专利名称：双特异性egfr/igfir结合分子的制作方法
双特异性EGFR/IGFIR结合分子序列表本申请含有已经经由EFS网络提交的序列表，并且在此通过提及而将其完整收录。2009年11月23日创建的所述ASCII拷贝命名为C0TH52W0. txt，并且大小为552，529字节。相关申请本申请要求2008年11月24日提交的美国临时专利申请号61/200，164 ；2008年 11月26日提交的61/200，282 ；2009年4月17日提交的61/212，966 ；2009年5月14日提交的61/178，279 ；和2009年7月21日提交的61/227，330的权益，在此通过提及而将所述申请完整收录。介绍本发明涉及供诊断、研究和治疗应用中使用的EGFR结合域和包含EGFR结合域和独特的IGFIR结合域的双特异性分子。本发明进一步涉及包含此类蛋白质的细胞、编码此类蛋白质或其片段的多核苷酸、和包含编码该新蛋白质的多核苷酸的载体。例示性EGFR结合域和双特异性分子包括基于第十纤连蛋白III型域的抗体样蛋白质二聚体。
背景技术：
受体酪氨酸激酶信号传导的活化对癌症形成至关重要(参见例如Grimberg A. Cancer Biol Ther. 20032(6) :630_5 及 Mendelsohn J.J Clin Oncol. 200321 (14) 2787-99)。受体酪氨酸激酶具有保守域结构，包括胞外域、跨膜域和胞内酪氨酸激酶域。胞外域能结合配体，诸如多肽生长因子或细胞膜结合分子。通常，配体结合或配体结合诱导的受体酪氨酸激酶二聚化活化受体的胞内催化性酪氨酸激酶域和随后的信号转导。受体酪氨酸激酶的例子包括但不限于ERBB受体(例如EGFR、ERBB2、ERBB3、 ERBB4)、产促红细胞生成素肝细胞(EPH)受体、成纤维细胞生长因子(FGF)受体(例如 FGFRU FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5)、血小板源性生长因子(PDGF)受体(例如 PDGFR-A、 PDGFR-B)、血管内皮生长因子(VEGF)受体(例如 VEGFR1/FLT1、VEGFR2/FLK1、VEGF3)、具有免疫球蛋白样和EGF样域的酪氨酸激酶(TIE)受体、胰岛素样生长因子(IGF)受体(例如 INS-R、IGFIR、IR-R)、盘状域(Discoidin Domain, DD)受体、c_Met (MET)的受体、rec印teur d’ origine nantais (RON)(又称为巨噬细胞刺激1受体)、Flt3fins相关酪氨酸激酶 3 (Flt3)、集落刺激因子1 (CSFl)受体、粘附相关激酶受体(例如Axl)、c-kit (KIT)的受体和胰岛素受体相关(IRR)受体。对受体酪氨酸激酶的抑制已经作为用于某些人恶性肿瘤的有效治疗策略引起了人们的注意(综述可参见 Roussidis AE, In Vivo. 200216(6) :459_69)。虽然靶向性单一疗法最初可以有效治疗癌症，但是往往随后出现治疗抗性， 这可能是由于其它信号传导级联的上调所致(参见例如Nahta R等，Breast Cancer Res. 20068(6) :215 及 Horn L 等，Clin Lung Cancer. 20078 :S68_73)。因而，需要开发改良的癌症治疗剂。发明概述
在一个方面，本申请提供了具有新序列的EGFR结合性第十纤连蛋白III型域 (1QFn3)。还提供了具有共有序列的EGFR结合性uiFr^tj此类EGFR结合性wFM可以是单体，或者可以包含在融合蛋白内作为其一部分。在另一个方面，本申请提供了结合EGFR和IGFIR的双特异性分子，在本文中称之为“E/I结合物”。本发明涵盖的E/I结合物包括配体结合支架蛋白(例如淀粉酶抑肽 (tendamistat)、Affibody、纤连蛋白 III 型域、Anticalin、四连蛋白(tetranectin)、和锚蛋白)的二聚体和双特异性抗体。在构建为单条多肽链时，可以以任何取向构建E/I结合物，例如从N端至C端采取E-I排布或I-E排布。在一个方面，提供了抗体样蛋白质二聚体，其包含与IGFIR结合性kiFM共价或非共价连接的EGFR结合性10Fn3。10Fn3以小于500nM的Kd结合其靶物(EGFR或IGFIR)。