霉素与载体蛋白 偶联产物和庆大霉素抗体制备的方法及用途。
背景技术：
关于药物残留的控制既需要完善的检验方法和标准，又需要健全的监控体
系。目前国际上对抗生素类药物残留的检测主要有仪器分析法(包括HPLC和 GC-MS)和微生物学法(主要用于抗生素残留的检测)等。仪器分析法既要求 仪器设备具有相当高的精度，也要求技术人员具有较好的分析操作技能，其昂 贵的价格和缓慢的软件更新速度以及操作上的烦琐限制了其在一般实验室中的 应用。但由于检测的灵敏度可以达到ng级水平(ppb级)，在一些大型实验室仍
将其作为残留检测的参考标准使用。
ELISA法操作上的简便、快速和达到ng级水平的灵敏度等优点，目前备受 有关部门的青睐，而ELISA法的第一步就需要特异性的高效价抗体。 一些国外 厂商己经研制出了部分药物残留的ELISA检测试剂盒，但价格昂贵。所以研制 国产化的药物残留检测试剂盒对推动我国动物性产品的出口、保证国人的健康 等方面具有重要意义。
庆大霉素属于氨基糖苷类抗生素，有肾毒性、耳毒性，适应于中、重度肠 杆菌科细菌等革兰氏阴性杆菌引起的感染。注射用庆大霉素业已造成数以万计 的老人肾衰和儿童耳聋。庆大霉素在畜牧业中的滥用导致动物体内药物的滞留 或蓄积，并以残留的方式进入人体及生态系统。它对人体及环境的危害主要是 慢性、远期和累积性的。抗生素耐药菌株的存在将严重威胁着人类的健康，而 且临床亚治疗水平的抗生素更容易促使抗性基因的转移，比如对动物进行低水 平庆大霉素治疗，其粪肠菌群由对庆大霉素敏感逐渐变成抗庆大霉素最后发展
成对其它药物也产生抗性。在长期的生活中，恰恰是人类和动物肠道的正常菌 群成了耐药基因的储存库，并不断的将耐药基因转移给致病菌，并在人和动物 中交叉传播，尤其是释放到环境中耐药菌的危害更为严重，可造成耐药基因的 迅速转移。随着人们生活水平以及对滥用抗生素危害性认识的提高，人们非常 重视食品中抗生素的残留，喜欢食用无抗生素残留的畜产品和水产品。

发明内容
本发明的目的是提供一种庆大霉素与载体蛋白偶联产物和庆大霉素抗体制
4备的方法及用途。
庆大霉素与载体蛋白偶联产物的制备方法包括如下步骤
a) 将20-650mg硫酸庆大霉素和10-200mg载体蛋白溶解于1-10毫升0.01M 117.2的磷酸盐缓冲液中；
b) 上述溶液中边搅拌边逐滴加入l-10毫升含300-2000mg盐酸碳化二亚胺的 超纯水溶液，加毕后在4-3(TC搅拌反应1.5-20小时，合成庆大霉素-载体蛋白偶联 产物；
c) 庆大霉素-载体蛋白偶联产物放入透析袋中，用0.01MpH7.2的磷酸盐缓 冲液在4"C透析l-3天；
d) 透析后的庆大霉素-载体蛋白偶联产物进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物 及浓度测定，分装后于-2(TC冰箱保存备用。
所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种 球蛋白、酶或卵清蛋白。
所述的庆大霉素-载体蛋白偶联产物可免疫动物制备庆大霉素抗体及作为人 工抗原应用于食品中庆大霉素检测的免疫学方法。
抗庆大霉素单抗的制备方法包括如下步骤
1) 庆大霉素-载体蛋白偶联产物作为免疫原免疫BALB/C小鼠；
2) 取免疫鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞在50 %聚乙二醇融合剂下融合， HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法筛选分泌抗庆大霉素抗体 的细胞；
3) 采用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳 定传代并分泌抗庆大霉素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株；杂交瘤细胞注射 入BALB/C小鼠腹腔制备单抗腹水；
4) 采用直接竞争ELISA方法测定抗庆大霉素单抗与庆大霉素、链霉素、卡 那霉素、青霉素、四环素、氯霉素的交叉反应率，选择仅与庆大霉素有特异性 免疫反应，且检测灵敏度达到0.5-3 ng/mL的单抗，可用于畜产品中庆大霉素残 留的检测。
