专利名称：水稻株型相关基因rl10及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种水稻株型相关基因瓜"及 其应用。
背景技术：
水稻优异基因资源的发掘是超高产育种的物质基础，研明控制水稻株 型和产量相关基因的功能对水稻育种具有重要的推动作用。本研究在自己 创建的突变体库中筛选到一个株型和产量性状发生突变的材料(W")， 采用图位克隆策略，克隆了 / 7"基因，获得了该基因的编码序列。该基 因的克隆和功能分析在水稻中是首次报道，不仅在水稻发育中具有重要作 用，而且在水稻高产育种具有重要的利用价值。
F-box蛋白含有F-box基序(motif)，是SCF复合体的一个亚基，它决定底物识别 的特异性。SCF复合体是一种非常重要的E3泛素连接酶，SCF名称来源于3个亚基 Skpl、 Cull和F-box蛋白，因此，F-box蛋白质介导的泛素化蛋白质降解途径可能与 植物基因表达调控有重要联系。目前，从各种植物中已鉴定出大量的F-box蛋白质， 它们^与了植物激素(乙烯，生长素，GA， JA)的信号传导、自交不亲和和花器官发 育等生物学过程以及植物的胁迫反应。在拟南芥中一个F-box蛋白TIR1是生长素的受 体，它介导一系列生长素反应。但至今没有关于F-box蛋白具有调控叶片极性发育的 报道。
发明内容
本发明的目的是提供一个水稻新基因厄"，它既能提高产量又能控制 优良株型。
所说的水稻基因巡"，它具有SEQ ID NO. 1所示的序列。 粳稻品种中花11通过辐照获得巻叶突变体r7M(7^7j'/^7朋/7仍， 本发明利用该突变体与籼稻品种Dular杂交配置F2群体，采用图位克隆的 方法分离了^^^ 基因，并通过互补和RNA干涉试验验证了候选基因，最 终证实瓜70基因编码F-box蛋白，控制水稻叶片的极性发育和穗部的形
态建成。
本发明所克隆的厄"基因功能丧失后，植株整体株型紧凑，长势稳 健，茎杆更加粗壮，叶片表现半巻，剑叶挺举(图1)，光合作用效率提高，
同时一次枝梗数、二次枝梗数以及每穗粒数显著增多(图2)，单株产量相 比对照提高了 10 20%。
该基因在水稻高产育种中具有广阔的应用前景。利用途径有二第一， 直接通过回交方法，将本发明中的r110突变体所携带的r110基因导入高 产品种中，改良现有品种的株型、穗型等；第二采用RNA干涉途径，将 现有高产品种中的RL10基因沉默，获得r110突变体的表型。
图1是水稻中花11及其突变体r110的植株形态
图2是水稻中花11及其突变体r110的穗部形态
图3.及"0基因的图位克隆及和r〃0-2的突变位点
A) 及Z70在第2染色体的连锁图谱。竖线表示分子标记的位置，遗传距离(厘摩， cM)标在图谱下方相邻的标记之间，图谱右侧的数字表示定位用的群体大小；
B) i 丄W的精细定位。物理图谱下方的数字表示所用标记在F2或F3群体中检测到 的交换个体数。覆盖i Z川的物理图谱以10个PAC构建，注册号分别为:BAC1: AP004875; BAC2: AP006844; BAC3: AP004801; BAC4: AP005803; BAC5: AP006160; BAC6: AP005777; BAC7: AP005631; BAC8: AP005924; BAC9: AP004683; BAC10:AP005428。
利用F3群体中的66株隐性个体，将定位在f70和f87之间38-kb的区段 上，与伤6和f85共分离；
C) 在38-kb的定位区间内有5个基因(TIGR网站的基因预测结果)；
D) i 丄/0在AP006160上的位置及两突变体的突变位点。及Z70基因不含内含子。 W70-7和WM-2突变序列标示在底部，发生了 1个单核苷酸替换(T—C)， W70-2 在终止子前缺失了两个碱基。
具体实施例方式
中花ll: (Plant Molecular Biology, 2008,68:239 - 250)，来自中国农科院。 籼稻品种Dular:(遗传学报，2000， 27 (5) : 409-417) pCAMBIA1301-ubi:购自Takara公司
农杆菌EHA105:购自Takara公司 pCAMBIA1300:购自Takara公司
实施例1:
0.材料的获得
1999年，利用同位素6°0)辐射中花11成熟种子，在Ml代中筛选得到巻叶突变体 2个，分别命名为r110-1和r110-2。该突变体与野生型(WT)品种中花11相比，叶 片变巻，每穗粒数增多，茎杆更加粗壮，剑叶挺举(图l)。。
1基因的初步定位
