专利名称：用于产生7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的方法
用于产生7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢瘗吩的方法 本发明涉及用于产生7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩(I)的方法，
所述7-曱氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩是头孢西丁合成的中间体， 所述方法是使用生物催化剂的创新方法。
头孢西丁属于头霉素类，即p-内酰胺抗菌素类，其特征在于在头 孢烷环的7位存在一个甲氧基。
在US4297488中描述了上述抗生素，其说明包含使用各种试剂的 多种脱乙酰化中间体氨曱酰化的不同合成路线，所述合成路线在羧基 和/或氨基上使用不同的保护基团。其还描述，尽管反应很慢(6-15 小时)而且没有对于所获得产物质量的评论，使用来源于柑橘类水果 皮的乙酰酯酶，经过酶促水解能产生这些衍生物中的某些。在 Tetrahedron Lett 46， 4653-6 ( 1973 )中，该同一作者也对相似方 法进行了描述，即使用保护的中间体如对硝基千基酯，在其上进行脱 保护和酶促水解反应，因此产生羧酸形式的7-甲氧基-3-脱乙酰基头 孢噻吩。然后，用氯磺酰基异氰酸酯处理该产物获得头孢西丁。
在现代化学中，工业规模通常应用的合成路线是以7-ACA("7-氨 基头孢烷酸)作为原料，生产光学纯的头孢西丁，并且所述合成路线 包含四个主要步骤，并优选以下列顺序进行
1. 7位氨基的酰基化
2. 在7a位引入甲氧基3. 3位乙酰基的除去
4. 在先前的步骤3中获得的羟基基团的氨曱酰化
步骤1相当于一种头孢菌素、即头孢噻吩的合成。然后通过甲氧 基化使其转化成相应的头孢噻啶以生成中间体II (步骤2):
然后脱乙酰化生成化合物I。
尽管其它顺序是可能的，但是由于无需针对氨基或羧基使用保护 基团，所以前述步骤是有优势的，并因此使必要的操作的数目最小化， 从而使得节省了原料。
例如，WO2004/083217A1 (第6页)中描述在冷却到-45。C的水-甲醇混合物中使用氬氧化钠的所述中间体II的皂化反应；在用酸碱中 和后，在水解的整个过程中维持该温度，并且仅在反应结束后升高温 度。
在适度的温度经蒸馏除去甲醇之后，化合物I作为二苄基乙二胺 盐被分离；因此明显的是，即1)为了满足用于所述反应的极低温度 的需要而使用甲醇是合理的，并且2)在分离所述产物之前，除去所 述溶剂是必要的。
如EP1748049A2中所描述的，可选择地，能以经酸化作用的非解
离形式或作为碱性盐、例如四丁铵在溶剂中提取所述产物。
通过如上述的专利所描述的异氰酸酯基团，或如US4292427中的 实施例所描述的其它异氰酸酯基团的氨甲酰化，从化合物I中获得头 孢西丁。
在所有情况下，因为P-内酰胺结构的不稳定性和在极端碱性条件 下操作的需要，所以在极低温度下进行化合物I的脱乙酰化生成化合 物II，以防止产物降解；因此使用有机溶剂以降低所述溶液的水点。
因此，这些方法要求数千升的溶液冷却到-45t:量级的温度，通过使用制冷机或制冷液(例如液氮)使这些温度在整个反应期间得以维
持；这导致了大量的能源成本。然后，在真空下，通过加热到+30/+40 x:蒸馏除去所述溶剂，其带有进一步的大量能源消耗(对于加热所述 溶液以及所述真空泵和冷凝器制冷操作两者而言)。
由于溶剂务燃性、可能的操作者中毒、蒸汽向环境的释放以及由 于产生含有甲醇的水性流出物的缺点，因此还必须考虑溶剂、例如甲 醇的使用涉及危险，所述溶剂必须适当处理。
因此，更加生态相容性的路线是非常合乎需要的，例如仅在常温 的水中就发生的水解反应。为了在合理的时间完成这样的水解反应， 并且避免产物降解，需要催化剂，例如酶。
已经知道头孢菌素类(不是作为化合物II的头霉素类)的酶促脱 乙酰化有一段时间了 ，并且已经描述了与不同来源的酶的反应。
