大豆蛋白免疫活性肽的制备方法及其产品的制作方法

专利名称：大豆蛋白免疫活性肽的制备方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆活性肽的制备方法，尤其涉及一种具有免疫功能的大豆蛋白活性肽的制备方法以及由该方法制备得到的产品，属于大豆加工领域。

背景技术：
我国是农业大国且是大豆的故乡，大豆的产量居世界第四位，而大豆的加工利用却远远落后于国外先进国家。作为农作物的大豆要实现高附加值就必须提高加工技术、加工产品档次。近年来，我国的大豆精深加工产品已有了一定的发展，从豆乳粉到大豆分离蛋白到大豆生理功能成份的开发都充分体现了加工技术的进步。但由于管理和多方面的原因，我国的大豆分离蛋白企业都不景气，国内近百家的大豆蛋白企业，其中大部分停产或半停产。就产品而言，大豆分离蛋白本身就是一个附加值高的大豆精深加工产品，由于它的多样功能特性而广泛地应用于各个领域，而我国的分离蛋白生产之所以不景气，是因为产品性能单一，品种单一，质量不稳定，致使其应用受到很大限制，这是滞销的一个主要原因。因而开发大豆的各个功能特性，提高产品质量，增加产品品种，并协同应用研究将是我国大豆蛋白开发的又一新起点。
众所周知，生物修饰技术是二十一世纪首推的安全可靠的高新技术，其中的酶改性也是食品工业的首选，利用生物修饰技术对大豆蛋白进行改性即通过蛋白酶水解大豆蛋白，改变其功能特性，是一种制造低粘度、高分散性，发挥产物特殊特性的一种有效方法，而且作用条件温和、专一性强，并且这种处理对大豆蛋白功能性质的改变包括增大溶解度、阻止热凝结、增大泡沫体积。水解控制适度既可达到理想效果又不破坏专门用途对功能的要求。由于生物改性的安全性及适用性，因此具有很好的应用前景，目前国内对此项研究尚处于起步阶段，市场上各种功能性大豆蛋白的产品也均为进口产品。
在美国、日本生物改性大豆蛋白的研究与开发已进入产业化阶段，主要关键技术为蛋白酶的选择及产物苦味的控制，开展了从简单的复合水解物到单组分功能性水解产物分离的研究，并开发多系列产品。
国外大豆的加工业发展水平高于我国，以美国、日本为代表西方国家。不论在基础研究还是生产应用上都非常先进，集团化大豆产业早已形成，资金雄厚，产品多样化，应用广泛，产量大。大豆食品生产实现了规模化和现代化、对大豆保健成分进行深入开发、综合开发。2005年美国大豆蛋白质、大豆纤维和大豆异黄酮等大豆原料销售额增加至6.529亿美元。目前，技术趋势是采用现代食品分离技术、微胶囊造粒技术、酶促反应等生物工程技术，其中酶促反应技术在加工过程中能保持大豆营养成分，不产生其他化学残留物，可改善食品风味提高食品的功能价值，大大拓宽了大豆精深加工利用的范围，提高了综合开发能力。
大豆肽是一种比大豆蛋白更为优质、新型的大豆蛋白酶改性产品。大豆肽具有易消化吸收，能迅速供给机体能量，无蛋白变性，无豆腥味，液体粘性小和受热不凝固等特性，尤其是具有降低血清胆固醇、降血压、增加免疫和促进脂肪代谢等独特的生理功能。大豆肽在食品、医药、日用化工等领域中都有开发前景和巨大的市场潜力。
到目前为止，免疫活性肽的研究仍处于实验水平，还没有一套较为有效的制备方法。活性肽按获取方法不同大致可分为四类(一)分离纯化天然活性肽；(二)化学合成法；(三)重组DNA法；(四)蛋白质酶解法。不同的方法适合不同的目的，取决于目的肽的长短、数量、用途以及制备成本。每种方法也各有其优缺点。天然活性肽来源少，提取成本高，不可能大规模开发应用，另外提取的生物活性肽残存的有机溶剂会带来毒性问题。化学合成法广泛用于生产合成高营养价值、中等长度的医药用肽，但是它的成本高，而且副产品等残留化合物对人体有害，此方法仅在实验规模中使用。重组DNA技术适用于大分子肽和蛋白质的生产，现在也广泛应用于实验室及工业生产中，但与其它方法相比较发展尚未成熟。酶法生产功能肽有很多优点，如生产条件温和、产品安全性高且可定位生产特定的肽，成本低，已成为生物活性肽最主要的生产方法。


发明内容
本发明的目的是提供一种大豆蛋白免疫活性肽的制备方法以及由该方法所得到的大豆蛋白免疫活性肽产品。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 一种大豆蛋白免疫活性肽的制备方法，包括以下步骤将大豆分离蛋白用蛋白酶进行水解反应；将所得到的大豆分离蛋白水解液用超滤膜进行超滤；收集超滤液，即得。
为了达到更好的制备效果，所述的蛋白酶可以是木瓜蛋白酶，复合蛋白酶，碱性蛋白酶或中性蛋白酶等蛋白酶；优选为复合蛋白酶或碱性蛋白酶； 其中，采用复合蛋白酶进行水解时，最佳的水解条件为反应温度为45℃，底物浓度5％(w/w)，酶用量10000IU/g，反应时间6hr，反应pH值为7；采用碱性蛋白酶进行水解时，最佳的水解条件为反应温度50℃，底物浓度为5％(w/w)，酶用量为12000IU/g，反应8小时，反应pH值为9；采用木瓜蛋白酶进行水解，最佳水解组合条件为底物浓度5％，反应温度50℃，反应时间6hr，酶用量7000IU/g，反应pH6；采用中性蛋白酶进行水解，最佳水解条件为反应温度45℃，底物浓度为5％，酶用量为7000IU/g，反应6小时，在pH6.5下进行。