用W川-^Dular的F2群体作为初步定位群体。由于在这个F2群体中出现了一些介 于双亲中间类型的个体，因此取样时结合了突变体的另一个标志性状——密穗，即所 取单株兼具巻叶和密穗两种表型特征作为指标。r〃0-7xDular的F2群体共2OO株，收 取其中表型与突变体相似、性状准确的单株27株，由这27株隐性个体组成初步定位 群体。
由于r〃0-7突变体与突变体都来源于中花11背景，因此直接利用突 变体与Dular筛选出来的多态性标记(Plant Molecular Biology, 2008,68:239-250)，分 析初定群体中的8个单株，发现第2染色体上的微卫星标记RM424和RM475与i U0 表现连锁，进而利用这两个标记对27个单株进行分析，分别检测到5和11个交换株。 丰艮据网站(http:〃www.gramene.org/db/markers/marker—view action=view—map—sets)提 供的SSR遗传图谱发现，RM424位于短臂，RM475位于着丝点附近的长臂上，因此 推测i ZJ0很可能位于第2染色体的短臂一端。
由于在短臂上没有找到其它多态SSR标记，于是我们在短臂上、基因可能存在的
区段内每隔1Mb发展一些标记，共设计了 32个STS标记用于初步定位，其中有14 个在两亲本间有多态，利用这14个多态标记对27个单株进行分析。
用MAPMAKEER3.0软件对这些标记分析的结果进行分析，把基因初步定 位在f24和RM424之间，与两标记的遗传距离分别为7.4cM和9.3cM (图3A)。
2 / 丄W基因的精细定位
我们从W/0-7xDular F2自交得到的97个F3分离株系中收获了近2000株隐性个体， 先提取了66株个体的DNA用作基因的精细定位。
在基因初步定位所限定的两个标记f24和RM424之间，密集发展了 STS标记进 行精细定位。利用在亲本间有多态的标记对66株个体进行检测，很幸运，在AP006160 上找到了 2个与i ZJ0表现共分离的标记伤6和f85，它们两侧的两个标记f70和f87 分别检测到2和1个交换株，这四个标记在AP006160上的顺序是f70-f66-fB5-f87，因 而将J i:^定位在f70和f87之间，它们相距约38kb，以此构建了覆盖巻叶基因i Z^ 的物理图谱(图3B)。
3两突变基因等位性分子水平的检测
利用精细定位中与共分离的标记f66和f85检测组合W70-2xDular F2群体中 选得的30株隐性个体，结果表明，这两个标记与rW0-2也表现共分离，因而推测这两 个巻叶突变基因可能等位。
4基因预测及序列测定
根据TIGR网站(http:〃www.tigr.org/tdb/e2kl/osal/irgsp.shtml)的基因预测结果， 在i Z70所在的区段上存在五个候选基因(图3C)，基因1和3编码假设蛋白，基因2 编码F-box蛋白，基因4和5编码未知蛋白，其中基因2和4有cDNA支持。对这五 个基因在两个突变体和野生型品种中的测序结果分析发现，F-6o;c基因在W70-7和 r/M-2中均发生了突变，其它四个基因未发现序列差异。变异表现为在r/70-7的编 码区中发生了一个单碱基替换，T—C，导致一个丝氨酸突变成脯氨酸；WM-2中在终 止密码子前发生了两个碱基的缺失，导致翻译滞后终止(图3D)。测序结果进一步证 实了两突变基因等位，因此本研究将该F-6ox基因确定为的候选基因。
5 RL10基因编码区的验证
虽然RL10的候选基因F-6ojc基因在数据库中有两条cDNA (注册号 AK073921和AK 064350)支持，但是不同网站或软件预测的编码区仍存在差异，在 AP006160上，水稻基因组自动注释系统(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)预测的基因编 码区位于82839-84056，无内含子，长1218bp，预测编码405个氨基酸，利用Fgenesh 软件预测的结果跟它一致；TIGR预测的基因存在两个外显子，分别位于81630-81919 和82799-84056，编码区长1548bp，预测编码515个氨基酸。
由于编码区的正确获得在基因功能分析中十分重要，因此有必要验证TIGR网站 预测基因的第一个外显子是否存在。为此我们根据其预测的编码区序列设计了两对引 物，F72f/F72r和F73f/F73r，产物均含有预测的内含子，分别以野生型品种中花11叶 片的总DNA和幼叶的cDNA第一条链为模板，进行PCR扩增，以F68 (83089-83621) 作cDNA模板扩增的对照，电泳结果发现，F68在cDNA中能扩出预期533bp的条带， 证明cDNA可用作PCR模板，F72和F73两个标记在gDNA中都能扩出特异的预期大 小的片段，分别为1518bp和1168bp，而在cDNA中无产物(图3.3)，由此表明，TIGR 预测的第一个外显子不存在。