每个单独的uiFr^独立具有与SEQ ID NO :32至少70、80、85、90、95、98、或100%相同的氨基酸序列，其中η是1-20的整数，ο是1-20的整数，而ρ是1_40的整数。在一些实施方案中， η是8-12的整数，ο是4-8的整数，而ρ是4_28的整数。在一些实施方案中，η是10，ο是 6，而ρ是12。在一些实施方案中，抗体样蛋白质二聚体包含经由多肽接头或聚乙二醇模块与 EGFR结合性kiFM共价连接的IGFIR结合性kiFM15在一些实施方案中，抗体样蛋白质二聚体包含与 SEQ ID NO :20-31、53-58、87-92、98-105、118-133、149-154、164-169、179-184、 192-197,205-210和211-216中任一项至少80、90、95、或100%相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，Ε/Ι结合物包含具有 SEQ ID NO :20-31、53-58、87-92、98_105、 118-133、149-154、164-169、179-184、192-197、205-210 和 211-216 中任一项的氨基酸序列，其中(i)EGFR结合性1QFn3和/或IGF-IR结合性1QFn3包含相对于SEQ ID N0:1的相应支架氨基酸具有0至20、0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至 1处替代、保守替代、缺失或添加的kiFM支架，和/或(ii)EGFR结合性kiFM相对于SEQ ID NO :5-8、52、66-68、106-108、112-114、140-142、155-157、170-172、182、185-187、198-200、 或219-327中任一项的相应环序列具有0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、 0至2、或0至1处替代、保守替代、缺失或添加，和/或IGF-IR结合性kiFM相对于SEQ ID NO 3的相应环序列具有0至15、0至10、0至8、0至6、0至5、0至4、0至3、0至2、或0至 1处替代、保守替代、缺失或添加。在一个方面，提供了药学可接受组合物，其包含如本文中所描述的抗体样蛋白质二聚体和药学可接受载体，其中所述组合物基本上没有热原。在又一个方面，提供了用于在受试者中治疗过度增殖性病症诸如癌症的方法，包括对有所需要的受试者施用治疗有效量的包含如本文中所描述的抗体样蛋白质二聚体的药学可接受组合物。在另一个方面，本申请提供了编码如本文中所描述的抗体样蛋白质二聚体的核酸。还提供了包含编码如本文中所描述的抗体样二聚体的核酸的载体。合适的载体包括例如表达载体。还提供了含有核酸、载体或表达载体的宿主细胞，所述核酸、载体或表达载体包含编码如本文中所描述的抗体样蛋白质二聚体的核酸。合适的宿主细胞包括原核和真核宿主细胞。例示性原核细胞是细菌细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)。例示性真核细胞是哺乳动物细胞，诸如CHO细胞。还提供了用于生成如本文中所描述的抗体样蛋白质二聚体的方法，包括培养含有包含编码抗体样蛋白质二聚体的核酸的核酸、载体或表达载体的宿主细胞，并自培养基回收表达的抗体样蛋白质二聚体。附图简述
图1.对I1-GS10-E2的SDS-PAGE分析。将来自HMS174(DE3)细菌细胞离心沉淀裂解物(表达I1-GS10-E2，并通过HisTrap层析柱加以纯化)的样品在4-12% NuPAGE微型胶上运行，通过Sypr0-Orange染色，并通过STORM成像仪显现。Mark 12分子重量标准品 (第1道)；可溶性裂解物(第2道)；不溶性裂解物(第3道)；HisTrap加载(第4道)； HisTrap未结合(第5道)；合并的HisTrap洗脱物(第6道)；透析入5OmM NaOAc, 150mM NaCl，pH 4.5 中(第 7 道)；透析入 PBS 中(第 8 道)；透析入 Tris，150mM NaCl，pH 8· 5 中 (第9道)。图2. Α.对中等规模纯化的I1-GS10-E2的SEC分析。用流动相IOOmM NaPO4, IOOmM NaSO4U50mM NaCl，ρΗ 6· 8 将 22 μ g经HisTrap 纯化的透析入PBS，pH 7. 