所述的超滤膜优选是分子量为3000Da的超滤膜； 所述的超滤优选在15psi至40psi的压力下进行超滤，更优选为在30psi的压力下进行超滤；为了达到更好的超滤效果，本发明人对影响超滤的其它因素进行了优化和筛选，结果发现，大豆水解液的重量百分比浓度对于超滤效果有显著影响，当大豆水解液的重量百分比浓度为3％-6％时超滤的效果较好，当其重量百分比浓度为5％时超滤的效果为最佳。另外，大豆蛋白水解液的pH值对于超滤效果也有一定的影响，当大豆蛋白水解液的pH值为5-8时超滤效果较好，当pH值为7时，超滤的效果为最佳。
本发明方法是酶法和膜法相结合的方法，即在酶解大豆分离蛋白后又针对所需要的功能肽段经膜超滤有针对性的进行分离富集，得到的活性肽产品功能更强，纯度更高。本发明方法所制备得到的大豆蛋白免疫活性肽在3400Da的分子量所占的比例为70.95％；蛋白质含量89.2％；氮含量为14.272％。
经口投予小鼠不同剂量本发明所制备的大豆蛋白免疫活性肽30天，进行了3类免疫功能的试验(即反映细胞免疫功能的迟发型变态反应(足跖增厚法)、反映体液免疫功能的半数溶血值(HC50)的测定、反映单核-巨噬细胞吞噬功能的小鼠碳廓清实验的检测)。实验结果表明，本发明方法所制备的大豆蛋白免疫活性肽可增强小鼠的半数溶血值和碳廓清功能，但是未见增加小鼠迟发型变态反应。提示本发明大豆蛋白免疫活性肽具有增强体液免疫功能和单核-巨噬细胞吞噬功能。



图1大豆蛋白酶解工艺流程图。
图2木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白K值对水解程度的影响结果。
图3复合蛋白酶水解大豆分离蛋白K值对水解程度的影响结果。
图4碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白K值对水解程度的影响结果。
图5中性蛋白酶水解大豆分离蛋白K值对水解程度的影响结果 图6不同压力渗透通量变化。
图7不同pH值渗透通量变化。
图8不同物料浓度渗透通量变化。
图9聚乙二醇在相应色谱条件下工作曲线。
图10本发明方法所制备的免疫肽的分子量分布。

具体实施例方式 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验例1酶法水解大豆蛋白的最优工艺条件研究实验 1.实验材料与方法 1.1实验材料与仪器设备 1.1.1实验材料 大豆分离蛋白哈高科大豆食品有限公司 木瓜蛋白酶无锡杰能科生物有限公司 碱性蛋白酶NoVo公司 复合蛋白酶NoVo公司 甲醛分析纯哈尔滨市新春化工厂 NaOH分析纯齐齐哈尔化工总厂 中性蛋白酶无锡杰能科生物有限公司 1.1.2仪器设备 电热恒温水浴锅WSZ-133-75广东省汕头市广播仪器厂 酸度计PHS-3C上海雷磁仪器厂 磁力搅拌器79-1江苏医疗仪器厂 电子天平AE200瑞典Tecator公司 1.2实验方法 1.2.1原料质量分析 1)水分含量测定GB 5497-95 2)蛋白质含量测定GB 5511-95 1.2.2酶活力测定 蛋白酶活力测定法ZB X 66030-87 1.2.3水解产物水解度的测定 甲醛滴定法取水解蛋白液5.00mL于小烧杯中加人60mL去CO2蒸馏水并磁力搅拌，用精密pH计指示其pH值并用0.1moL/LNaOH滴至pH＝8.2，然后加人已中和好的甲醛溶液20mL，记录将其pH值滴至9.2时所耗0.1mol/LNaOH的mL数；作空白试验；则水解蛋白液中蛋白质的一NH含量为 式中M为所用NaOH溶液的摩尔浓度，而Vl、V。为样品滴定，空白试验时所耗NaOH的体积数(mL)。
1.2.5大豆蛋白酶种类筛选及最佳水解条件研究 1.2.5.1木瓜蛋白酶水解大豆蛋白最佳水解条件选择 根据资料记载和模拟试验，考虑到加酶量、反应温度、时间、反应pH值、底物浓度等因素的相互影响，拟采用正交实验来确定最佳水解条件，本实验通过五因素四水平L16(45)正交试验来完成，方案见表1。
表1木瓜蛋白酶水解大豆蛋白试验
1.2.5.2复合蛋白酶水解大豆蛋白最佳条件选择 本实验根据模拟试验，从反应温度、底物浓度、酶用量、反应时间、pH等因素考虑，设计L16正交试验来完成，见表2。
表2复合蛋白酶水解大豆蛋白最佳条件试验
1.2.5.3碱性蛋白酶水解大豆蛋白最佳条件选择 本实验采用L16正交试验完成，方案见表3。
表3碱性蛋白酶水解大豆蛋白最佳条件试验