例如Gilbert等在GB1121308 (Glaxo， 1964 )中所描述的来源于 麦芽的乙酰酯酶，Jeffery等在Biochem， J. 81，第591-6页(1961) 中所描述的存在于柑橘类果皮中的酶。
上述US4297488描述了由来源于柑橘类水果的乙酰酯酶催化的各 种头孢西丁合成中间体的酶促水解；然而，因为所述催化剂的不良表 现，其中描述的方法不适用于工业规模。这是一种比活度很低的酶， 其涉及极长的反应时间(描述为6-15小时)，难以生产，因为其源于 受季节变化影响难以再制的来源。此外，它以溶解的形式应用，不是 循环的，并且既没有描述酶的纯化也没有描述酶的固定。没有描述获 得的乙酰基衍生物的产率及其质量。
从 Jcre/z/on/u迈c力r/soge/2w迈(或斗支顶头抱((7e/7力a/o^por/w/n acre仿o/ /咖))以及棒状链霉菌(5Yrepf呵ces c/flra//geri/s)中 头孢菌素C的生物合成路线中所涉及的那些开始，已经发现其它对头 孢菌素类有效的酶；这些被认为是不合需要的酶活性，因其导致脱乙 酰化头孢菌素C, 一个发酵副产物的形成。应该注意的是，在yocar力'a /ac^顶o^/ra;^和棒状链霉菌中头霉素类的生物合成不包含在头霉素 上所述乙酰基的7JC解作用(P. Liras， Antonie van Leeuwenhoek 75，1999，第109-24页)；因此，在头霉素类上乙酰酯酶的活性是未知的， 甚至在产生头霉素的微生物中。
已经描述了在7-ACA或头孢菌素C上的乙酰基的酶催化水解，但 是没有描述在头霉素类上的乙酰基的酶催化水解；特别地
1) 由枯草杆菌产生的酯酶(Abbott和Fukuda， Antimicrob Agents Chemother 8， 3，第282—8页，1975和Appl Microbiol, 30， 3， 第413-8页1975 )以固定的形式用于水解7-ACA为3-脱乙酰基-7-ACA。 所述酶足够有效和稳定，但是倾向于从固定载体上脱离。其他作者
(Takimoto等Appl Microbiol Technol 65，第263—7页，2004 )描 述了在重组的大肠杆菌中该酶的发酵，其纯化和在固体载体上的固定 及其生产3-脱乙酰基-7-ACA的应用。
2) Politino等在Appl Environm Microbiol 63， 12，第4807-11 页，1997中描述了红冬孢酵母产生对7-ACA有活性的酶，其可以以非 发酵生物质(静息细胞)的形式或作为一个分离和纯化酶的形式在该 反应中用作催化剂。但是，该酶对于头孢噻吩所表现出的水解活性是 低的，仅为对于7-ACA的34°/。。没有描述头霉素类的水解。Chiang等
(US 2002/0048781BMS， 2002 )也使用同样的酶，其描述了一抹能表 达来自红冬孢酵母属的乙酰酉旨酶的重组Acremonium chrysogenum用于 在发酵肉汤中直接产生脱乙酰化头孢菌素C。
3) Venturi等在Appl Environ Microbiol 64， 2，第789-92 页，1998中描述了另一个乙酰酯酶，所述乙酰酯酶是由短小芽胞杆菌 产生的木聚糖酯酶， 一种与木聚糖降解有关的酶，其还显示出对7-ACA 和头孢菌素C的活性；其它出版物描述了在大肠杆菌中同样酶的表达。 没有描述对头霉素类的活性。
因此，在现有技术中，头霉素的乙酰基的酶促水解从来没有以工 业规模应用；而且，尽管有大量可得的关于头孢菌素类中相似反应的 文献，但是没有描述可用于头霉素类的足够有效和稳定的酶。
本发明的一个方面是制备式I化合物的方法，其中式n化合物经 历乙酰基水解，其特征在于在pH值5-9之间(优选6-8之间)，温度在-10。C和+45。C之间(优选0"C和+201C之间)，在由至少一种具有乙
酰基-水解活性的酶组成的生物催化剂存在下，在水中进行所述水解， 且最后通过公知的方法从反应介质中分离所述酶。
特别地，该生物催化剂可从选自红冬孢酵母、短小芽孢杆菌、大