4 中的 I1-GS10-E2 加载到 Superdex 20010/30SEC 柱(GE Healthcare)上，并使用 A280 来测量。I1-GS10-E2 主要作为分子量范围为约24. 6kDa(相对于球状凝胶过滤标准品(BioRad))的单一单体种类洗脱。B.对E2-GS10-I1的SEC分析。图3. A.进行PBS中的中等规模纯化的I1_GS10_E2的差示扫描量热法 (Differential Scanning Calorimetry,DSC)以测定Tm。在3个大气压下以每分钟1度的速率从5°C至95°C对lmg/mL I1-GS10-E2溶液扫描。相对于PBS缓冲液的对照运行分析数据。B. E2-GS10-I1 的 DSC0图4.对H292细胞中的IGFR活性的抑制。用100ng/mL IGF-I和100ng/mLEGF刺激细胞，并用· 11、口 E1、或ΔΕΙ-GSIO-IIHTPP制备物来处理。通过ELISA来测定酪氨酸 1131上的IGFIR磷酸化。图5.对H292细胞中的EGFR活性的抑制。用100ng/mL IGF-I和lOOng/mLEGF刺激细胞，并用· 11、□ El、或Δ El-GSlO-I IHTPP制备物处理。通过ELISA来测定酪氨酸1068 上的EGFR磷酸化。图6.对Η292细胞中的AKT磷酸化的抑制。用100ng/mL IGF-I和lOOng/mLEGF 刺激细胞，并用· 11、口 E1、或ΔΕΙ-GSIO-IIHTPP制备物处理。通过ELISA来测定丝氨酸 473上的AKT磷酸化。图7.对RH41细胞增殖的抑制。用· II、□ E1、或Δ E1-GS10-I1HTPP制备物处理细胞，并测定百分比增殖抑制。图8.对H292细胞增殖的抑制。用· II、□ E1、或Δ E1-GS10-I1HTPP制备物处理细胞，并测定百分比增殖抑制。图9.分离的EGFR单连接素(mononectin)、在C端位置具有丝氨酸而没有添加的 PEG的基于wFM的E/I结合物、和在C端位置具有半胱氨酸且与40kDa分枝PEG偶联的基于kiFM的E/I结合物在基于细胞的功能性测定法中的IC50值的汇总。显示了代表性的数据。图10.对在N端和C端位置具有E2的PEG化的基于wFM的E/I结合物的免疫印迹分析。尽管这两种构建体在抑制EGFR的H292细胞测定法中展现相当的活性，但是在C端位置具有E2的基于wFM的E/I结合物不降解EGFR，而在N端位置具有E2的基于wFM的
8E/I结合物降解了 EGFR。这两种构建体在此细胞系中都显示非常弱的IGFR降解到无IGFR 降解。引入β-肌动蛋白以证明所有泳道的加载量相同。还检查了 EGFR、ERK和Shc的磷酸化状态。图11.对Η292细胞中的EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制。这两种构建体在抑制EGFR 的Η292细胞测定法中展现出相当的活性。E2-GS10-I1 (具有PEG)(〇)、I1_GS10_E2(具有 PEG) ( □)、帕尼单抗(panitumumab)(——)。图12.肿瘤异种移植物研究的结果。图12A :H292人肿瘤异种移植物模型中的临床前抗肿瘤活性。对下列各组显示自8只小鼠的组计算的平均肿瘤大小，以mg计对照动物(■)、以100mg/kg剂量给药的E3-GS10-I1 (w/PEG)(〇)、以100mg/kg剂量给药的 E2-GS10-I1 (具有PEG) (□)、以Img/小鼠(Δ)或0. Img/小鼠剂量给药的帕尼单抗(▽)。 χ轴上的字母a指示所施用的E/I结合物剂量，而ρ指示所施用的帕尼单抗剂量。图12B 显示每个组在研究全过程里的平均重量变化。符号如图12A图注中所描述的。图13. H292NSCLC肿瘤异种移植物模型中的药效学效果。在肿瘤裂解物中测定标识的分析物的水平，如实施例12中所描述的。㈧磷酸-EGFR、⑶磷酸-ErbB2、(C)磷酸-IGFRJP⑶总EGFR。方格图案的柱形=帕尼单抗，空心柱形=E2-GS10-I1 (具有PEG)， 阴影线的柱形=E3-GS10-I1 (具有PEG)。图14.对MCF7r细胞的Western印迹分析，与MCF7亲本细胞做比较。图15.裸鼠中的MCF7(小图A)和MCF7r(小图B)人肿瘤异种移植物研究。