1.2.5.4中性蛋白酶水解大豆蛋白最佳条件选择 本实验拟采用L16正交设计，见表4。
表4中性蛋白酶水解大豆蛋白最佳条件试验
2.实验结果与分析 2.1原料质量分析 经测定原料大豆分离蛋白的指标为蛋白含量87.23％；水分含量4.27％。
原料蛋白质的含量是实验中酶添加量及水解度计算的依据，从数据上看出采用的大豆蛋白蛋白质含量是较高的，得到的水解产物含有脂肪、糖类的比例极小，所以在研究中也忽略了这些组分对水解效果的影响，即采用大豆分离蛋白进行本项研究是可取的、直接的。
2.2酶解大豆蛋白最佳技术研究 2.2.1木瓜蛋白酶最佳水解条件选择 经测定木瓜蛋白酶的酶活力为13300IU/g。
表5木瓜蛋白酶正交试验结果
从表5正交试验结果的极差分析看出，木瓜蛋白酶水解大豆蛋白各因素对水解程度的影响依次为酶用量＞反应时间＞底物浓度＞pH＞反应温度。理论上反应条件优组合为A1B4C2D4E5。
从各因素水平K值对木瓜酶水解程度的影响结果看出底物浓度对水解程度的影响为浓度8％时为分界线，浓度小于8％，K值升高较快，由23.55升至27.28，而浓度大于8％，K值变化不大，基本处于20左右，即得出底物浓度越低，水解效果越好，但考虑到生产的适用性和可操作性，能源、成本计算的需要，不考虑5％以下，本试验设计以5％的底物浓度为最低限，基本吻合生产企业可行状态，故底物浓度选为5％适宜。
反应温度对水解程度的影响较小，40-50℃时影响不大，基本趋于平缓，但当温度升至50℃-70℃时，K值略有上升，但变化不大，单因素试验中，当温度高于70℃，将会在一定程度上使酶失活，基于此，本设计将上限定为70℃。从R值可以看出极差很小，因此此因素对水解程度影响不大，各水平相差不大，故反应温度选为60℃。
反应时间对水解程度的影响较大，反应时间从4-6小时时适于反应，随反应时间延长，DH值变化大，而从6-8-12小时，随反应时间延长，DH值虽增加，但较缓，由于大豆蛋白溶液是营养丰富的培养基，在一定温度下反应也正适于微生物的生长，易造成微生物的污染，故考虑实际生产应用，反应时间不易过长，超过12hr不利于生产，结合试验结果，反应时间选为6hr。
酶用量是影响水解程度的最主要因素，酶用量从3000IU/g至7000IU/g，随酶用量增加，水解程度变化大，而酶用量大于7000IU/g，水解进行不明显，即对水解程度影响不是很大，又从经济的角度考虑，故采用的最佳酶用量定为7000IU/g。
pH对水解程度的影响不大，即pH6-8之间对水解程度影响小，至pH9以上则抑制反应，所以pH选为6。
从以上分析得出木瓜蛋白酶水解大豆蛋白的最佳水解组合条件为A1B4C2D4E5，即底物浓度5％，反应温度50℃，反应时间6hr，酶用量7000IU/g，反应pH6。最佳水解条件下，大豆蛋白的水解度可达8.99％。
2.2.2复合蛋白酶最佳水解条件选择 经测定复合蛋白酶酶活力为12437.6IU/g。
表6复合蛋白酶水解大豆蛋白正交试验结果
从表6正交试验结果的极差分析看出，复合蛋白酶水解大豆分离蛋白各因素对水解程度的影响依次为反应pH＞底物浓度＞反应温度＞酶用量＞反应时间，反应条件最佳组合为A2B1C4D4C3。
从图3看出反应温度对水解程度的影响35-45℃之间，随温度升高K值有上升趋势，而温度大于45℃，随温度升高，K值极剧下降，对反应有较大影响，因此温度选在45℃适宜。底物浓度对水解程度影响较大，随浓度的升高，K值下降明显，主要是由于随大豆分离蛋白浓度的增高，底物与酶分子接触的机会减少，且随底物浓度的增加，溶液相对的粘度也在增加，阻碍了酶分子的运动，并被底物包裹起来，减少酶分子发挥作用的机会。考虑到生产的实用性浓度最低选用5％，因此最适水解底物浓度确定为5％。酶用量对水解程度的影响，在酶用量的选择范围中，其用量对整个过程影响不大，这一范围的选定是在单因素试验基础上并考虑到使用经济减少开发产品成本的大量增加而设定的，但从K值变化可看出，随着酶用量的增加，反应K值呈上升趋势，即添加量越大，水解效果越好，综合考虑本研究，并根据实验结果酶用量10000IU/g适宜。反应时间对水解程度的影响从4-10小时变化不大，在6小时反应达到高峰，故反应时间选在6hr。反应pH对整个水解反应的影响最大，即pH5-8之间水解效果变化大，随pH由5至7增大，水解程度成正相关，而当pH由7继续升高时，则反应程度下降，这主要是由于蛋白酶具有反应的适宜性，在一定的pH介质中才充分发挥其活力，达到最佳水解效果。故最适pH确定为7。
由以上分析得出复合蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳条件优化组合为A2B1C4D2E3，即反应温度为45℃，底物浓度5％，酶用量10000IU/g，反应时间6hr，反应pH为7，在最佳水解条件下，可得到大豆分离蛋白水解液的水解度为19.48％。