所述的免疫原是根据权利要求1方法偶联的庆大霉素-载体蛋白偶联产物。 所述的免疫原的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、
牛丙种球蛋白、酶或卵清蛋白。
抗庆大霉素单抗用于检测食品中庆大霉素类抗生素残留的免疫学方法。所
述的用于检测食品中庆大霉素残留的免疫学方法为竞争ELISA或免疫检测试纸条。
庆大霉素-载体蛋白偶联产物免疫鼠、兔子、羊、驴、牛或禽制备抗庆大霉 素多抗的制备方法包括如下步骤
1) 初次免疫采用0.1-5mg偶联产物抗原与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后 皮下或皮内或肌肉小量、多点注射免疫；
2) 每间隙2-4周，用弗氏不完全佐剂与偶联产物抗原充分乳化后皮下或皮 内或肌肉小量、多点注射，进行2-5加强免疫；
3) 末免不加佐剂，加倍剂量肌肉注射免疫，末免后7-10天后采血，离心分 离血清；
4) 用蛋白A/G亲和柱纯化IgG,纯化的IgG冻干冰箱保存。 本发明的优点是1)本发明提供一种能制备检测食品中庆大霉素残留的抗
体的庆大霉素免疫原偶联方法，其操作简单方便；2)提供了一种能获得检测庆 大霉素残留的特异、灵敏单克隆抗体的制备方法，其方法简单有效；3)利用本 发明所制备的抗体，可有效地用于畜产品中庆大霉素残留的检测。目前庆大霉 素残留的检测主要有仪器分析和免疫分析两种方法，其中仪器分析法主要用高效 液相色谱法(HPLC)、气相色谱(GC)，由于其存在仪器昂贵、操作烦琐、费时 费力、费用高、不能大规模现场检测等问题，也要求技术人员具有一定的操作 和分析技能，因而不能很好推广应用。酶联免疫吸附分析(ELISA)具有简便、 快捷、能大规模检测、灵敏和成本低廉及现场检测的优点，尤其适合在生产和流 通过程中对畜产品及水产品中庆大霉素等抗生素残留进行检测。胶体金免疫层 析试纸条应用广泛，已有多种可检测人、动物、植物病原、癌症抗原、激素、 药物与农药残留的试纸条，该方法具有如下优点操作简单、方便、快速，几 乎人人都会使用；不需任何设备；结果准确可靠、特异性强、灵敏度高；低成 本高效益；保存方便等。因此免疫层析试纸条目前已成为多种物质免疫学检测 的发展方向之一。本专利应偶联的人工抗原制备抗庆大霉素抗体，以该多抗为 核心开发庆大霉素残留检测试剂盒及胶体金免疫层析试纸条，为我国动物源食 品中庆大霉素残留的快速检测服务。
具体实施例方式
本发明提供了庆大霉素与载体蛋白偶联产物和庆大霉素抗体制备的方法及 用途。用制备的免疫原制备庆大霉素的特异性强、灵敏度高、稳定性好、能大 量生产的单克隆抗体和多抗，并用这些抗体建立了检测食品中庆大霉素残留具 有高度特异性、灵敏性和正确性的快速诊断方法一竞争ELISA及免疫层析试纸条，可有效地用于畜产品中庆大霉素残留的检测，为我国的食品安全服务。
1. 一种庆大霉素与牛血清白蛋白(BSA)偶联产物的制备方法的步骤
a)将20mg硫酸庆大霉素和10mgBSA溶解于l毫升0.01MpH7.2的磷酸盐缓 冲液中；
b )上述溶液中边搅拌边逐滴加入1毫升含300mg盐酸碳化二亚胺的超纯水溶 液，加毕后在4-3(TC搅拌反应1.5-20小时，合成庆大霉素-BSA偶联产物；
c)庆大霉素-BSA偶联产物放入透析袋中，用0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液 在4"C透析l-3天；
e)透析后的庆大霉素-BSA偶联产物、庆大霉素、BSA溶液进行紫外扫描， 分析鉴定偶联产物及浓度测定，分析发现偶联产物的紫外扫描图形与BSA、庆 大霉素的扫描图形明显不同，说明庆大霉素已与BSA偶联成功，偶联产物分装 后于-2(TC冰箱保存，用于免疫动物制备抗体及作为庆大霉素人工抗原应用于食 品中庆大霉素检测的免疫学方法。
2. —种庆大霉素与牛血清白蛋白(BSA)偶联产物的制备方法的步骤
a) 将650 mg硫酸庆大霉素和200mg BSA溶解于10毫升0.01MpH7.2的磷酸盐 缓冲液中；
b) 上述溶液中边搅拌边逐滴加入10毫升含2000mg盐酸碳化二亚胺的超纯水 溶液，加毕后在4-30'C搅拌反应1.5-20小时，合成庆大霉素-BSA偶联产物；
c) 庆大霉素-BSA偶联产物放入透析袋中，用0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液 在4'C透析l-3天；
