色谱方法及其纯化的化合物的制作方法

专利名称：色谱方法及其纯化的化合物的制作方法
技术领域：
本发明举例说明了离子对试剂(离子配对试剂，ion pairing agent)在制备级 (preparative scale)纯化中的利用。更具体地，本发明涉及离子对试剂在反相制备色谱中的用途，从而能够获得所期望的最终产物的高纯度。本发明显示了离子对试剂对所期望的多肽纯度具有显著影响。
背景技术：
应用大量不同的色谱程序来获得所期望的最终结果(关于纯度和产率)。反相色谱法是所采用的最有效的纯化方法之一。反向液相色谱(“RP-LC”)和反相高效液相色谱(“RP-HPLC”)通常用来纯化通过合成或重组方法产生的分子如肽和蛋白质。 RP-LC和RP-HPLC方法可以有效地分离密切相关的杂质，并且已被用来纯化许多各种各 # W (Lee et al. , “ Preparative HPLC, “ 8thBiotechnology Symposium, Pt. 1, 593-610 (1988))。而且，RP-LC和RP-HPLC已被成功用来在工业规模上纯化分子，尤其是蛋白质(Olsen et al.，1994，J. Chromatog. A，675，101)。离子对试剂如三乙胺(TEA)、三氟乙酸(TFA)、己烷磺酸(HSA)等在分析方法开发中的应用以及它对蛋白质峰分辨率的影响是众所周知的，Siayne Cox Gad ；Handbook of Pharmaceutical Biotechnology。离子对试剂经由其烃链吸附到固定相，从而产生双电层(双电荷层，electrical double layer)，其将电势施加于该固定相的表面。由于此，蛋白质/肽分子会经历与流动相的电解质离子的离子交换以及与反相固定相(逆相固定相， reverse phase stationary phase)的吸附作用(Frederick F. Cantwell et al. , 1984, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 2, Pages 153-164)。本发明涉及离子对试剂在蛋白质和肽的制备级纯化中的应用。更具体地，本发明涉及HSA和TEA在RP-HPLC制备线性色谱中的应用。在RP-HPLC中所使用的离子对试剂基本上包含具有可离子化基团(可电离基团， ionisable group)的长烃链。这些分子，在流动相中，与蛋白质/肽的表面电荷离子配对。 由于这种离子配对，该肽/蛋白质的疏水性会增加，这归因于离子对试剂的烃链。这种相互作用依赖于表面电荷。一种混合物的不同蛋白质具有不同的表面电荷，因而，差异性地结合至固定相，这改善蛋白质峰之间的分辨率。吸附的离子对试剂将特定电荷赋予其在固定相表面上的官能团。这会排斥相同电荷，因此，改变混合物中的各种蛋白质的选择性。在常规色谱法中已经观测到，随着(色谱)柱上的装载(量)增加时，在杂质和所感兴趣的蛋白质之间的分辨率会降低。在洗脱期间，蛋白质带趋向于合并，从而在制备纯度和产率方面会影响该色谱(层析)的性能。本发明设法避免这种问题，其对于蛋白质的可制造性是一个关键。在柱上的更高装载(超过在柱上注入的用于分析检测的蛋白质)对于工艺开发是至关重要的，并且支配所给定过程(方法)的成本和产率。本发明显示了，即使在增加蛋白质装载之后，离子对试剂对蛋白质的纯度也具有显著影响。本发明说明了离子对(试剂)在改善色谱步骤的产率的应用。
发明目的本发明的主要目的是获得用于从混合物纯化多肽的色谱方法。本发明的另一个主要目的是获得胰岛素类似物，如门冬胰岛素(Aspart)、甘精胰岛素(Glargine)以及赖脯胰岛素(Lispro)。本发明的又一个主要目的是获得纯化的多肽，如阿托西班(Atosiban)和依替巴月太(Eptifibatide)。

发明内容