2.2.3碱性蛋白酶最佳水解条件选择 经测定碱性蛋白酶的酶活力为13535.9IU/ml。
表7碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白正交试验结果

由表7碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白正交试验结果的极差分析看出，影响水解程度的主次因素为反应温度＞底物浓度＞反应时间＞反应pH＞酶用量。
从反应中K值的变化可看出，反应温度对水解反应的影响程度最大，在50℃时水解度最高，K值最大，即50℃成为激活碱性蛋白酶活力的最宜温度即采用50℃适宜。
反应浓度对水解程度的影响随浓度由5％-10％的升高过程中，随底物浓度的增大，水解程度逐渐减弱，主要由于浓度过大，蛋白质分子胶囊包裹酶分子，使之运动减缓，只与周边的蛋白质分子发生作用，而减少了与其它蛋白分子结合的机会，故底物浓度确定为5％。酶用量在本实验中对水解程度影响不大，理论酶用量是影响水解程度最大的因素，但经过模拟试验，酶用量加到28000IU/g以下时，水解度在25.13％，较本实验的最佳水解度只高3.51％，但无形中造成了成本的巨大浪费，所以本研究在综合考虑实验效果和生产成本的同时选用在此水平范围内，从这四个水平来看，酶加量在8000IU/g时，K值变化较平缓，上升幅度不大，在16000IU/g时，K值稍高，因此适用12000IU/g适宜。反应时间对水解反应的影响表现为反应时间为8小时时是影响水解程度的一个转折点，低于8小时，随时间延长，水解程度加强，而超过8小时，却抑制了反应，这主要是由于水解的肽又有局部可逆反应的可能，又重新聚合，从而显示水解度的降低，故选用反应时间为8小时适宜。pH相对来讲，对反应影响不是很大，但可看出pH9时水解效果最好，即pH9是碱性蛋白酶活性中心发挥作用的最适pH，也符合其作用规律。因此pH选为9适宜。
由上述分析得出碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳水解条件为A2B1C3D3E4，即反应条件为反应温度50℃，底物浓度为5％，酶用量为12000IU/g，反应8小时，在pH9下进行，在此条件下，得到大豆分离蛋白水解度为21.62％。
2.2.4中性蛋白酶水解大豆分离蛋白最佳水解条件选择 经测定中性蛋白酶的酶活力为15443.8IU/g。
表8中性蛋白酶水解大豆分离蛋白正交试验结果

由表8中性蛋白酶水解大豆分离蛋白正交试验结果的极差分析看出，各因素对水解程度的影响依次为底物浓度＞反应温度＞pH＞反应时间＞酶用量。
从K值直观图(图5)看出反应温度对水解程度的影响随温度由35℃升高至45℃时呈上升趋势，而由45℃继续升高却呈下降趋势，即温度超过45℃，不同程度地将中性蛋白酶钝化，活力降低而造成的，故选用45℃适宜。底物浓度在本研究中对水解程度影响最大，从K值变化看，随底物浓度的升高，K值下降明显，即浓度的增大，阻碍了酶分子运动，与蛋白质分子充分接触造成水解程度下降，故底物浓度选在5％。酶用量在本试验中对水解程度影响不大，即各水平差异不是非常显著，其选择主要是出于经济考虑，另通过模拟实验，当酶加量用到30000IU/g以上时，反应水解度达到9.47％，后趋于平衡，与试验的因素水平选择水解度基本接近，从各水平看，酶用量7000IU/g适宜。
3.实验结论 3.1木瓜蛋白酶最佳水解条件为底物浓度5％，反应温度50℃，反应时间6hr，酶用量7000IU/g，反应pH值6。最佳水解度可达8.03％。
3.2复合蛋白酶水解大豆分离蛋白最佳条件优化组合为反应温度为45℃，底物浓度5％，酶用量10000IU/g，反应时间6hr，反应pH值为7，最佳水解度为19.48％。
3.3碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳水解条件为反应条件为反应温度50℃，底物浓度为5％，酶用量为12000IU/g，反应8小时，在pH9下进行，最佳水解度为21.62％。
3.4中性蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳水解条件为反应条件为反应温度45℃，底物浓度为5％，酶用量为7000IU/g，反应6小时，在pH6.5下进行，最佳水解度为9.47％。
