专利名称：：一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺，属生物医药制造领域。
背景技术：
：白喉是急性呼吸道传染病，白喉杆菌侵入人体后在鼻咽部生长繁殖，导致局部炎症及组织坏死并产生外毒素(分子量为62000蛋白质，为一多肽链)，咽喉部的坏死组织形成灰白色假膜并继续蔓延而引起呼吸障碍甚至窒息。外毒素可致心肌、神经系统、肝、肾及肾上腺等器官受损，出现全身中毒症状。白喉类毒素可使白喉流行得到有效控制。国内原生产白喉类毒素，白喉疫苗的厂家为中国生物制品集团公司下属的六大生物制品研究所，其工艺如下-固体培养基传代一液体培养基发酵罐培养一离心去菌体一一段盐析一二段盐析一超滤脱盐一除菌过滤一脱毒一原液检定保存一半成品配制一成品工艺阐述(l')菌种制备将白喉38007菌种开启并接种于吕氏血清斜面培养基上，34。C35。C孵箱培养16小时~24小时，再由血清斜面传于黄氏马丁肉汤(或改良林氏肉汤)培养基种子管，34'C35'C培养16小时~24小时为第二代，如此循环由黄氏马丁肉汤传至黄氏马丁肉汤第二代，镜检合格者传于IOL瓶，34°C—35'C培养48小时。(2)大罐培养(培养基主要为肉源胰酶消化液)毒素培养以抽样3次，6小时内絮状单位不上升为停止培养指标。用于生产的毒素不得低于150Lf/ml。(3)杀菌将培养液冷却至28。C以下，按培养基的0.1%-0.15%加入甲醛溶液。(4)一段盐析(去除大分子杂蛋白)离心机去除菌体，经浓縮，加入23%(W/V)晶体硫酸铵、1%(W/V)活性炭，然后加入0.5%(W/V)碳酸氢钠。收集上清。(5)二段盐析(去除小分子杂蛋白)缓慢加入22%(W/V)晶体硫酸铵，收集沉淀用无菌的0.1%碳酸氢钠溶液浸泡沉淀。用无菌的0.1%碳酸氢钠(NaHC03)溶液分次溶解、洗涤沉淀，送超过滤脱盐。(6)超滤脱盐将精制毒素溶液泵入超过滤系统，直至测定样品硫酸铵含量低于千分之一即可收集脱盐后精制白喉毒素液。(7)除菌过滤用除菌过滤膜除菌过滤。(S)脱毒精制白喉毒素按0.5%计算加入福尔马林溶液(按40%计算)及适量的10。/。L-赖氨酸溶液放置室温2天-3天，每日振摇一次，然后放入36-C-37'C恒温室，进行脱毒。(9)精制类毒素原液检定毒性逆转试验，理化性状，无菌试验，Lf值测定，纯度，特异性毒性试验。保存与效期保存于2-8t:冷库中，效期自脱毒合格之日起为3年半。其不足之处虽然，国内已有吸附白喉疫苗、DTP、DtaP、吸附白破二联疫苗上市，但其生产过程中由于工艺的限制，成人免疫时有严重的不良反应，Pappenheimer认为，可能是对白类过敏，或对细菌的非毒素蛋白过敏，也可能对二者都过敏，Henncq给对原制白类过敏者接种无毒白喉杆菌培养滤液时，受实者呈阳性反应。在过量铁培养液中培养白喉，铁抑制了白喉毒素的形成，但不能抑制致敏原的形成。证明成年人接种白类容易引起过敏反应，是因为曾经在上呼吸道感染过无毒力或毒力很小的白喉杆菌，这些菌体的非毒素蛋白使其致敏，当再接种白类时，白类中含有少量此种蛋白而引起过敏反应。固如果能制备出高纯度的精制白类有利于降低不良反应，国外生物制品规程规定，精白类的纯度应不低于25001f/mgPN。而我国规程规定不低于15001f/mgPN。因此用于成人免疫的精白类有必要进一步纯化，提高纯度。
发明内容设计目的避免
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存在的不足之处，设计一种各项质量指标均达到《中国药典三部》吸附白喉疫苗要求，尤其纯度指标达到26001f/mgPN以上的一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺。设计方案本申请在国内生产白喉类毒素工艺的基础上进行工艺改进，增加了将所用培养基超滤去除未消化彻底的蛋白降解物，二次盐析后脱盐后再经凝胶过滤工艺，其各项质量指标均达到《中国药典三部》吸附白喉疫苗要求，尤其纯度指标达到26001f/mgPN以上，制品中的白喉类毒素纯远高于同类制品中的纯度，使制品更加安全。白喉类毒素工艺流程固体培养基传代一(液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白等)液体培养基发酵罐培养一离心去菌体一一段盐析—二段盐析一超滤脱盐一凝胶过滤一除菌过滤一脱毒一原液检定保存一半成品配制一成品；关键技术有两点a、发酵罐培养。液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白等。这样培养收获物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上。b、通过盐析和凝胶过滤进一步去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白等，从而获得高纯度的白喉毒素。技术方案一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺，其制作工艺为固体培养基传代一液体培养基发酵罐培养一离心去菌体一一段盐析一二段盐析一超滤脱盐一凝胶过滤一除菌过滤一脱毒一原液检定保存一半成品配制一成品，液体培养基发酵罐中液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白，培养收获物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通过盐析和凝胶过滤进一步去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白，获得高纯度的白喉毒素。本发明与