对自每组8只小鼠计算的这两项研究显示均值肿瘤大小。图16.裸鼠中的GEO人肿瘤异种移植物研究。图17.裸鼠中的H292人肿瘤异种移植物研究。图18.用H292NSCLC细胞进行的集落形成测定法。A.显示单块平板的代表性数据。B.显示一种基于kiFM的E/I结合物的IC50，误差棒从一式三份测量值算出。图19.表位定位测定法。在小图A中显示了多种EGFR结合抗体的表位结合的位置。实施例18，表11中提供了抗体的描述。表11的左栏中为每种抗EGFR抗体提供了一个编号，该编号与小图A中所显示的编号抗体相关。小图B显示了如实施例18中所描述的一个例示性表位定位测定。图20.对基于’113的E/I结合物——PEG化的I1-GS10-E5的DSC分析，测量的扫描范围的lmg/ml蛋白质浓度以15-95°C，结果Tm测量值为55. 2°C。图21.评估基于uiFr^的E/I结合物对H292细胞中的AKT磷酸化的抑制，通过 ELISA测量。PEG化的I1-GS10-E5(〇)比单独的PEG化的Il (■)或单独的PEG化的 E5 ( ▲)更有力地阻断IGFl刺激的AKT磷酸化。图22.评估基于kiFM的E/I结合物对H292细胞的细胞增殖的抑制。PEG化的 I1-GS10-E5( □)比单独的PEG化的Il(A)更有力地抑制H292细胞生长，而单独的PEG 化的Ε5(·)仅具有弱的效果。测定一式三份实施。显示了代表性数据。图23.评估基于kiFM的Ε/Ι结合物对RH41细胞的细胞增殖的抑制。PEG化的 I1-GS10-E5( □)抑制RH41细胞生长略强于单独的PEG化的Il(A)和单独的PEG化的 E5(·)，而帕尼单抗(虚线)几乎没有效果。测定一式三份实施。显示了代表性数据。图24.基于kiFM的结合物(PEG化的)对配体刺激的信号传导的抑制。基于wFM的E/I结合物(PEG化的I1-GS10-E5)对DiFi (小图A)、H292 (小图B)或BxPC3 (小图C) 细胞中的受体活化和细胞信号传导的影响。让细胞血清饥饿，并用1 μ M基于kiFM的结合物处理2小时，之后用EGF、IGFl或EGF+IGF1的组合刺激。探查GAPDH以显示所有泳道中
加载量相等。图25.基于wFM的结合物(未PEG化的)对H292细胞中的配体刺激的信号传导的抑制。基于kiFM的E/I结合物(E2-GS10-I1)对H292细胞中的受体活化和细胞信号传导的影响。让细胞血清饥饿，并用1 μ M基于卞113的结合物处理2小时，之后用EGF、IGFl 或EGF+IGF1的组合刺激。并探查GAPDH以显示所有泳道中加载量相等。图26.用基于kiFM的Ε/Ι结合物进行的竞争结合研究。Α.基于wFM的EGFR结合物不竞争EGFR抗体对EGFR的结合。初始注射基于kiFM的EGFR结合物的显示对芯片表面上的EGFR的结合。第二次注射与等量的西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗、或尼妥珠单抗(nimotuzumab)混合的基于1QFn3的EGFR结合物，没有显示基于1QFn3的EGFR结合物竞争抗体对EGFR的结合。B.基于wFM的E/I结合物能同时结合EGFR和IGF-IR。初始注射基于kiFM的E/I结合物显示对芯片表面上固定化的EGFR的结合。第二次注射与等量的可溶性IGF-IR混合的基于wFM的E/I结合物显示sIGF-IR对固定化的基于kiFM的E/I 结合物的另一端的结合。图27.异种移植物研究的最后一剂后4小时的TGF α血浆水平。在处理结束时自表24中所描述的BxPC3 (小图A)、GE0(小图B)和H441 (小图C)异种移植物研究采集血浆样品，对血浆样品分析TGF α的循环水平。图28.不荷瘤裸鼠中PEG化的I1-GS10-E5给药后的TGF α和IGFl血浆水平。对不荷瘤小鼠给予单个剂量的PEG化的I1-GS10-E5基于kiFM的结合物，并分析TGF α (小图Α)和IGFl (小图B)的循环水平。图29.使用基于kiFM的Ε/Ι结合物进行的Η292异种移植物研究，与帕尼单抗进行比较。对Η292异种移植物不进行处理(■)，或一周三次给药PBS中配制的基于kiFM的结合物及如图中所描述的各种构建体或每三天i. P.给药Img/小鼠(〇)或0. Img/小鼠 (□)的帕尼单抗。