肠杆菌、Acremonium chrysogenum和棒状链霉菌的微生物中获得，并 且可以游离蛋白或固定在固体栽体上的形式存在，或由所述微生物细 胞自身组成。在反应结束后，可以分离和再利用所述生物催化剂，而 所述化合物I可以作为有机碱的盐通过沉淀或通过在溶剂中提取从所 述水溶液中分离。优选地，已经发现，所述有机碱选自二爷基乙二胺 及其盐。
与现有技术相比，新方法呈现出许多优势，可概括如下
由于避免使用有害的溶剂(例如甲醇)和强腐蚀溶液(例如氢氧 化钠)，具有更高的工作安全性，
通过在室温工作节省了大量能源，从而避免为了达到和维持通常 用于这些情况中的低温(例如低于-45'C)而需要消耗的大量能源，
通过避免在真空下的溶剂蒸馏(一个需要大量时间的步骤)具有 更高的生产率。
获得了与通过目前公知的方法可获得的产物质量相当或比其更好 的产物。
详细描述
从市售的优品质和低价的原料头孢噻吩开始制备中间体II;可以 通过已知的方法从7-ACA生产同样的头孢噻吩。通过已知的方法操作， 使用氯化剂和甲醇钠，在极低温度进行甲氧基化反应。在反应结束后， 可以碱性金属的盐或有机碱的盐分离所述化合物II，或可以在水中以 羧酸盐的形式提取所述化合物II。在W02004/083217实施例1步骤i 描述了 一条方便的合成路线。
为了所述酶的脱乙酰基化，使用各种催化剂，所述催化剂通过已 知方法或如下列实施例所描述的制备。如WO2004/083217中所描述的，反应产物(化合物I)作为二千 基乙二胺盐被分离，或依照在EP 1748049A2中所描述的步骤，反应产 物(化合物I)或作为a)非解离形式的酸，或b)四丁胺盐在有机溶剂 中被提取。
以已知方法操作，通过与氯磺酰基异氰酸酯反应，从化合物I获 得头孢西丁，从而获得适合药用的优质产物。
在下列实施例中说明所述方法，但是认为其是非限制性的。
实施例1
7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的化学合成
将通过已知步骤制备的、且作为酸具有约69%滴定度(约等于500 毫摩尔)的300g环己胺盐形式的7-甲氧基头孢噻吩(溶液A)加入到 1升水和1. 15升甲醇的混合物中。将该混合物冷却到-37X:。
分别地，在300ml水中制备160g的30%氢氧化钠的水溶液，并冷 却到+5"C，然后将其緩慢倾入溶液A，并且在加入完成之后在-45iC /-35t:之间维持温度约一个小时。通过HPLC分析监测反应动力学当 残留的7-甲氧基头孢噻吩低于0. 7g/1时，加入90g的80%的乙酸中断 反应，同时维持温度在-5X:之内。监测pH，其必须为中性，如有必要， 并校正至6. 8-7. 0。在真空下将混合物加热到+30/+35匸进行蒸馏直到 获得浓度约为100g/l的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩，然后用碳脱 色。为了达到约为80g/l的浓度，将体积稀释至大约1.9升，然后加 入300ml乙酸乙酯和130g二节基乙二胺双乙酸盐，加入少量固体产物 以触发沉淀。将混合物冷却到0/+5C并且维持该温度直到母液中产 物浓度低于10g/l为止，然后经布氏漏斗过滤。用水、接着用乙酸乙 酯洗涤固体，然后在85%乙酸乙酯/15%丙酮混合物中捣碎得到无水产 物。
获得约208g 7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二苄基乙二胺盐，作 为酸其滴定度约为70%，等于380毫摩尔，摩尔产率为76%。实施例2
使用红冬孢酵母生物质7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢漆吩的酶促水