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相比，确定了合理的工艺路线，稳定技术工艺流程，保证了规模化生产的可能，经过培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白等物质，同过盐析和凝胶过滤去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白等，从而获得高纯度的白喉毒素，保证产品的安全性。具体实施例方式实施例1:一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺，其制作工艺为固体培养基传代一液体培养基发酵罐培养一离心去菌体一一段盐析—二段盐析—超滤脱盐一凝胶过滤一除菌过滤一脱毒一原液检定保存一半成品配制—成品，所述的液体培养基发酵罐中液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白，培养收获物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通过盐析和凝胶过滤进一步去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白，获得高纯度的白喉毒素。工艺阐述(l)菌种制备将白喉38007菌种开启并接种于吕氏血清斜面培养基上，34。C35t:孵箱培养16小时~24小时，再由血清斜面传于黄氏马丁肉汤(或改良林氏肉汤)培养基种子管，34'C35'C培养16小时~24小时为第二代，如此循环由黄氏马丁肉汤传至黄氏马丁肉汤第二代，镜检合格者传于10L瓶，34。C一35t:培养48小时。(2)大罐培养(培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白等物质)毒素培养以抽样3次，6小时内絮状单位不上升为停止培养指标。用于生产的毒素不得低于150Lf/ml。(3)杀菌将培养液冷却至28'C以下，按培养基的0.1%-0.15%加入甲醛溶液。(4)一段盐析离心机去除菌体，经浓縮，加入23%(W/V)晶体硫酸铵、1%(W/V)活性炭，然后加入0.5%(W/V)碳酸氢钠。收集上清。(5)二段盐析(去除小分子杂蛋白)缓慢加入22%(W/V)晶体硫酸铵，收集沉淀用无菌的0.1%碳酸氢钠溶液浸泡沉淀。用无菌的0.1°/。碳酸氢钠(NaHCQ3)溶液分次溶解、洗涤沉淀，送超过滤脱盐。(6)超滤脱盐将精制毒素溶液泵入超过滤系统，直至测定样品硫酸铵含量低于千分之一即可收集脱盐后精制白喉毒素液。(7)凝胶过滤获得高纯度白喉毒素。(8)除菌过滤用除菌过滤膜除菌过滤。(9)脱毒精制白喉毒素按0.5%计算加入福尔马林溶液(按40%计算)及适量的10°/丄-赖氨酸溶液放置室温2天-3天，每日振摇一次，然后放入36"C-37'C恒温室，进行脱毒。鹏精制类毒素原液检定毒性逆转试验，理化性状，无菌试验，Lf值测定，纯度，特异性毒性试验。保存与效期保存于2—8'C冷库中，效期自脱毒合格之日起为3年半。表l:工艺与批号的对应<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2:样品培养及检定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3:原液类毒素检定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从以上结果显示，经过培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白等物质，同过盐析和凝胶过滤去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白等，从而获得高纯度的白喉毒素，可以尽可能的减小产品的不良反应，保证产品的安全性。具研究表明使用纯度高的白喉类毒素，1Lf的免疫剂量即可以引起免疫应答，提示如果能制造出高纯度的白喉类毒素，可以降低产品中白喉类毒素的用量，从而更进一步保证产品的安全性。国内规程《中国药典》三部3.1.3纯度应不低于1500Lf/mgPN。拟定注册规程3.1.3纯度应不低于2500Lf/mgPN。需要理解到的是上述实施例虽然对本发明作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入本发明的保护范围内。权利要求1、一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺，其制作工艺为固体培养基传代→液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→一段盐析→二段盐析→超滤脱盐→凝胶过滤→除菌过滤→脱毒→原液检定保存→半成品配制→成品，其特征是所述的液体培养基发酵罐中液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白，培养收获物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通过盐析和凝胶过滤进一步去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白，获得高纯度的白喉毒素。全文摘要本发明涉及一种用于提高白喉类毒素纯度的工艺，其制作工艺为固体培养基传代→液体培养基发酵罐培养→离心去菌体→一段盐析→二段盐析→超滤脱盐→凝胶过滤→除菌过滤→脱毒→原液检定保存→半成品配制→成品，所述的液体培养基发酵罐中液体培养基经处理去除分子量在50000以上的蛋白，培养收获物中基本只有白喉毒素分子量在50000以上，通过盐析和凝胶过滤进一步去除收获液中分子量50000以下的蛋白和其它杂蛋白，获得高纯度的白喉毒素。文档编号C07K14/195GK101503725SQ200910096768公开日2009年8月12日申请日期2009年3月19日优先权日2009年3月19日发明者郭志军申请人:浙江天元生物药业股份有限公司