实验例2大豆蛋白免疫肽分离富集方法及其功能特性实验 1.材料与方法 1.1主要实验材料及设备 (1)主要实验材料 大豆分离蛋白哈高科大豆食品有限责任公司 碱性蛋白酶 无锡杰能科生物有限公司 复合风味蛋白酶 无锡杰能科生物有限公司 绵羊红细胞(SRBC)哈尔滨市海峡贸易有限公司 补体(豚鼠血清) 哈尔滨市海峡贸易有限公司 都氏试剂黑龙江省疾病预防控制中心馈赠 印度墨汁北京市西中化工厂 游标卡尺(精密度0.01mm) 哈尔滨量具刃具厂 (2)实验动物 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供提供的昆明种小鼠。选择健康雌性小鼠60只，体重18～24g，随机分为5组，每组12只，作为免疫一组，进行迟发型变态反应实验和半数溶血值(HC50)测定实验。选健康雌性小鼠60只，体重18～24g，随机分为5组，每组12只，作为免疫二组，进行碳廓清实验及动物脏体比值测定。
1.1.2主要仪器与试剂 酸度计pHS-25型上海伟业仪器厂 电子分析天平 梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司 离心机北京医用离心机厂 精密电动搅拌机江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 电热恒温水浴锅余姚市东方电工仪器厂 蛋白自动测定仪瑞典福斯公司 722-型分光光度计 上海精密科学仪器有限公司 Labscale TFF System超滤系统 Millipore 聚醚砜膜(3000D) 美国颇尔公司 UV-1901紫外可见分光光度计 北京通用公司 洁净工作台哈尔滨东联 计时器弘博生物科技有限公司 1.2主要实验方法 1.2.1免疫功能肽酶的选择研究 比较大豆分离蛋白碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解液经3000Da膜分离后肽断的分布情况。
1.2.2免疫功能肽超滤优化条件的研究 本实验选用3000Da膜进行超滤优化条件的研究。
(1)超滤压力对超滤的影响 在室温下，调pH为7，考察不同超滤压力(15psi、20psi、30psi、40psi)下的渗透通量、透过蛋白质含量。
(2)pH值对超滤的影响 根据试验(1)选择最适超滤压力，考察不同pH值(5、6、7、8)下的渗透通量、透过蛋白质含量。
(3)物料浓度对超滤的影响 根据试验(1)选择最适超滤压力，根据试验(2)选择最适pH值，考察不同物料浓度(3％、4％、5％、6％)下的渗透通量、透过蛋白质含量。
(4)最适超滤条件的确定 超滤大豆蛋白酶解液，关键是提高蛋白的透过率。根据以上的单因素试验分析结果，本项目设计了三因素三水平的正交实验，分别以膜的透过蛋白质含量作为考察指标，来确定超滤的最佳工艺方案。正交实验中具体因素水平见表9。
表9正交实验因素水平表
1.2.3免疫功能肽产品的生产制备 工艺路线 5％蛋白乳浊液→酶解→灭酶后冷却(以DH值为指标测定)→分离→蛋白酶解液→膜分离(3000D)→喷雾干燥→免疫功能肽粉 5％蛋白乳浊液→酶解→灭酶后冷却(以DH值为指标测定)→分离→蛋白酶解液→喷雾干燥→粗肽粉(未经超滤) 1.2.4粗肽粉及免疫功能肽粉免疫活性的研究 经查阅相关文献，大豆蛋白水解肽(经3000D超滤)设三个剂量组，分别为0.85g/kg体重(低高剂量)、1.7g/kg体重(中剂量)和5.1g/kg体重(高剂量)。同时设阴性对照组(灌胃清洁水)和大豆水解蛋白粗肽粉(未经超滤)组，(5.1g/kg体重)。各组动物按体重的2％灌胃容积进行灌胃，连续灌胃30天后测各项免疫指标。免疫活性检测试验由反应细胞免疫的迟发型变态反应(足跖增厚法)、反应体液免疫的半数溶血值的测定和反应非特异性免疫的小鼠碳廓清实验组成。
迟发型变态反应(足跖增厚法)将免疫一组动物每只鼠经腹腔注射2％(V/V，用生理盐水配制)压积SRBC(2000rpm，10分钟)0.2ml，致敏后4天，测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。然后在测量部位皮下注射20％(V/V，用生理盐水配制)压积SRBC 20μl，于注射后24小时测量左后足跖部厚度，以攻击前后足跖厚度的差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。
半数溶血值的测定在上述迟发型变态反应结束的第2天，摘除眼球取血于离心管内，放置约1小时，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心10分钟，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释250倍，取1ml置试管内，依次加入10％(V/V，用SA缓冲液配制)压积SRBC 0.5ml，补体1ml(用SA缓冲液按1∶10稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温30分钟后，冰浴终止反应。2000rpm离心10分钟，取上清液1ml、加都氏试剂3ml，同时取10％(V/V，用SA缓冲液配制)的压积SRBC 0.25ml、加都氏试剂至4ml于另一试管中，充分混匀，放置10分钟后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下式计算。