如文献中所描述的，使红冬孢酵母ATCC 10657在烧瓶或发酵罐 中从接种开始生长72小时，取回全部肉汤样本用于监测产生的乙酰酯 酶的量。以国际单位(IU)表示所述酶活性，其等于每分钟转化的底 物的微摩尔，并且通过7-ACA (在水中20g/l )的水解确定；反应的温 度控制在+25X:，通过自动滴定(pH-stat, Crison Instruments SA， Barcelona, Spain )加入0. 1M NaOH使pH控制在6.5。生长肉汤在 10000 r. p. m.离心15分钟，将沉淀重悬于磷酸盐緩冲液中并再次离心， 以获得具有每克约6-10 IU比活性的糊状湿细胞。
将40. 8g的7-曱氧基头孢噻吩环己胺盐溶解在约250ml水中，并 用3N的氢氧化铵校正pH至7. 0,设置滴定器以维持pH为7. 0，将温 度控制在+20。C，并加入50g的红冬孢酵母属细胞糊。在约1小时30 分后，反应完成，通过离心分离细胞以获得约340ml的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩溶液，其用碳脱色并经纸过滤。加入55ml乙酸乙酯 和17. 7g 二千基乙二胺双乙酸盐，如实施例1中所述分离产物。
获得约28g 7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二卡基乙二胺盐，作 为酸其滴定度约为70%，等于51毫摩尔，摩尔产率为77%。
红冬孢酵母属细胞对于各种水解循环而言可再次利用。
实施例3
用来自红冬孢酵母的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩 的酶促水解
如实施例1中所述获得的红冬孢酵母生物质经EDTA(乙二胺四乙 酸)处理后裂解，获得含有乙酰酯酶活性的水溶液，所述水溶液按照 文献中已知的方法(Politino等Appl. Environ, Microbiol, 63， 12， 第4807-11页，1997 ),通过羧甲基Sepharose经色i普纯化。
将按照实施例1制备的870g的7-甲氧基-头孢噻吩二苄基乙二胺盐溶解，校正pH到7. O，将体积稀释到总共为6000ml，然后加入200ml 的乙酰酯酶溶液，并且用3N氢氧化铵通过自动滴定将pH维持在7。 反应结束时，使用带有Nanomax膜以及lOOOODa截止点的Millipore ProScale仪器，通过超滤从所述产物中分离所述酶。从渗透物中获得 约5升7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢瘗吩溶液，如实施例1所述将其分 离，含有所述酶的浓缩物用于在下一个水解循环的再次利用。如实施 例1所述分离化合物1。
实施例4
用重组的大肠杆菌生物质的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的酶 促水解
来自短小芽胞杆菌的酶乙酰基木聚糖酯酶在通过如Venturi等在 Microbiology 146，第1585-91页(2000 )中所描述的方法获得的重 组大肠杆菌中表达。
如实施例3中所描述的，使用340g的大肠杆菌生物质作为催化剂 水解7-甲氧基-头孢噻吩；反应结束时，通过超滤分离7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢瘗吩溶液，如实施例1中所述分离二节基乙二胺盐形式 的产物。
超滤截留物是部分裂解的大肠杆菌细胞和游离酶的悬浮液，其在 随后的循环可再次利用。
实施例5
用固定在环氧树脂上的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻 吩的酶促水解
通过在1000bar使用细胞破碎压榨机(Constant Systems Ltd.) 破坏细胞，然后在20000 r.p.m.离心30分钟，从而使如实施例4中 所描述的重组大肠杆菌中产生的木聚糖酯酶部分纯化。通过用lOKDa 膜ProScale Millipore仪器超滤进行透析由此获得的上清液，然后 如文献(Venturi et al. ， Microbiology 146，第1585-91页，2000 )所描述的，在Sepharose Q Fast Flow树脂上进行色i普分析。