在χ轴上标示基于kiFM的结合物和帕尼单抗(▲)的实际剂量，其中帕尼单抗剂量最接近χ轴，位于标示基于wFr^的结合物剂量的各三角形的下方。图29A显示了到第43天的测量值。图29B显示了到第27天的测量值。图30. PEG化的E2-GS10-I1在小鼠中的药动学参数谱。图31.多种基于 10Fn3 的 E/I 结合物以 100mg/kg 和 10mg/kg IP,及 10mg/kg 和 64mg/kg SC的半衰期比较。图32. PEG化的E2-GS10-I1在RH41模型中的抗肿瘤功效。图33.测量肿瘤中的药效学终点。在处理结束时，在最后一剂后4小时从DiFi 异种移植物模型(小图A)和H292异种移植物模型(小图B)取出肿瘤，并对其检查磷酸-EGFR、磷酸-IGFR、总EGFR和总IGFR的水平。将等量的总蛋白质裂解物加载到凝胶的每个泳道中，并用GAPDH探查印迹以证明所有泳道的加载量相等。图34.抗EGFR结合物679F09的序列(SEQ ID NO 490)。将改变的环残基加下划线。图35. BC环序列分析I。来自EGFR结合序列的BC环中每个位置上的氨基酸的步页率。使用 WebLogo (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo :A sequence logo generator. Genome Research, 14 :1188_1190，2004)来产生图像。图36. DE环序列分析1。来自EGFR结合序列的DE环(所分析的263种独特的DE 环序列)中每个位置上的氨基酸的频率。图37. TO环(ΙΟ-aa长)序列分析I。TO环中每个位置上的氨基酸的频率，所述TO 环来自具有长10个氨基酸的re环(所分析的228种独特的长10个氨基酸的re环)的 EGFR结合序列。图38. TO环(15-aa长)序列分析I。TO环中每个位置上的氨基酸的频率，所述TO 环来自具有长15个氨基酸的re环(所分析的349种独特的长15个氨基酸的re环)的 EGFR结合序列。图39.BC环序列分析II。来自所有“强的”序列的BC环(所分析的85种独特的 BC环序列)中每个位置上的氨基酸的频率。图40.DE环序列分析II。来自所有“强的”序列的DE环(所分析的60种独特的 DE环序列)中每个位置上的氨基酸的频率。图41. FG环(ΙΟ-aa长)序列分析II。TO环中每个位置上的氨基酸的频率，所述 FG环来自所有具有长10个氨基酸的re环(所分析的6种独特的长10个氨基酸的re环) 的“强”序列。图42. FG环(15-aa长)序列分析II。TO环中每个位置上的氨基酸的频率，所述 FG环来自所有具有长15个氨基酸的TO环(所分析的65种独特的长15个氨基酸的TO环) 的“有力的”序列。图43.如实施例22中所描述的基于kiFM的E/I结合物的各种特征的汇总表。图44.如实施例30中所描述的基于kiFM的E/I结合物的各种药动学参数的汇总表。图45.如实施例32中所描述的E单体的氨基酸序列。将每个序列中的BC、DE和 FG环加下划线。图46.野生型核心序歹Ij (SEQ ID NO 1的氨基酸9-94)与Il核心(SEQ ID N0: 65)、E1 核心(SEQ ID NO 66)、E2 核心(SEQ ID NO 67)、E3 核心(SEQ ID NO 68)、E4 核心 (SEQ ID NO 108)、E5 核心(SEQ ID NO :114)、E85 核心(SEQ ID NO 141)、E90 核心(SEQ ID NO 156)、E96 核心(SEQ ID NO 171)、E105 核心(SEQ ID NO 186)、禾口 El 12 核心(SEQ ID NO 199)的比对。将野生型序列中的BC、DE和TO环以粗体显示，并加下划线。I和E核心的与野生型相比实际上发生了改变的氨基酸残基以粗体显示，并加下划线。图47. E和I单体的核酸序列。除非另有规定，核苷酸序列编码具有N+10N端延伸、 Ser尾部、和his标签的单体。图48.基于kiFM的E/I结合物的核酸序列。所有核苷酸序列编码基于wFM的E/ I结合物，其具有构建体中的第一单体上的N+10N端延伸和构建体中的第二单体上的Cys尾部和 his 标签。GSlO 是 SEQ ID NO 11 ；GSGCGS8 是 SEQID NO 218 ；而 GSGC 是 SEQ ID NO 489。发明详述定义