e)透析后的庆大霉素-BSA偶联产物、庆大霉素、BSA溶液进行紫外扫描， 分析鉴定偶联产物及浓度测定，分析发现偶联产物的紫外扫描图形与BSA、庆 大霉素的扫描图形明显不同，说明庆大霉素已与BSA偶联成功，偶联产物分装 后于-20。C冰箱保存，用于免疫动物制备抗体及作为庆大霉素人工抗原应用于食 品中庆大霉素检测的免疫学方法。
3. 庆大霉素单克隆抗体的制备方法 1)免疫动物
庆大霉素-BSA偶联产物免疫四周龄体重18-20 g BALB/C雌性小鼠取1 mg/ml庆大霉素-BSA偶联产物0.5-0.7 ml与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳 化后，经背腹部皮下多点注射0，2-0.3ml/只，间隔3-4周，取与一免等量抗原和 等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，进行腹腔注射加强免疫(0.2-0.3ml/只)， 共进行3-5次加强免疫，不加佐剂的末免用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。
2) 细胞融合
取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按5-10: 1的比例，在 无血清的RPMI-1640 (Gibco)培养基中混匀，1500 rpm离心5 min，去除培养 基，用50。/。PEG(聚乙二醇，Sigma)作为融合齐U，在37。C下水浴下加入0.5-0.7ml， 使其融合2 min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500 rpm离心5 min， 沉淀用HAT筛选培养基(Sigma)悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中， 37°C， 5MC02的细胞培养器皿中培养。
3) 杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆
细胞在培养器皿中培养5天后，用HAT筛选培养基换液一次，第10天用 HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5%-50%时，用庆大霉素偶联卵清蛋白 作为包被抗原进行间接ELISA方法筛选阳性孔，共获800多个对庆大霉素有反 应的阳性孔，阳性率为1%。选择5个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法 克隆，获得1B1株能分泌抗庆大霉素的特异性抗体的杂交瘤细胞株。经6个月 以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经 扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。
4) 单克隆抗体腹水制备及纯化
取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5 ml降植垸(Sigma)， 7-10 天后腹腔注入5-10><105个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大， 采取腹水，3000-5000 rpm离心3-5 min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取 1倍体积腹水加2倍体积0.06 M pH 4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸(30 ul/ml腹水)， 室温下边加边搅拌，4。C澄清l小时，12000 rpm离心20 min，收集上清，再用 50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4r放置2小时，3000-5000 rpm离心20 min， 沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4。C流动透析24小时后即获纯化的腹水抗 体，-70'C保存。