样品HC50＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数 小鼠碳廓清实验小鼠按0.1ml/10g体重尾静脉注射1∶3.5倍稀释的印度墨汁，待墨汁注入，立即计时。
注入墨汁后2、10分钟，分别从内眦静脉丛取血20μl，并将其加到2mL Na2CO3溶液中。将小鼠称重后颈椎脱臼处死，取肝脏、脾脏和胸腺去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。
用722分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。按下式计算吞噬指数α K＝(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)
按公式计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。
脏器/体重比值＝脏器重/体重×100。
数据处理及结果判定采用方差分析方法，按方差分析的程序先进行方差齐性检验。如方差齐，计算F值。F值＜F0.05，结论为各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，再用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐性要求后，用转换后的数据进行统计。
1.2.5免疫功能肽分子量分布及氮含量的测定 分子量分布检测条件Agilent1100高效液相色谱仪，(国安捷伦公司)泵Agilent G1311A(四元泵)；示差检测器Agilent G1315A/B(RID检测器)；恒温箱Agilent G1316A(恒温箱)；色谱进样器Agilent G1313A(自动进样器)；色谱柱Agilent79911GF-083，79911GF-084双柱串联；柱温35℃；色谱工作站Angilent LC Chemstation；流动相水；流速1.0ml/min；进样量20μl。
蛋白质及氮含量测定GB 5511-95 2.实验结果 2.1免疫功能肽酶的选择研究 表10复合蛋白酶和碱性蛋白酶不同3000D膜分离比较 酶种类＞3000D肽含量 ＜3000D肽含量(％) (％) 复合蛋白酶64.1％35.9％ 碱性蛋白酶67.9％32.1％ 本实验选取3000D的分离膜进行免疫肽的分离纯化，比较复合蛋白酶和碱性蛋白酶经3000D膜分离后肽含量的分布情况可知两种酶解液3000D以下的肽含量复合蛋白酶酶液高于碱性蛋白酶酶解液，并且复合蛋白酶的最解酶解时间为6小时低于碱性蛋白酶的8小时，因此我们选用复合酶为免疫功能肽的水解酶。
2.2免疫功能肽超滤优化条件的研究 (1)超滤压力对超滤的影响 超滤是压力驱动型的膜分离过程，压差是超滤过程的推动力，对超滤物质渗透通量产生决定性影响。
压力作为超滤过程中的唯一推动力，对超滤物质滤过率有决定性的影响。料液中的大分子物质会在膜表面积聚，当这种积聚使膜表面溶质达到一定浓度时即可形成凝胶层，临界压力即为刚形成凝胶层时的压力。实际操作时，压力应选择在临界压力附近，这样既保证了一定的滤液通量，避免了无谓增加压力而引起的能耗增大，又防止了过高压力下，大分子挤入孔膜，而使孔膜堵塞严重，避免了对膜的损害。
由图6可以看出，升高压力对初始的参透通量有显著影响，压力越高初始渗透通量越大，但随着时间的延长，15psi、20psi、30psi、40psi下蛋白质通量呈现显著下降，特别是40psi，这主要是因为压力的升高随着时间的延长使得浓差极化和膜污染加剧，造成渗透通量迅速下降。因此，不能一味地升高压力而应该选择一个有利于蛋白质平缓渗透的压力。由此看出20psi至30psi的压力有利于蛋白质的渗透。
表11不同压力透过液蛋白含量
由表11可以看出，随着压力的升高蛋白质透过率而升高，但40psi下蛋白质的透过率并没有明显高于30psi时的蛋白质透过率，主要原因是超滤初期由于压力过大，蛋白质透过了膜，但超滤后期，过大的压力加剧了浓差极化和膜污染的过程，使得蛋白质被截留在了“膜”上，准确的说是被截留在了膜面上的蛋白质吸附层上，使得蛋白质和膜无法分开。因此综合渗透通量、蛋白质透过率，选择30psi下进行超滤较为合适。
(2)pH值对超滤的影响 表12不同PH值蛋白截留及蛋白含量
如图7、表12所示，蛋白质在中性pH7时，蛋白质的渗透通量最好，且蛋白质透过率也最高，因为这时当pH值偏高等电点时，蛋白质所带电荷与膜表面电荷同性，由于同性相斥，蛋白质粒子不易聚集，因此不易形成蛋白质吸附层，截留率也较大。但当pH值过大时，渗透通量、蛋白质透过率反而减小。pH值对超滤的影响也受膜材料和物料性质的限制。因此，在蛋白质超滤过程中选择适当的pH值是至关重要的。