如本文中所使用的，以下术语和短语应当具有下文所列的意义。除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。除非上下文另有明确规定，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数的所指物。术语“包含”以包含在内的开放意义使用，指可以包括别的元素。术语“包括”用于指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。术语“抗体样蛋白质”指具有“免疫球蛋白样折叠”的非免疫球蛋白蛋白质，即包含在结构上组织成一组β或β样链，形成β片层的约80-150个氨基酸残基，其中所述各β或β样链通过居间环部分来连接。β片层形成抗体样蛋白质的稳定核心，同时创建由连接所述各β或β样链的环构成的两个“面”。如本文中所描述的，这些环可以加以变化以创建定制的配体结合位点，而且可以在不破坏蛋白质总体稳定性的前提下产生此类变化。此类抗体样蛋白质的例子是“基于纤连蛋白的支架蛋白质”，其指基于纤连蛋白III型域(Fn3)的多肽。在一个方面，抗体样蛋白质基于第十纤连蛋白III型域C°Fn3)。“多肽”指两个或更多个氨基酸的任何序列，而不管长度、翻译后修饰、或功能如何。“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用。“百分比(％)氨基酸序列同一性”在本文中定义为比对序列并在必要时弓丨入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且在不将任何保守替代视为序列同一性的一部分的条件下，候选序列中与所选择序列中的氨基酸残基相同的氨基酸的百分比。用于确定百分比氨基酸序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的多种方式来实现，例如使用公众可获得的计算机软件诸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2 或 Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量比对的适宜参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。然而，就本文而言，％氨基酸序列同一性值是如下文所描述的使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序是由Genentech公司创作的，已经与用户文档一起提交给美国版权局(U. S. Copyright Office, Washington D. C.， 20559)，登记为美国版权注册号TXU510087，而且公众可通过Genentech公司(South San Francisco,Calif.)获得。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统、优选数字UNIX V4. OD 上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不再变化。就本文而言，给定氨基酸序列A对(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含对、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算100乘以分数X/Y，其中X是序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，且其中Y 是B中的氨基酸残基总数。应当理解的是，若氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，则A对B的％氨基酸序列同一性会不等于B对A的％氨基酸序列同一性。术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减缓，优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减缓，优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病症有关的症状。 以药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞为限，药物可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展前时间(time to disease progression,TTP)