因此，本发明涉及一种色谱方法，用于从具有至少一种相关杂质的混合物中纯化多肽，所述方法包括采用RP-HPLC的步骤(其利用浓度为约0. 01%至约2%的离子对试剂， 连同浓度为约5%至约85%的有机改性剂(organic modifier))；一种色谱方法，用于从具有至少一种相关杂质的混合物中纯化多肽，所述方法包括步骤a)用基于二氧化硅(C4-C18) 的树脂(基于硅胶(C4-C18)的树脂，Silica(C4-C18)I3aSed resin)来填充RP-HPLC柱，用约 5%至约85%的有机改性剂进行平衡，b)以约180cm/h至约360cm/h的流速将多肽混合物装载到该柱上，c)用浓度为约0. 05%至约的离子对试剂连同浓度为约5%至约85%的有机改性剂洗涤该柱，以及d)实施约10%至约70%的线性梯度，以从该柱洗脱该纯化的多肽；一种通过上述方法获得的胰岛素类似物，其纯度为约90%至约100% ；纯化的门冬胰岛素(Aspart)，纯化后的纯度为至少98% ；纯化的甘精胰岛素，纯化后的纯度为至少99% ； 纯化的赖脯胰岛素，纯化后的纯度为至少97% ；—种通过上述方法获得的多肽，其纯度为约 90%至约100% ；纯化的阿托西班，纯化后的纯度为至少99. 14% ；以及纯化的依替巴肽，纯化后的纯度为至少94%。
具体实施例方式本发明涉及一种用于从具有至少一种相关杂质的混合物中纯化多肽的色谱方法， 所述方法包括以下步骤采用RP-HPLC，其利用浓度为约0. 01%至约2%的离子对试剂连同浓度为约5%至约85%的有机改性剂。在本发明的一种实施方式中，最优选地，离子对试剂和有机改性剂的浓度分别为约0. 05%至约以及约8%至约65%。在本发明的另一种实施方式中，离子对试剂选自由己烷磺酸、三氟乙酸、五氟丙酸、三乙胺和七氟丁酸组成的组。在本发明的又一种实施方式中，有机改性剂选自包括乙腈、乙醇、甲醇和异丙醇的组。在本发明的又一种实施方式中，多肽选自包括胰岛素类似物、依替巴肽和阿托西班的组。在本发明的又一种实施方式中，胰岛素类似物是门冬胰岛素、赖脯胰岛素和甘精胰岛素。本发明还涉及一种用于从具有至少一种相关杂质的混合物中纯化多肽的色谱方法，所述方法包括以下步骤a)用基于二氧化硅(C4-C18)的树脂填充RP-HPLC柱，用约5% 至约85%的有机改性剂进行平衡，b)以约180cm/h至约360cm/h的流速将该多肽混合物装载到柱上，c)用浓度为约0. 05%至约的离子对试剂连同浓度为约5%至约85%的有机改性剂洗涤该柱，以及d)实施约10%至约70%的线性梯度，以从该柱洗脱该纯化的多肽。在本发明的一种实施方式中，二氧化硅树脂优选为C8。在本发明的另一种实施方式中，色谱纯化在约2. 5至约8. 5的pH下进行。在本发明的又一种实施方式中，树脂具有约5 μ至约40 μ的颗粒大小(粒径， particle size)，优选为约7 μ至约20 μ，以及最优选为约10 μ至约13 μ。在本发明的又一种实施方式中，树脂珠具有约50Α至约2000Α的孔径大小(孔径，pore size)，优选为约IOOA至约500A，以及最优选为120A。在本发明的又一种实施方式中，多肽的纯度为约90%至约100%，优选至少99%。本发明进一步涉及一种通过上述方法获得的胰岛素类似物，其纯度为约90%至约 100%。本发明还涉及纯化的门冬胰岛素，其纯化后的纯度为至少98%。本发明还涉及纯化的甘精胰岛素，其纯化后的纯度为至少99%。本发明还涉及纯化的赖脯胰岛素，其纯化后的纯度为至少97%。本发明还涉及通过上述方法获得的纯化的多肽，其纯度为约90%至约100%。本发明还涉及纯化的阿托西班，其纯化后的纯度为至少99. 14%。本发明还涉及纯化的依替巴肽，其纯化后的纯度为至少94%。本发明涉及离子对试剂如三乙胺、三氟乙酸、己烷磺酸、五氟丙酸等在多肽的 RP-HPLC制备线性色谱中的应用。