通过超滤浓缩部分纯化的酶，然后用pH为8的IO倍体积的1.2M LHP04溶液稀释，接着固定在环氧树脂Sepabeads EC-EP ( Diaion SpA， Mitsubishi)上，每克树脂120 IU的装载量。搅动所述树脂悬浮液 48小时，然后经布氏漏斗过滤，并用IO倍体积的水洗涤(每克树脂 10ml);获得活性约为70 IU/克的固体催化剂。
将100g的7-曱氧基-头孢噻吩环己胺盐溶于总体积为450ml的水 中，然后使用作为催化剂的66g固定酶进行水解，并使用3N氢氧化铵 通过自动滴定维持pH恒定在7。
2.5小时后反应完成，经烧结玻璃漏斗过滤酶，通过加入50g的 二千基乙二胺双乙酸盐，并如实施例1中所述搮作，分离7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩。
获得69. 6g产物，其作为酸7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩滴定 度为70. 8%，摩尔产率为78°/。。
所述催化剂可以在多次反应循环中再次利用。
实施例6
用固定在氨基树脂上的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻 吩的酶促水解
如实施例5中所描述的，将如实施例4中所述的在重组大肠杆菌 中产生的来自短小芽胞杆菌的酶乙酰酯酶进行纯化。
将100g的Sepabeads EC-HA树脂(Diaion)用水充分洗涤，然后 悬浮于100ml pH值为7的0. 2M磷酸盐緩冲液中。加入UOml的25% 戊二醛水溶液，并且于搅拌下放置16小时，然后加入总共12000 IU 的纯化酶溶液。3小时后，混合物经布氏漏斗过滤，并用水充分清洗。 获得活性为55 IU/克的催化剂。
如实施例5中所描述的，使用84克固定的乙酰酯酶进行水解。如 实施例1中所描述的，反应3小时后，滤除所述酶并且所述二苄基乙 二胺盐沉淀。获得的产物在四倍体积的异丙醇(重量/体积)中悬浮并过滤，获得68g的7-曱氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二千基乙二胺盐， 其滴定度为70.5%,相当于摩尔产率为76%。
所述催化剂可以在多次反应循环中再次利用。
实施例7
用固定在乙醛酰树脂上的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢 瘗吩的酶促水解
用水充分洗涤100g的Sepabeads EC-HA树脂(Diaion)，然后加 入800ml的0. 05M偏高碘酸钠溶液；在1. 5小时后所述混合物经布氏 漏斗过滤，并用水充分洗涤。将所述树脂悬浮于700ml pH值为10的 50mM碳酸氢盐緩沖液中，然后加入如实施例5中纯化的12000 IU的
1小时后，加入1400ml的lmg/ml的硼氢化钠水溶液，让其反应 30分钟，然后经多孔挡流板过滤，并用水充分洗涤。获得活性为38 IU/ 克的催化剂。
如实施例5中所述进行水解反应；3.5小时后，中断反应并分离 产物。获得65g的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二苄基乙二胺盐， 其滴定度为70%,相当于摩尔产率为73%。
所述催化剂可以在多次反应循环中再次利用。
实施例8
来自二氯曱烷溶液的7-甲氧基-头孢噻吩的酶促水解 如WO2004/083217A1中所述，在二氯甲烷和甲醇中使用N-氯代-琥珀酰亚胺和曱醇钠进行头孢噻吩的甲氧基化反应。在用水溶液洗涤 后，获得82g/1酸7-甲氧基-头孢噻吩的二氯甲烷溶液。
用约300ml水提取500ml 二氯甲烷溶液，用10% (w/v)的碳酸钠 水溶液进行滴定以获得最终pH为8. 0;分离所述相，并且用少量水洗 涤亚甲基相获得355ml的109g/l水性的产物溶液，相当于提取率为 94%。在+25"C真空下蒸馏水相消除溶剂残余物。如实施例6中所描述的，用40g的酶水解所述水相，并用10%(w/v) 的碳酸钠水溶液控制pH值，2小时后，中断反应并分离产物。获得33g 的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二爷基乙二胺盐，其滴定度为 70. 8%。所述催化剂可以在多次反应循环中再次利用。
