专利名称：新型肽酶底物的制作方法
新型肽酶底物本发明涉及用于检测肽酶活性的新型酶底物。这些底物可用于包括产生物理化 学信号的酶水解步骤的应用，尤其用于微生物学、生物化学、免疫学、分子生物学、组 织学等中。本发明还涉及含有该底物的反应介质、该底物或该介质在检测肽酶活性和/ 或区分革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌中的用途、以及使用方法。当前存在非常多的检测微生物的介质。该检测可以尤其基于使用特别的底物， 所述底物对需要检测的微生物酶具有特异性。通常而言，合成的酶底物由对待发现的酶 活性具有特异性的第一部分和用作标签(通常为发色或荧光标记)的第二部分。因此， 在细菌的情况下，取决于是否有反应来选择底物，可以表征微生物的性质。肽酶活性可 以尤其用于发现一组、一种或一类细菌。因此，例如丙胺酸氨基肽酶可以区分革兰氏阴 性菌和革兰氏阳性菌。用于检测肽酶活性的发色的酶底物由现有技术已知。尤其可以提及Manafi发 表的论文(Manafi等，Microbiol Rev 55 (3) 335-348，1991)，这是一篇关于用于微生物 学的酶底物的综述。然而，所述的氨基肽酶底物通过水解会释放在介质中扩散的化合物 (β “萘基胺，7-氨基-4-甲基香豆素)。结果导致在多相反应介质(培养皿上的菌落、 组织部分等)中，无法准确定位水解的位置。还可以提及在由本申请人提交的专利申请 \^0 98/04735和\^099/38995中描述的底物。然而，虽然这些底物不在培养介质中大量 扩散，但是它们也具有一些缺点它们难以合成，纯度低，产率低且它们对某些微生物 有毒。为此，本发明提出了用于检测微生物的新型肽酶底物。与现有的底物相比，这 些新型的底物易于合成，且由于其形成一种不在反应介质中扩散的颜色而可以尤其用于 胶体介质中以检测微生物。由此，可以从不显示肽酶活性的菌落或细胞器中，辨别显示 肽酶活性的菌落或细胞器。在对本发明进行描述之前，给出如下定义以方便本发明的公开。术语“酶底物”用于指可以通过酶进行水解以形成产物，从而允许微生物细胞 或细胞器的直接或间接检测的底物。该底物尤其包含对待发现的酶活性具有特异性的第 一部分和用作标签的第二部分。本发明的底物尤其适用于流式细胞术，这是因为水解产物主要保留在表达酶活 性的细胞中，所以可以具体数出表达该活性的细胞或者甚至将其与其他样品分开。本发明的底物还高度适用于组织酶学，这是因为水解产物主要保留在水解点 上，所以可以具体识别出在组织中表达该活性的细胞或细胞器。由于其具有低毒性，本发明的底物高度适于监测细胞培养肽酶的活性。本发明的底物还非常适合用于检测和/或识别介质中，这是因为它们形成在反 应介质中不扩散的颜色或荧光。在本申请中，术语“颜色”用于指颜色，其吸收可见光 谱中的光或荧光，其在一个波长(Aat)吸收且在较高的波长(λ_，Aem> λ J发光。本发明的底物可以成盐，即呈诸如为氯化物、溴化物、钾盐或三氟乙酸盐的盐 的形式。
术语“Μ”用于指能够通过水解而断裂出酰胺基的酶，其中所述酰胺基在肽 酶的酰基残基和伯胺之间形成。术语“氨某flt_”用于指能够通过水解而断裂出酰胺基 的酶，其中所述酰胺基在氨基酸酰基和伯胺之间形成。在本申请中，术语“肽酶”在适 当情况下可以指上述的肽酶以及氨基肽酶。术语“肽”用于指包含1-10个氨基酸，优选1-4个氨基酸的肽键链。优选， 所述肽为二-丙胺酸或三-丙胺酸。术语“氨基酸”用于指任何为本领域技术人员熟知 的天然或非天然氨基酸。根据本发明的一个具体实施方案，氨基酸为丙胺酸或L-丙 胺酸，或者为甘氨酸、焦谷氨酰等。所述肽可以包含在其N末端上的封端剂。本发明的封端剂包含任何为本领域技 术人员已知的能够保护胺的封端剂。例如可以提及叔丁氧基羰基(N-tBOC)、9-芴基氧 羰基、助溶剂如琥珀酰，或者不可代谢的氨基酸，即非天然的氨基酸如哌可酸,或者氨 基酸的D形式如D-苯基丙胺酸。所述封端剂并不系统地存在于本发明的化合物中。术语“烷基”用于指基于饱和烃基团的链,尤其例如C1-C6烷基，即含有1-6个 碳原子的直链或支链烷基。例如可以提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、 戊基、异戊基及己基。术语“M”用于指由芳环衍生的官能团(或取代基)，例如C6-Cltl芳环，尤 其为苯基、苄基、1-萘基或2-萘基。术语“遨基”尤其指由经由一个双键而与第一个氧原子连接且经由一个单键而 与第二个氧原子相连的碳原子组成的官能团，其中所述第二个氧原子为电负性或者与氢 原子相连接。取决于分子的pKa以及介质的pH，所述羧基可以呈离子化的形式，即第二 个氧原子未连接H，则其为电负性。术语“反应介质”用于指包含表达细胞或细胞器的新陈代谢和/或微生物生长 所需的所有成分的介质。该反应介质可以用于流式细胞术、组织酶学、细胞培养等，或 者用作微生物检测和/或识别介质。所述反应介质可以包含一种成分或多种组合成分，例如氨基酸类、蛋白胨、 烃、核苷酸、矿物质、维生素、抗体、表面活性剂、缓冲溶液、磷酸盐、铵盐、钠盐或