综合渗透通量、蛋白质透过率二个因素分析，pH7为最适宜的超滤pH条件。
(4)物料浓度对超滤的影响 表13不同物料浓度透过蛋白含量含量
由图8可以看出，物料浓度低的料液膜渗透通量高于物料浓度高的料液，这是因为超滤过程中，主体溶液浓度的增加导致蛋白质浓度的升高，根据浓差极化理论，通量的下降正比于蛋白质的对数浓度，当物料浓度超过某一范围之后，这种线性关系便不再保持，这是因为蛋白质浓度的增加会导致料液粘度的增加，减少蛋白质分子在溶液中扩散系数，随之而来的是浓差极化现象的加重，同时蛋白质分子之间的相互作用加强，因而阻力增加，截留率增加而蛋白透过率降低。从表13可以看出随着物料浓度的升高，料液总的蛋白质透过率升高，物料浓度6％时最高，但它只略高于5％，综合考虑渗透能量和蛋白质透过率两个因素的变化情况，本研究选择的物料浓度选取5％为适合的物料浓度。
(5)最适超滤条件的确定 表14正交实验结果极差表

表15蛋白含量实验结果方差分析 F0.05(2，6)＝5.14 F0.01(2，6)＝10.92 从蛋白含量实验结果看，影响因素主次为压力＞物料浓度＞pH值，其中压力最显著，物料浓度为一般显著，pH值不显著。超滤的最佳条件为压力30psi，pH值7，物料浓度为5％。
2.3免疫功能肽分子量分布情况及氮含量测定 1.标准曲线制作 配制系列窄分布聚乙二醇标样，按照分子量大小配制相应浓度的溶液。分子量分别为106、194、620、400、1010、4020、1900、6450、11840、22450。.在相应的色谱条件下得到聚乙烯醇标样HPGPC校正工作曲线。
从标准曲线分析(图9)可知，随着时间的推移即随着流动相体积的增加，分子量由大到小的顺序出峰。
2免疫肽的分子量分布 见图10。由样品的谱图分析可知Mn、Mw、Mz分别为774.32、945.48、136.72，多分散系数D＝Mw/Mn＝1.22，样品的分子量分布范围窄。且在13min左右的分子量分布比例较大，与标准曲线对照进一步分析可知，样品的主要分布在5000Da以下，3400Da的分子量所占的比例为70.95％。
3氮含量结果 经测定免疫蛋白肽的蛋白质含量为89.2％，氮含量为14.272％ 2.4大豆肽免疫功能的研究 2.4.1大豆水解蛋白肽对小鼠体重的影响 小鼠给予大豆水解蛋白肽30天后对小鼠体重的影响分别见表16和17。
表16大豆水解蛋白肽对免疫一组小鼠体重的影响
表17大豆水解蛋白肽对免疫二组小鼠体重的影响
有表16和表17可见，与阴性对照组相比较，各免疫实验组动物和原粉组动物的初始体重和终末体重均无显著性差异(P＞0.05)，说明本实验条件下大豆水解蛋白肽(经3000D超滤)和大豆水解蛋白肽粗肽粉(未经超滤)对小鼠体重增长无影响。
2.4.2大豆水解蛋白肽对小鼠脏器/体重比值的影响 小鼠给予大豆水解蛋白肽30天后，对脏器/体重比值的影响见表18。
表18大豆水解蛋白肽对小鼠脏器/体重比值的影响
由表18可见，经口给予小鼠不同剂量的大豆蛋白水解肽(经3000D超滤)和原粉(未经超滤)30天，与对照组间比较，各剂量组和原粉组动物的脾脏/体重比值和胸腺/体重比值均无显著性差异(P＞0.05)，即对小鼠的脏器/体重比值无影响。
2.4.3大豆水解蛋白肽对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响 小鼠给予大豆水解蛋白肽30天后对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响见表19。
表19大豆水解蛋白肽对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响
由表4可见，经口给予小鼠不同剂量的大豆水解蛋白肽(经3000D超滤)和粗肽粉(未经超滤)30天，与阴性对照组相比较，初始足跖厚度无显著性差异(P＞0.05)，足趾厚度差各剂量组和原粉组动物无显著性差异(P＞0.05)，即大豆水解蛋白肽(经3000D超滤)不能够增强小鼠的迟发型变态反应。
2.4.4大豆水解蛋白肽对小鼠半数溶血值(HC50)的影响 小鼠给予大豆水解蛋白肽30天后对小鼠半数溶血值(HC50)的影响见表20。
表20大豆水解蛋白肽对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
注*与阴性对照组比较有显著性差异P＜0.05；**与阴性对照组比较有极显著性差异P＜0.01 由表20可见，经口给予小鼠不同剂量的大豆水解蛋白肽30天，与阴性对照组比较，中剂量组半数溶血值有显著差异(P＜0.05)，高剂量组与粗肽粉组半数溶血值显著差异(P＜0.01)，表明大豆水解蛋白肽能提高小鼠半数溶血值。