12和/或测定响应率(response rate, RR)来测量体内功效。氨基酸序列或化合物的半衰期可一般性地定义为多肽的血清浓度在体内降低 50% (例如由于序列或化合物的降解和/或天然机制对序列或化合物清除或隔绝)所花费的时间。可以以本领域中已知的任何方式来测定半衰期，诸如通过药动学分析。参见例如 M Gibaldi 和 D Perron "Pharmacokinetics",由 Marcel Dekker 出版，第 2 次修订版 (1982)。术语“E/I结合物”指包含EGFR结合域和独特的IGFIR结合域的双特异性分子。 两个域可以共价或非共价连接。例示性的E/I结合物是包含EGFR结合性kiFM和IGFIR结合性wFM的抗体样二聚体，即基于kiFM的E/I结合物。概述表皮生长因子受体(EGFR)和胰岛素样生长因子受体(ITOR)在数类人癌症的肿瘤发生中发挥至关重要的作用。对任一受体的抑制均可在临床前模型中及在临床上有效地降低肿瘤生长。阻断EGFR途径在体外肿瘤模型中诱导向IGFR途径的转换以驱动生长。因此， 同时阻断这两种受体可以克服途径转换从而实现优于单独阻断任一途径的功效。在例示性的实施方案中，与E/I结合物的单体构件相比，E/I结合物的活性是协同的。说明书描述了结合EGFR和IGFIR的双特异性分子，在本文中称为“E/I结合物”， 等等。申请人已经发现了，此类双特异性分子以大于相应的单特异性结合物的效力抑制癌症模型细胞系的增殖(参见例如实施例9和图8)。E/I结合物在众多治疗性应用中将会是有用的，尤其在癌症的治疗中。除了治疗性应用外，还可以在任何期望检测EGFR和/或IGFIR的场合使用E/I结合物。E/I结合物具有EGFR结合域和独特的IGFIR结合域。典型的结合域包括抗体； 因此，可以生成双特异性抗体以发挥E/I结合物的功能。包含成对互补的Vh和\区的双特异性抗体是本领域已知的。这些双特异性抗体包含两对Vh和\，每个Vg对结合单一抗原。(参见例如 Hu 等，Cancer Res. 199656 3055-306 ；Neri 等，J. Mol. Biol. 1995246 367-373 ；Atwell 等，Mol. Immunol. 1996 33 :1301_1312 ；及 Carter 等，Protein Sci. 1997 6 =781-788)。一种例示性的双特异性抗体是双抗体，即具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这样的片段包含在同一条多肽链中连接的轻链可变域与重链可变域(Hollinger等， Proc.Natl. Acad. Sci. USA 1993 90 :6444_6448)。E/I结合物还涵盖配体结合支架蛋白质的二聚体。支架蛋白质在文献中有充分的描述，包括例如淀粉酶抑肽、Affibody、纤连蛋白III型域、Anticalin、四连蛋白、和锚蛋白。可用于生成E/I结合物的其它支架蛋白质见综述Binz等，Nature Biotech 23: 1257-1268(2005)。支架蛋白质基于在决定和稳定化三维结构中重要的刚性核心结构或 “框架”。位于支架的固定或保守残基之间的是可变区(诸如环、表面或穴)，可以对其进行随机化以改变配体的结合。在固定的支架残基间的可变区提供极大的氨基酸多样性，以提供对靶分子的特异性结合。一种例示性的配体结合支架蛋白质基于纤连蛋白III型域(Fn3)。纤连蛋白是一种在胞外基质的形成和细胞-细胞相互作用中发挥至关重要的作用的大蛋白质；其由三类 (I、II、和III型)小域的许多重复组成。Fn3是小的、单体的、可溶性的、及稳定的。它缺乏二硫键，因此在还原条件下是稳定的。Fn3的总体结构类似免疫球蛋白折叠。Fn3域以N端至C端的顺序包含β或β样链A ；环AB ； β或β样链B ；环BC ； β或β样链C ；环CD ； β或β样链D ；环DE ； β或β 样链E ；环EF ； β或β样链F ；环TO ；和β或β样链G。