5) 单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定
将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG、 IgG^ IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM抗体，作双向琼脂扩散试验，结果为，1B1的抗体类型及亚 类为IgGi，单克隆抗体的轻链为K链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效 价，结果为上述腹水效价均在10—6以上。 4.检测庆大霉素残留的直接竞争ELISA方法的建立 1)庆大霉素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联产物的制备a) 将5 mg硫酸庆大霉素和20mg HRP溶解于1毫升0.01M pH7.2 PBS中；
b) 上述溶液中边搅拌边逐滴加入l毫升含200mg盐酸碳化二亚胺的超纯水溶 液，加毕后在4-3(TC搅拌反应1.5-24小时，合成庆大霉素-HRP偶联产物；
c) 庆大霉素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联产物放入透析袋中，用pH72的 磷酸盐缓冲液(PBS)在4"C透析l-3天；
d) 透析后的庆大霉素-HRP偶联产物、庆大霉素、HRP溶液进行紫外扫描， 鉴定偶联产物，分析发现偶联产物的紫外扫描图形与庆大霉素、HRP的扫描图 形明显不同，说明庆大霉素已与HRP偶联成功，偶联产物分装后于-2(TC冰箱保 存，用于检测庆大霉素的直接竞争ELISA方法。
2) 直接竞争ELISA方法条件优化
用方阵试验法对抗体和酶标半抗原的进行一系列浓度的稀释，确定直接竞 争ELISA法抗体和酶标半抗原的最适工作浓度。OD，值约为1.0，抗体抗原用 量较少的浓度组合，即为抗体-抗原的最佳工作浓度。首先，将单抗用PBS (0.01 M,pH7.4)稀释成一系列浓度，分别依次加入96孔酶标板(100^iL/wel1)， 37 °C 下温育2 h, PBST洗涤3次；用含2.0%脱脂奶的PBS封闭，每孔300 pL， 37 °C 温育0.5h，后用PBST洗涤3次；加入预先以PBS稀释成不同浓度的酶标半抗 原，在微量震荡器上混匀，37 。C下温育1 h， PBST洗涤3次；加入底物溶液(IOO pL/wel1)， 37 'C温育15 min,加入终止液(50 |iL/well)，用酶标仪测定各孔的 OD，值。
3) 抗体亲和性及检测灵敏度
在优化的条件下，在预先包被好单抗的酶标板上，加入系列浓度的庆大霉
素标样，每浓度3孔重复，设不加庆大霉素对照和溶剂空白对照，50jiL/wdl，再
加入0.22ng/ml酶标半抗原50nL,震荡l min后37 。C下温育l h， PBST洗涤4次；
加入TMB底物溶液(100 pL/wel1)， 37 "C温育15 min，加入2M硫酸终止液(50
nL/wdl)，用酶标仪测定各孔的OD45o值。以抑制率与庆大霉素浓度的半对数绘
制标准曲线。抑制率I计算公式如下
(ODmax-ODmin) - (ODx画ODmin) 1%= (ODmax國ODmin) "00
式中ODn^-不加抗生素的吸光值；ODx-抗生素浓度为X时的吸光值；ODmin-空白对照孔的吸光值。
以抑制率达到50%的抗生素浓度(IC5C)来表示抗体对庆大霉素的亲和性， 以ICu)作为ELISA方法的检测灵敏度。在优化的ELISA分析条件下，对庆大霉素建立标准曲线，以考察其在最优化的反应体系中的检测灵敏度。根据竞争
ELISA反应标准曲线计算得ICso为5.24 ng/ml， Ido为1.3 ng/ml。 4)庆大霉素单抗的特异性
在优化的条件下，将庆大霉素标准品、链霉素、青霉素、卡那霉素、四环 素、氯霉素、作系列稀释，分别与单抗进行直接竞争ELISA，制作标准曲线， 并在曲线上找出抑制率50%的浓度，以及上述几种物质50%抑制率的浓度，然 后计算出各类抗生素的交叉反应率。交叉反应率CR计算方法为CRy。二庆大霉 素IC5o/其它抗生素IC5()Xl00。结果表明，1B1单抗与庆大霉素有特异性免疫反 应，而与卡那霉素、链霉素、青霉素、四环素、氯霉素的交叉反应率均小于0.1%。