实施例9
在不分离中间体的情况下合成头孢西丁
如实施例8中所述制备7-曱氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩，获得浓 度为80g/l的水溶液，其用2g碳脱色。按照EP1748049A2中所描述的 步骤，过滤后，加入固体NaCl直到饱和，并用溴化四丁基铵的二氯曱 烷溶液提取所述溶液。在四氢呋喃中用氯代磺酰异氰酸酯实施氨基曱 酰化，分离酸头孢西丁，然后如相同专利所述，将所述头孢西丁转化 为相应的钠盐。
获得13g头孢西丁钠。
实施例10
作为酸或钠盐的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的分离 如实施例6中所述进行反应；水解结束时，过滤所述催化剂并再 次利用，然后酸化水溶液直到7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩开始沉 淀。使沉淀持续30分钟，然后加入盐酸直到pH值为2.5，冷却到+4 。C。所述混合物经布氏漏斗过滤获得白色固体状的7-甲氧基-3-脱乙 酰基头孢漆吩。用乙酸乙酯提取母液，分离相并向有机相中加入2-乙 基己酸钠，获得7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩钠盐的沉淀。
实施例11
在水混悬液中7-甲氧基-头孢噻吩的酶促水解
将130g的7-甲氧基头孢噻吩环己胺盐悬浮于300ml水中，然后 加入10。/。(w/v)的碳酸钠水溶液使pH值为7;获得悬浮液，向其中加 入如实施例6所述制备的100g固定酶。将温度控制在+20C且pH值恒定条件下实施反应；随着水解进行观察到底物完全溶解。持续该过程 直到获得低于0.5g/l的7-甲氧基-头孢噻吩残余物，然后如实施例1 中所述滤除所述催化剂并分离产物。获得98. 3g的7-甲氧基-3-脱乙 酰基头孢噻吩二千基乙二胺盐，其滴定度为70%,摩尔产率为85%。
实施例12
通过7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的二卡基乙二胺盐的热沉淀 分离7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩
如实施例中11所述进行反应。唯一的区别是在加入所述二千基乙 二胺双乙酸盐前将水/乙酸乙酯混合物加热到+35"C。为了引发7-甲氧 基-3-脱乙酰基头孢蓉吩二节基乙二胺盐的沉淀，将温度维持在+30/35 "C约30分钟，并在过滤前逐渐冷却到+4X:。获得约为85%的摩尔产率。
实施例13
用于沉淀7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的二爷基乙二胺的应用 如实施例11中所述进行反应。唯一的区别是向7-曱氧基-3-脱乙 酰基头孢噻吩水溶液中加入10 vol。/。的甲醇，然后加入乙酸乙酯，在 加入二千基乙二胺碱之前，加热到+30/35。C。在过滤前将混合物逐渐 冷却到+4。C。获得约为85%的摩尔产率。使用乙醇、异丙醇或甘油替 代曱醇获得相似的结果。
实施例14
作为温度的函数的乙酰酯酶活性
制备乙酸乙酯(O. 5ml)在pH值为7的50mM磷酸盐緩沖液中的溶 液(50ml),然后用IOO微升来自大肠杆菌中的重组短小芽胞杆菌的 乙酰基木聚糖酯酶实施水解，所述乙酰基木聚糖酯酶如实施例5所述 使用游离非固定蛋白制备。
在温度+10t:到+35。C之间，在通过自动滴定的恒定pH下进行各项 测试，在反应的最初IO分钟期间，基于碱的加入速率，计算每次测试所述酶的水解活性。