7条反平行β -链排列为两个β 片层，它们形成稳定的核心，同时创建由连接β或β样链的环构成的两个“面”。环AB、CD、 和EF位于一个面上，而环BC、DEJP TO位于相对的面上。环AB、BC、⑶、DE、EF和TO中的任何或全部均可以参与配体结合。Fn3有至少15种不同模块，而且虽然这些分子间的序列同源性较低，但是它们在三级结构上都享有高度的相似性。AdnectinsTM(Adnexus, Bristol-Myers Squibb 的一家研发公司)是基于第十纤连蛋白III型域，即Fn3的第十个模块C°Fn3)的配体结合支架蛋白。SEQ ID NO 1中列出了天然存在的人wFr^的氨基酸序列。VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKST ATISGLKPGVDY TITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO 1)(着重显示 BC、FGjP DE 环)。在SEQ ID NO 1中，AB环对应于残基15_16，BC环对应于残基21-30，CD环对应于残基39-45，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基60-66，而TO环对应于残基76-87。 (Xu 等，Chemistry&Biology 20029:933-942)。BC、DE 和 FG 环沿着分子的一个面排列，而 AB、⑶和EF环沿着分子的相对面排列。在SEQ ID NO :1中，β链A对应于残基9-14，β链B对应于残基17-20，β链C 对应于残基31-38，β链D对应于残基46-50，β链E对应于残基57-59，β链F对应于残基67-75，而β链G对应于残基88-94。链经由相应的环彼此连接，例如链A和B经由环 AB连接而形成链Α、环ΑΒ、链B的排布，等等。涉及形成疏水核心(“核心氨基酸残基”)的残基包括与SEQ ID NO :1的下列氨基酸对应的氨基酸L8、V10、A13、L18、I20、W22、Y32、 134、Y36、F48、V50、A57、159、L62、Y68、170、V72、A74、188、190 和 Y92，其中核心氨基酸残基以后面有其位于SEQ ID NO :1内的位置的单字母氨基酸密码表示。参见例如Dickinson 等，J. Mol. Biol. 236 :1079_1092 (1994)。如上文所描述的，与SEQ ID NO 1的残基21_30、51_56、和76-87对应的氨基酸残基分别限定BC、DE和re环。然而，应当理解，不是每个在环区内的残基都需要进行修饰以实现对期望的靶物(诸如IGF-IR或EGFR)具有强亲和力的kiFM结合物。例如，在本文中所描述的许多例子中，仅修饰与SEQ ID NO 1的氨基酸23-30、52-55和77-86对应的残基以生成高亲和力kiFM结合物(参见图46)。因而，在某些实施方案中，BC环可以由与SEQ ID NO 1的残基23-30对应的氨基酸限定，DE环可以由与SEQ ID NO 1的残基52-55对应的氨基酸限定，而re环可以由与SEQ ID NO :1的残基77-86对应的氨基酸限定。10Fn3在结构和功能上与抗体，特别是抗体的可变区相似。虽然wFr^域可以描述为 “抗体模拟物”或“抗体样蛋白质”，但是它们确实提供许多超过常规抗体的优点。具体地， 与抗体相比，它们展现出更好的折叠和热稳定性特性，而且它们缺乏二硫键，已知二硫键在某些条件下可妨碍或阻止正确的折叠。例示性的基于kiFM的E/I结合物主要是单体的，Tm 的平均为约50°C。10Fn3的BC、DE、和TO环与来自免疫球蛋白的互补决定区(OTR)类似。这些环区中的氨基酸序列变化改变kiFM的结合特异性。CDR样环外部的蛋白质序列与来自免疫球蛋白的框架区类似，而且在kiFM的结构构象中发挥作用。以结构构象的改变不破坏配体结合
14为限，kiFM的框架样区的变化是容许的。用于生成kiFM配体特异性结合物的方法已经记载于 PCT
发明者斯图尔特.伊曼纽尔, 琳达.恩格尔, 琼.卡博尼, 金格.C.拉克斯特劳, 雷.坎普豪森, 马丁.C.赖特, 马科.戈塔蒂斯 申请人:百时美施贵宝公司