5. 抗庆大霉素多抗的制备
用庆大霉素与载体蛋白偶联产物免疫鼠、兔子、羊、驴、牛、禽等动物制 备多抗。初次免疫采用偶联产物人工抗原(0.1-5mg)与等体积弗氏完全佐剂 (complete freund，sadjvant,CFA)充分乳化，然后皮下或皮内或肌肉小量、多点 注射；间隙2-4周后，再用弗氏不完全佐剂(incomplete freund，s adjvant, IFA) 与抗原充分乳化，然后皮下或皮内或肌肉小量、多点注射进行加强免疫；间隙 2-4周，进行2-5加强免疫；末免不加佐剂，直接肌肉注射，末免后7-10天后采 血。每次免疫后4-8采少量血，进行ELISA效价的测定，效价满意后大量采血， 离心分离血清。用蛋白A/G亲和柱纯化IgG纯化的IgG用于食品中庆大霉素检 测的免疫学方法。
6. 免疫层析试纸条的制备 胶体金的制备及单抗的金标记
胶体金颗粒制备在100ml去离子水中加入P/。柠檬酸三钠lml，煮沸后迅 速加入l。/。氯金酸lml，继续煮沸15min，冷却后，4 t下保存备用。通常情况下， 制备好的胶体金颗粒的大小平均为30 nm。 单抗的金标记
取已制备好的胶体金溶液100ml，用O.l mol/L碳酸钾溶液调pH至lj8.0。边搅 拌边加入单抗2.1mg，搅拌15min，再逐滴加入2.5 ml 25 mg/ml聚乙二醇20000
(PEG 20000)，搅拌20min。 20 000 r/min离心20 min，弃上清液，加入10mlpH 7.4PBS缓冲液(含0.4mg/mlPEG)清洗2次。将沉淀用5ml含2。/。BSA的PBS缓 冲液(pH7.4)溶解，用0.22,无菌过滤器过滤后，4。C保存备用。 免疫层析试纸条的组装
用点膜机把适当浓度的庆大霉素-BSA抗原及羊抗鼠IgG喷在NC膜上，分别作为检测线(T)和控制线(C)，在37。C烘箱干燥8h。以同样方法，将制备 好的金标记庆大霉素单抗包被在胶体金结合垫上。将样品垫、胶体金结合垫、 硝酸纤维素膜及吸水垫依次粘贴在底板上，从而组成一个连续的微滤体系。将 贴好的板切割成4mm宽的条，装入模板中制成检测试剂板，避光、密闭、常温 保存备用。
用滴管吸取待检样品溶液，滴加3滴(约00ul)于上述试剂板的加样孔中， 加样后开始计时；结果应在3-5分钟内读取，其他时间判读无效；读取结果时， 检测试剂应图3右侧所示摆放方式置于观察者正面。根据观察区的T、 C线的颜色 比对来确定结果，T线显色比C线深或者相等时，结果判定为阴性。当T线颜色显 色比C线浅时，检测结果为阳性。
将庆大霉素标准品配置成不同浓度的分析试样溶液0、 1、 3、 5、 7、 10、
15、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100 ng/ml，用检测试纸条进行测定， 每个试样做3个重复，5min后观察结果，检测结果表明，当样品中庆大霉素残 留药物的含量达到或超过1.3g/ml，由于大多数单克隆抗体被样品中的庆大霉素 残留竞争结合，T线的包被抗原结合到的庆大霉素单克隆抗体就很少或者没有， T线的显色明显比C线浅或不显色，结果为阳性；当样品中庆大霉素残留的含量 低于0.80ng/m埘，T线呈色与C线一致或比C线浅，结果为阴性；无论是阳性 还是阴性结果，胶体金-庆大霉素单抗结合物总能与C线处的羊抗鼠IgG结合，形 成一条紫红色的条带。如果，C线不显色，无论是T线有无，这时的结果均无效。 检测试剂板的稳定性试验
用同一批次不同检测试剂板检测同一样品，及用不同批次检测试剂板测定 同一样品，其质控线、检测线的显色时间及颜色深浅和最终结果判读基本相同。 将相同批次的试剂板置于37'C、室温、4"C密闭保存3个月，每2周各检测阳性和 阴性奶样各20份，结果显示随着时间和温度的变化，检测结果未发生大的变化。 根据37'C下一天相当于1周估算，本试剂板可以在室温下保存12个月。
ii
权利要求