金属盐类。所述介质还可以包含着色剂。例如作为着色剂可以提及伊文思蓝、中性红、羊 血、马血、遮光剂例如氧化钛、硝基苯胺、孔雀绿、亮绿等。所述反应介质可以为固体、半固体或液体。术语“固体介质”用于例如指凝胶 化的介质。琼脂在微生物学中为用于培养微生物的常规凝胶剂，但是可以使用明胶或琼 脂糖。有些制品是可商购获得的，例如哥伦比亚琼脂、胰酪蛋白胨大豆琼脂、麦康基琼 脂、沙鲍洛琼脂，或者更通常而言描述于Microbiological Media(CRCPress)手册中的那些。所述反应介质可以为“检测和/或识别介质”，即显影介质或培养及显影介 质。在第一种情况下，在接种之前培养微生物，并且在第二种情况下，检测和/或识别 介质还构成培养介质。术语“牛物样品”用于指由生物流体试样衍生的临床样品，或者由任何类型食 品衍生的食品样品。该样品因此可以为液体或者固体，而且可以没有限制性地提及血
权利要求
1. 一种具有下式⑴的用于检测肽酶活性的酶底物
2.权利要求1所述的酶底物，其中 X为 O ； Rl禾口 R2不存在； P为肽。
3.权利要求1所述的酶底物，其中 X为 O ； Rl 为 Cl ； R2不存在； P为肽。
4.权利要求1所述的酶底物，其中 X为 S ； Rl不存在； R2不存在； P为肽。
5.权利要求1所述的酶底物，其中 X为 S ； Rl不存在； R2 为 Cl ； P为肽。
6.一种包含至少一种权利要求1-5中任一所述的酶底物的反应介质。
7.一种包含至少一种权利要求1-5中任一所述的酶底物的微生物检测和/或识别介质。
8.权利要求7所述的检测介质，其还包含至少一种对与通过权利要求1-5任一所述的 底物所检测到的酶活性不同的酶活性具有特异性的其他酶底物。
9.权利要求7或8所述的检测介质，其还包含至少一种对通过权利要求1-5任一的底 物所检测到的酶活性具有特异性的其他酶底物。
10.权利要求1-5中任一所述的酶底物或者权利要求7-9中任一所述的检测和/或识 别介质用于检测微生物中的至少一种肽酶活性的用途。
11.权利要求1-5中任一所述的酶底物或者权利要求7-9中任一所述的检测和/或识 别介质用于分离革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的用途。
12.一种检测微生物中的至少一种肽酶活性的方法，其特征在于其包含如下步骤a)提供权利要求7-9中任一所述的检测和/或识别介质，b)以待测试的生物样品接种所述介质，c)对其进行温育，并且d)发现至少一种肽酶活性的存在。
13.—种区分细菌属于革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的方法，其特征在于其包含如下 步骤a)提供权利要求7-9中任一所述的检测和/或识别介质，b)以待测试的生物样品接种所述介质，c)对其进行温育，并且d)发现至少一种肽酶活性的存在。
全文摘要
本发明涉及具有下式(I)的用于检测微生物中肽酶活性的酶底物，其中□X为S、NX1、O或NX1-CO；□R1不存在或者为如下取代基之一Cl、Br、F、I、OH或烷基、芳基或羧基；□R2不存在或为如下取代基之一Cl、O-CH2-O、O-CH3、F、二亚乙基二胺-CH3、NR3R4、Br、I、OH、烷基、芳基或羧基、NO2-CO2Hα；□X1选自H、C2H4Ph、OH、烷基和芳基；□R3和R4独立地为H或者含有1-4个碳原子的烷基；P为肽；
文档编号C07D277/66GK102016061SQ200880018135
公开日2011年4月13日 申请日期2008年5月29日 优先权日2007年5月31日
发明者A·詹姆斯, O·法布雷加, S·斯坦福斯, S·欧伦加, V·L·萨尔瓦图拉 申请人:生物梅里埃公司