2.4.5大豆水解蛋白肽对小鼠碳廓清功能的影响 给予大豆水解蛋白肽30天后对小鼠碳廓清能力的影响见表21。
表21大豆水解蛋白肽对小鼠碳廓清功能的影响
注*与阴性对照组比较有显著性差异P＜0.05 由表21可见，经口给予小鼠不同剂量的大豆水解蛋白肽和粗肽粉30天，与阴性对照组比较，中剂量组和高剂量组吞噬指数有显著性差异(P＞0.05)，即大豆水解蛋白肽可以增加小鼠碳廓清功能，原粉组未见增加小鼠碳廓清功能。
3实验结论 3.1选用复合酶为免疫肽的生产用酶；最佳超滤条件为pH＝7，压力为0.3psi，物料浓度为5％；在最佳超滤条件下获得的大豆免疫功能肽在3400Da的分子量所占的比例为70.95％；蛋白质含量89.2％；氮含量为14.272％。
3.2经口投予小鼠不同剂量的大豆水解蛋白肽30天，进行了3类免疫功能的试验，即反映细胞免疫功能的迟发型变态反应(足跖增厚法)、反映体液免疫功能的半数溶血值(HC50)的测定、反映单核-巨噬细胞吞噬功能的小鼠碳廓清实验的检测。结果表明本发明制备方法所制备的大豆水解蛋白肽可增强小鼠的半数溶血值和碳廓清功能，但是未见增加小鼠迟发型变态反应。说明本发明大豆水解蛋白肽具有增强体液免疫功能和单核-巨噬细胞吞噬功能。原液未见增加小鼠碳廓清功能，增强小鼠的半数溶血值效果不如同剂量的大豆水解蛋白肽。
权利要求
1、一种大豆蛋白免疫活性肽的制备方法，包括以下步骤将大豆分离蛋白用蛋白酶进行水解反应；将所得到的大豆分离蛋白水解液用超滤膜进行超滤；收集超滤液，即得。
2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的蛋白酶选自木瓜蛋白酶，复合蛋白酶，碱性蛋白酶或中性蛋白酶。
3、按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述的蛋白酶是复合蛋白酶；其中，采用复合蛋白酶进行水解的反应条件为反应温度为45℃，底物浓度为5％，酶用量10000IU/g，反应时间6小时，反应pH值为7。
4、按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述的蛋白酶是碱性蛋白酶；其中，采用碱性蛋白酶进行水解时的水解条件为反应温度50℃，底物浓度为5％，酶用量为12000IU/g，反应时间8小时，反应pH值为9。
5、按照权利要求2所述的方法，其特征在于所述的蛋白酶是木瓜蛋白酶，其中采用木瓜蛋白酶进行水解的组合条件为底物浓度5％，反应温度50℃，反应时间6hr，酶用量7000IU/g，反应pH值为6；或是所述的蛋白酶是中性蛋白酶，其中采用中性蛋白酶进行水解的组合条件为反应温度45℃，底物浓度为5％，酶用量为7000IU/g，反应6小时，反应pH值为6.5。
6、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的超滤膜是分子量为3000Da的超滤膜。
7、按照权利要求1所述的方法，其特征在在于所述的超滤是在15psi至40psi的压力下进行超滤；优选的，所述的超滤是在30psi的压力下进行超滤。
8、按照权利要求1所述的方法，其特征在于将重量百分比浓度为3％-6％的大豆分离蛋白水解液进行超滤；优选的，将重量百分比浓度为5％的大豆分离蛋白水解液进行超滤。
9、按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述大豆分离蛋白水解液的pH值为5-8；优选的，所述大豆分离蛋白水解液的pH值为7。
10、由权利要求1-9任何一项方法所制备得到的大豆蛋白免疫活性肽，其特征在于活性肽分子量在3400Da所占的比例为70.95％。
全文摘要
本发明公开了一种大豆蛋白免疫活性肽的制备方法及其产品。其制备方法包括以下步骤将大豆分离蛋白用蛋白酶进行水解反应；将大豆分离蛋白的水解液用超滤膜进行超滤；收集超滤液，即得。本发明方法所制备得到的大豆蛋白免疫活性肽在3400Da的分子量所占的比例为70.95％；蛋白质含量为89.2％；氮含量为14.272％。经口投予小鼠不同剂量本发明所制备的大豆水解蛋白肽30天，进行了3类免疫功能的实验，实验结果表明，本发明方法所制备的大豆蛋白免疫活性肽可增强小鼠的半数溶血值和碳廓清功能，未见增加小鼠迟发型变态反应，说明本发明大豆蛋白免疫活性肽具有增强体液免疫功能和单核-巨噬细胞吞噬功能。
文档编号C07K14/415GK101608206SQ20091015077
公开日2009年12月23日 申请日期2009年6月30日 优先权日2009年6月1日
发明者富校轶, 慧 许, 磊 姚, 朱秀清, 孙树坤, 江连洲 申请人:黑龙江省大豆技术开发研究中心