专利名称：一种复合分子及其制备方法和药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复合分子及其制备方法和药物组合物。
背景技术：
干扰RNA (RNAi，或siRNA)是近年来发现的一种抑制基因表达的小RNA。siRNA的主要作用机制是通过其反义RNA与靶基因的mRNA发生同源互补而抑制靶基因的表达。由于siRNA能够特异地抑制靶基因的表达，所以它在医药领域具有广阔的应用前景。但是外源siRNA的稳定性差，血液容留时间短，细胞和组织通透性(penetration)差，这几方面严重阻碍了外源siRNA抑制靶基因表达的应用。siRNA的稳定性差不是由于其在双链形式下被降解，而是由于在双链-单链的杂交-解旋平衡中(亦称双链核酸的“呼吸”)，其单链形式被RNase降解而导致快速失衡，造成双链siRNA快速解旋降解。根据以上原理，许多研究人员力图通过对siRNA进行修饰而使其双链不易解旋，进而改善其稳定性并提高其血液容留时间。例如WO 2004/015075公开了 "An interfering hairpin RNA having the structure X. sub. l-L-X. sub. 2, wherein X.sub.1 and X. sub. 2 are nucleotide sequences having sufficient complementarity to one another to form a double-stranded stem hybrid and Lisa loop region comprising a non—nucleotide linker molecule, wherein at least a portion of one of the nucleotide sequences located within the double-stranded stem is complementary to a sequence of said target RNA”，即两条 siRNA链各自的一端用非核酸分子连接形成发卡结构的siRNA，其中所述非核酸分子选自“polyethers，polyamines, polyesters, polyphosphodiesters, alkylenes, attachments, bioconjugates, chromophores, reporter groups, dye labeled RNAs, and non-naturalIy occurring nucleotide analogues or combinations thereof，，。W02009/074076 公开了一种干扰革巴基因表达的复合分子，该复合分子含有两条至少80%互补的siRNA链X1和的5’端与的3’端通过非核酸分子L1连接，&的5’端与&的3’端通过非核酸分子L2连接。所述非核酸连接分子L1和非核酸连接分子L2可以为具有羧基、氨基或巯基的寡肽、聚酯、聚醚、烷烃、烯烃、炔烃和人工合成核酸类似物中的一种。其它种类的双链核酸，如双链DNA和除siRNA之外的其它双链RNA也存在稳定性差，血液容留时间短的问题。但是，包括WO 2004/015075和WO 2009/074076在内现有技术都没有公开通过巯
基与马来酰胺酸甲酯的迈克尔加成反应来对双链核酸进行修饰。
发明内容
本发明的目的是为了提供了一种稳定性好且血液容留时间长的复合分子及其制备方法和应用。本发明的发明人通过研究发现，通过巯基与马来酰胺酸甲酯或马来酰亚胺的迈克尔加成反应，可成功实现核酸的单双端交联，修饰交联后的核酸的稳定性得到改善，从而延长血液容留时间。本发明提供了一种复合分子，该复合分子含有两条至少80%互补的核酸链X1和 X2, &的5’端与&的3’端通过连接基团L1连接和/或&的5’端与&的3’端通过连接基团L2连接，其特征在于，所述连接基团L1和L2各自独立地如式1所示-RfS-Ii2-S-R3-式1在式1中，R1和民各自独立地表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基；&如式2、式3或式8所示
权利要求
1.一种复合分子，该复合分子含有两条至少80%互补的核酸链&和)(2，X1的5’端与 &的3’端通过连接基团L1连接和/或&的5’端与&的3’端通过连接基团L2连接，其特征在于，所述连接基团L1和L2各自独立地如式1所示-R1-S-R2-S-R3-式1在式1中，R1和民各自独立地表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基；&如式2、式3或式8所示
2.根据权利要求1所述的复合分子，其中，R2如式3所示。
3.根据权利要求1或2所述的复合分子，其中，R4表示碳原子数为1-20的亚烷基。
4.根据权利要求3所述的复合分子，其中，R4表示碳原子数为1-6的亚烷基。
5.根据权利要求1或2所述的复合分子，其中，R1和民各自独立地表示碳原子数为1-10 的亚烷基。
6.根据权利要求1或2所述的复合分子，其中，核酸链\和\为DNA链或RNA链，核酸链&或\具有15-50个碱基。
7.复合分子的制备方法，该方法包括以下步骤(1)提供包括至少80%互补的第一修饰核酸链和第二修饰核酸链的双链核酸，其中第一修饰核酸链的5’端具有基团-R19-SH且第二修饰核酸链的3’端具有基团-R2tl-SH,并且第二修饰核酸链的5’端具有基团-I^21-SH且第一修饰核酸链的3’端具有基团-R22-SH,其中，R19, R20, R21和Ii22各自独立地表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基；(2)提供式4、式5或式9所示的化合物；(3)将所述双链核酸与式4、式5或式9所示的化合物进行迈克尔加成反应，
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，在步骤C3)中，迈克尔加成反应的条件包括 在碱性催化剂的存在下，在反应介质中进行，双链核酸与式4或式5所示的化合物的摩尔比为1 500-2000，双链核酸在反应介质中的浓度为20-200 μ mol/L，反应温度为10-60°C，反应时间为1-10小时。
9.复合分子的制备方法，该方法包括以下步骤(1)提供至少80%互补的第一修饰核酸链和第二修饰核酸链，其中第一修饰核酸链的 5’端具有基团-R19H21且第二修饰核酸链的3’端具有基团-R2tl-S-Ii22,其中，R19和R2tl各自独立地表示碳原子数为1-20的任选取代的亚烷基，Ii21和Ii22中的一者表示氢并且另一者如式6、式7、式10或式11所示；(2)将第一修饰核酸链和第二修饰核酸链进行退火并进行迈克尔加成反应，
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，在步骤O)中，迈克尔加成反应的条件包括在碱性催化剂的存在下，在反应介质中进行，第一修饰核酸链和第二修饰核酸链中的任一者在反应介质中的浓度为20-200ymol/L，反应温度为10_60°C，反应时间为1_10小时。
11.一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求1-6中的任意一项所述的复合分子作为活性成分。
全文摘要
提供了一种稳定性好且血液容留时间长的复合分子及其制备方法和应用。所述复合分子含有两条至少80％互补的核酸链X1和X2，X1的5’端与X2的3’端通过连接基团L1连接和/或X2的5’端与X1的3’端通过连接基团L2连接。本发明提供的复合分子的两条核酸链X1和X2的5’端和/或3’端通过如式1所示的连接基团连接，因此核酸链不容易解旋降解，从而大大地改善了核酸的稳定性和血液容留时间。所述复合分子施用后，在细胞内，利用细胞内存在的Dicer酶释放复合分子中被锁定的核酸，从而释放的双链核酸发挥其作用，例如siRNA对靶基因的表达进行抑制。
文档编号C07H1/00GK102453066SQ201010518070
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者席真, 曹力强 申请人:南开大学, 昆山市工业技术研究院小核酸生物技术研究所有限责任公司