1. 一种庆大霉素与载体蛋白偶联产物的制备方法，其特征在于包括如下步骤a)将20-650mg硫酸庆大霉素和10-200mg载体蛋白溶解于1-10毫升0.01MpH7.2的磷酸盐缓冲液中；b)上述溶液中边搅拌边逐滴加入1-10毫升含300-2000mg盐酸碳化二亚胺的超纯水溶液，加毕后在4-30℃搅拌反应1.5-20小时，合成庆大霉素-载体蛋白偶联产物；c)庆大霉素-载体蛋白偶联产物放入透析袋中，用0.01M pH7.2的磷酸盐缓冲液在4℃透析1-3天；d)透析后的庆大霉素-载体蛋白偶联产物进行紫外扫描，分析鉴定偶联产物及浓度测定，分装后于-20℃冰箱保存备用。
2. 根据权利要求l所述一种庆大霉素与载体蛋白偶联产物的制备方法，其特 征在于所述的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙 种球蛋白、酶或卵清蛋白。
3. —种如权利要求l所述方法制备的庆大霉素与载体蛋白偶联产物的用途， 其特征在于所述的庆大霉素-载体蛋白偶联产物可免疫动物制备庆大霉素抗体及 作为人工抗原应用于食品中庆大霉素检测的免疫学方法。
4. 一种抗庆大霉素单抗的制备方法，其特征在于包括如下步骤1) 庆大霉素-载体蛋白偶联产物作为免疫原免疫BALB/C小鼠；2) 取免疫鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞在50%聚乙二醇融合剂下融合， HAT筛选培养基筛选杂交瘤细胞，用间接ELISA方法筛选分泌抗庆大霉素抗体 的细胞；3) 采用有限稀释法进行细胞克隆，经间接ELISA筛选阳性克隆，获得能稳 定传代并分泌抗庆大霉素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞注射 入BALB/C小鼠腹腔制备单抗腹水；4) 采用直接竞争ELISA方法测定抗庆大霉素单抗与庆大霉素、卡那霉素、 链霉素、青霉素、四环素、氯霉素的交叉反应率，选择仅与庆大霉素有特异性 免疫反应，且检测灵敏度达到0.3-5 ng/mL的单抗。
5. 根据权利要求4所述的一种抗庆大霉素单抗的制备方法，其特征在于所述 的免疫原是根据权利要求1所述方法偶联的庆大霉素-载体蛋白偶联产物。
6. 根据权利要求4所述的一种抗庆大霉素单抗的制备方法，其特征在于所述的免疫原的载体蛋白为匙孔血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛丙种 球蛋白、酶或卵清蛋白。
7. —种如权利要求4所述方法制备的抗庆大霉素单抗的用途，其特征在于，所述的庆大霉素单抗用于检测食品中庆大霉素类抗生素残留的免疫学方法。
8. 根据权利要求7所述的一种庆大霉素单抗的用途，其特征在于所述的用于 检测食品中庆大霉素残留的免疫学方法为竞争ELISA或免疫检测试纸条。
9. 一种用权利要求1所述方法制备的偶联产物免疫鼠、兔子、羊、驴、牛或 禽制备抗庆大霉素多抗的制备方法，其特征在于包括如下步骤1) 初次免疫采用0.1-5mg偶联产物抗原与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后 皮下或皮内或肌肉小量、多点注射免疫；2) 每间隙2-4周，用弗氏不完全佐剂与偶联产物抗原充分乳化后皮下或皮 内或肌肉小量、多点注射，进行2-5加强免疫；3) 末免不加佐剂，加倍剂量肌肉注射免疫，末免后7-10天后采血，离心分 离血清；4) 用蛋白A/G亲和柱纯化IgG纯化的IgG冻干冰箱保存。
全文摘要
本发明提供一种庆大霉素与载体蛋白偶联产物、庆大霉素抗体制备的方法及用途。用本发明偶联的庆大霉素人工抗原免疫动物制备可用于食品中庆大霉素检测的抗体；免疫的BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合，用与载体蛋白偶联的庆大霉素作为包被抗原筛选阳性杂交瘤细胞、经细胞克隆获得能稳定传代并分泌抗庆大霉素抗体的杂交瘤细胞，并制备腹水单抗。利用制备的抗体建立了对庆大霉素具有高度特异性、灵敏性和精确性的直接竞争ELISA方法及免疫胶体金试纸条。本发明提供的庆大霉素与载体蛋白偶联产物及庆大霉素抗体的制备方法，可为快速检测食品中庆大霉素残留服务。
文档编号C07K14/435GK101429242SQ200810162589
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月4日 优先权日2008年12月4日
发明者吴建祥, 张少恩 申请人:浙江大学