更具体地，本发明涉及离子对试剂通过胰岛素类似物和肽的反相制备线性色谱中的应用。本发明的另一个目的和优点是，即使在增加蛋白质装载之后，也增大所期望的蛋白质的纯度。术语的定义:除非本文中另有定义，本发明中所使用的科学和技术术语应具有由本领域技术人员通常理解的意义。而且，除非上下文另有要求，单单数术语包括复数含义以及复数术语包括单数含义。本发明的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法来实施。术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”是指氨基酸的聚合物并且不指产物的具体长度；因而，肽、寡肽、以及蛋白质包含在多肽的定义内。这个术语同样也不指或排除多肽的表达后修饰，虽然这些多肽的化学或表达后修饰可以作为具体实施方式
而被包括或排除。因此， 例如，术语多肽明确涵盖对多肽的修饰，其包括糖基、乙酰基、磷酸基、脂质基团等的共价连接。而且，具有这些修饰的多肽可以作为个别物质被指定包括在本发明中或从本发明排除。 在一种实施方式中，分子是多肽或它们的相关类似物或其衍生物。根据优选的实施方式，多肽选自胰岛素类似物如门冬胰岛素(aspart)、赖脯胰岛素和甘精胰岛素。优选地，多肽是环肽(cyclic peptide) 0根据另一种优选实施方式，多肽是非环肽(non-cyclic peptide) 0 在又一种优选实施方式中，多肽选自包括依替巴肽和阿托西班的组。术语“胰岛素类似物”用来涵盖任何形式的如上所述的“胰岛素”，其中多肽链内的一个或多个氨基酸已被可替换的氨基酸替代和/或其中一个或多个氨基酸已被缺失或其中一个或多个另外的氨基酸已被插入该多肽链。胰岛素类似物选自由门冬胰岛素、赖脯胰岛素和甘精胰岛素组成的组。
门冬胰岛素(Insulin Aspart)是一种人类似物，其是一种快速起效的、胃肠外血糖降低剂。门冬胰岛素和常规人胰岛素是同源的(除了在位置似8处氨基酸脯氨酸被天冬氨酸的单一替代以外)，并且通过重组DNA技术生产。甘精胰岛素(Insulin Glargine)和人胰岛素的不同在于，在胰岛素A-链上的位置21处的氨基酸天冬酰胺被甘氨酸替代以及两个精氨酸被插入到B链的C端。甘精胰岛素也是一种人胰岛素类似物，其是一种快速起效的、胃肠外血糖降低剂。赖脯胰岛素(Insulin Lispro)是一种人胰岛素类似物，其是一种快速起效的、胃肠外血糖降低剂。化学上，它是Lys(B28)、ft~0(B29)人胰岛素类似物，是在胰岛素B-链上的位置28和四处的氨基酸被对调(反转，reverse)时产生的。阿托西班(Atosiban)- —种合成肽，是激素催产素(oxytocin)和加压素 (vasopression)的抑制剂。它是催产素受体拮抗剂，有效用于治疗早产的急性发作。它是子宫催产素受体处的催产素的竞争性拮抗剂并且已被开发作为治疗早产的新型保胎疗法。 阿托西班还称作ADH (抗利尿激素)。依替巴肽(Eptifibatide)-是一种糖蛋白Ilb/IIIa抑制剂类的抗血小板药。它是一种来源于在东南侏儒响尾蛇(the southeastern pygmy rattlesnake)的毒液中发现的蛋白质的环状七肽。它属于所谓的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸模拟物种类并且可逆地结合于血小板。术语“色谱法(层析，chromatography) ”是指这样的方法，借助这种方法，由于在流动相的影响下，混合物的个别溶质迁移通过固定相的速率的差异，或在结合和洗脱过程中的差异，混合物中的感兴趣的分析物与混合物中的其它溶质分离开。如在本文中所使用的，术语“高效液相色谱法”是指这样的色谱程序，其中在柱填充中使用的颗粒(固定相)较小(在3和50微米之间)并且与所选尺寸几乎没有变化。这样的色谱法通常采用相对较高(约500_3500psi)的压力。术语“杂质”是指不与所感兴趣的蛋白质共享相同特性的任何产物。杂质主要是产物相关的。通过利用离子对试剂，在门冬胰岛素粗品中已被靶向的杂质是Des前