进一步将数据库中的两条cDNA序列进行分析发现，这个F-6o:c基因的真实起始 密码子较水稻基因组自动注释系统预测的基因还提前9个核苷酸，即位于82830处， 因此i "0基因的最终位置确定为82830-84056 (图3.2D)，长1227bp，编码408个氨 基酸(图3.4)。
6 RNAi试验
本发明选取厄2(9基因533bp (从该基因起始密码子开始至下游533bp 区域)的编码片段构建干扰载体，该片段避开了F-box基序，且经全基因 组比对分析确认该片段在水稻基因组中无其它同源序列。将目的片段连接 到载体ihpRNA上形成发夹结构，然后切下该发夹结构连接到改造过的带 有Ubi启动子的载体pCAMBIA1301-ubi上，构建成表达载体RL10-Ri。将 质粒RL10-Ri通过热击导入农杆菌EHA105，转化野生型品种中花11幼胚。 T。代获得了RNA干扰表型的转基因植株，L代发生3: 1 (正常突变)分 离，所有突变株表型均类似WM突变体，叶片挺举，株型优良，而且每
穗粒数明显增多。
RNA干扰片段引物
<image>image see original document page 8</image>Fil的前后引物5'端分别加Aa/rfil和Spel接头，Fi2的前后引物5 '端分别加万Bg1 II和Xba I接头，PCR扩增片段大小均为533bp。
7互补试验
将F-box 基因起始密码子上游2. 5Kb，终止密码子下游1Kb所覆盖的区 段(共计4.7Kb)，利用限制性内切酶从BAC克隆AP006160上切下，连接 到表达载体pCAMBIA1300上，通过农杆菌介导转化突变体7。共获得 独立转化子32个。所有转化子都恢复了野生型品种中花ll的表型。证实 了F-box基因即为瓜M的候选基因。
SEQUENCE LISTING
aio〉扬州大学
〈120〉水稻株型相关基因厄7。及其应用 <160〉1
<210〉1
<211>1227
〈212〉mRNA
<213>水稻(O"fl sariva L)
〈400〉1
atgctggcaatggggtc卿ggagtgggagttgtatccatcttccttcattggtgctcag60
gtcatageittatgggcatgtttctggagacatggatgatgatc卿gtggagacttggcc120
gtgtcgatggacgccgttctccctgatgatcttttagaaaaggtcctctccttcttgcct180
gUgcaagtgtcataagatctggatctgtttgc幼gagatggcatg卿ttgtgcatgcc240
cgg鄉c卿catggagc犯aatggtgcctcagaagccttggtacttcatgtttacctgc300
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犯g鄉cttgttgatgctcctggtggc鄉tcggctgattacagtgctctCgCCEltttct540
gtgaccaggacctctcatcagtacatggtggctgttgc犯ggtgcaaccaggtgccatca600
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tcactgaagagccctgtgacga卿ggtttcctctgcagctgtttactggtttctcttU1200
gagcctaggctggacattgcttcctag122权利要求
1、一种水稻基因RL10，其特征在于，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。
2、 权利要求l所述的水稻基因RL10编码F-box蛋白，控制水稻叶片 的极性发育和穗部的形态建成。
3、 权利要求1所述的水稻基因RL10在水稻高产育种中的应用。
全文摘要
本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种水稻株型相关基因RL10及其应用。所说的水稻基因RL10，它具有SEQ ID NO.1所示的序列。它编码F-box蛋白，控制水稻叶片的极性发育和穗部的形态建成。利用该基因能改良现有品种的株型、穗型，提高产量，在水稻高产育种中具有广阔的应用前景。
文档编号C07K14/415GK101386858SQ200810234929
公开日2009年3月18日 申请日期2008年11月4日 优先权日2008年11月4日
发明者松 严, 严长杰, 程祝宽, 顾铭洪 申请人:扬州大学