通过用0. IN的NaOH滴定经所述酯水解释放的乙酸量，并通过以 下公式计算，将所述活性表示为每ml溶液的国际单位(IU): IU-[平均NaOH消耗量(ml/min) xl00xf]/样本体积(ml) 其中f=0. IN的碳酸钠滴定度的校正因子
平均消耗量-在滴定的最初10分钟内0. IN的NaOH的消耗量，以 ml/rain表示
样本体积-乙酰酯酶溶液的体积，以ml表示。
对表示的酶活性对反应温度绘图，得到如附图l所示的图。 如实施例5到7中所述，使用固定在树脂上的蛋白获得相似的结果。
实施例15
作为PH的函数的乙酰酯酶活性
按照实施例14中所描述的步骤，溶液温度控制在+25'C，通过自 动滴定维持pH恒定将在5-9之间。如实施例14中所述计算水解活性， 并将活性以IU/ml对操作pH绘图，获得附图2的曲线。
实施例16
作为pH和温度的函数的7-甲氧基-头孢噻吩的水解动力学 如实施例6中所述制备200g/1的7-甲氧基-头孢噻吩溶液，并用 来自大肠杆菌中的重组短小芽胞杆菌的乙酰基木聚糖酯酶水解，但是
在pH为5. o-9. o之间并温度在-iox:到+35r;之间操作。在温度低于o
r的情况下，向水溶液中加入IO vol。/。的甘油。
进行反应，直到获得的7-曱氧基-头孢噻吩的残余物低于lg/1终 止反应。
附图3显示的仅仅是一些反应动力学。取决于反应条件，可获得 的产物产率和质量受可能的产物降解的影响。用固定乙酰酯酶的7-曱氧基-头孢噻吩的水解
按照实施例5中所描述的步骤，如实施例5-7中所述使用固定在 树脂上的乙酰酯酶，并且在pH为5并+35C下操作。反应终止时，停 止搅拌，倾析所述催化剂，然后通过虹吸作用分离溶液，并且如实施 例11中所述分离化合物I，获得7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩，其 滴定度为69%。在pH为9,温度为-10t:下操作，并向水溶液中加入 10%甘油得到相似结果。
实施例18
从7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩合成头孢西丁 例如象W02004/083217A1中所述，通过与氯代磺酰基异氰酸酯反 应，将通过实施例1 (样本A)和实施例12 (样本B)所描述的步骤获 得的两个7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二爷基乙二胺盐的样本转化 为头孢西丁。获得相同的摩尔产率。
图l是对表示的酶活性对反应温度绘图。 图2是将活性以IU/ml对操作pH绘图。 图3是显示的仅仅是一些反应动力学。
权利要求
1. 制备式I化合物的方法，其中使式II化合物经历乙酰基水解，其特征在于所述水解在pH为5-9之间，温度为-10℃和+45℃之间，在由至少一种具有水解乙酰基活性的酶组成的催化剂存在下，在水中进行。
2. 如权利要求1所要求保护的方法，其特在于所述催化剂由固 定在固体载体上的酶组成。
3. 如权利要求1所要求保护的方法，其特征在于所述酶是由选 自红冬孢酵母、短小芽胞杆菌、大肠杆菌、Acremonium chrysogenum 和棒状链霉菌的微生物获得的。
4. 如权利要求1所要求保护的方法，其特征在于通过沉淀从水 性反应介质中获得作为有机碱的盐的所述式I化合物。
5. 如权利要求4所要求保护的方法，其特征在于所述有机碱选 自二节基乙二胺和其盐。
6. 如权利要求1所要求保护的方法，其特征在于所述水解温度 在0X:和+22X:之间，所迷pH在6-8之间。
全文摘要
用于通过水解生产7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的方法，其在水中发生并且用酶催化。通过已知的方法，由该化合物可以获得头孢西丁。
文档编号C07D501/00GK101418331SQ20081016980
公开日2009年4月29日 申请日期2008年10月7日 优先权日2007年10月9日
发明者A·R·塔格利亚尼, G·古阿斯塔勒格纳米, G·弗格利亚托, R·蒙古齐 申请人:艾斯.多伯法股份公司