des B11 !!^! ) ! '^ (Des leader des B arginine Insulin Aspart precursor)。这通过在B链的C端处延伸5个氨基酸而不同于门冬胰岛素，该5个氨基酸是Arg-Asp-Ala-Asp-Asp，其显示，在酸性pH下，相对于门冬胰岛素，它具有额外的正电荷。“离子对试剂”通常是离子化合物，其与带相反电荷的离子形成离子对。通常，在 RP-HPLC中使用的离子对试剂包含烃链，其赋予一定的疏水性，以致该离子对试剂可以被保持在反相柱上。能够与蛋白质形成离子对的典型离子对试剂可以用于本发明，其可以包括三氟乙酸(TFA)、己烷磺酸(HSA)、五氟丙酸(PFPA)、三乙胺(TEA)、七氟丁酸(HFBA)等。具体地，本发明涉及HSA和TEA在RP-HPLC制备线性色谱中的应用，如在优选实施方式中举例说明的。HSA具有由6C长烃链与磺酸(SO3-)官能团构成的结构。在酸性pH 下，尤其是低于肽/蛋白质的Pl值下，存在于蛋白质结构的表面上的碱性氨基酸如赖氨酸、 精氨酸和组氨酸的所有功能性氨基由于质子化而带正电荷。由于在0原子上的高电子密度 (这归因于由6-C长烃侧链所显示的诱导效应)，所以即使在低pH下，HSA的S03_基团也以离子形式存在。SO3-基团将特定地靶向蛋白质结构上的带正电荷的基团。在HSA和肽之间的这种相互作用将导致蛋白质3D结构中细微的和可逆的构象变化。在在RP色谱法中，有时将导致一些杂质的选择性的变化。HSA在分析性RP色谱法中改善蛋白质峰的分辨率是众所周知的。而在本发明中，已观测到，HSA在制备性色谱法中也有助于改善产率和纯度水平。作为一种众所周知的离子对试剂，三乙胺(TEA)洗脱以紧密带形式的蛋白质，并且这种性能目前用于更高装载(制备性装载)以改善RP色谱法的产率和纯度。“有机改性剂”是RP色谱法中使用的非极性溶剂，其在较低浓度下有助于分析物分子结合于固定相，而在较高浓度下则洗脱分析物分子。各种有机改性剂用于本发明，如乙
腈、异丙醇、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺等。“Desocta(脱八)”是产物相关的杂质，其在所述方法的胰蛋白酶消化步骤中产生。它的特征在于相对于胰岛素和其相似物的B链的C端，缺少8个氨基酸。0. 85RRT、0. 9RRT、1. 05RRT和1. 07RRT是产物相关的杂质，它们是在反应期间产生的中间体，一些是在所述方法期间产生的，这些杂质是由于在阿托西班的制备过程中涉及多个反应步骤而形成的。0. 86RRTU. 22RRTU. 8RRT和2. IRRT是由于在依替巴肽的制备过程中涉及多个反应步骤而形成的杂质。它们通常是反应中间体并且一些是在所述方法期间产生的。能够存在具有受保护的基团(以防止它们转化成产物)的中间体。本发明涉及离子对试剂的应用，用于获得在90% -100%范围的基本纯的胰岛素类似物和肽。胰岛素类似物可以选自由门冬胰岛素、赖脯胰岛素和甘精胰岛素组成的组。蛋白质或肽是阿托西班和依替巴肽。本发明的一个目的是使用至少0.05%至(w/v)的离子对试剂，其中所述方法基于RP-HPLC。最优选地，离子对试剂以0.05%-1% (w/v)使用。在宽泛的方面，本发明涉及离子配对的应用，用来纯化感兴趣的蛋白质，包括以下步骤进行平衡以保持固定相准备好结合至感兴趣的分析物，接着进行装载，其中使包含分析物的粗产物或不纯物质通过固定相。以约180-360cm/h的流速加载样品。对于待纯化的样品肽，所使用的梯度发生变化。本文中的方法的第一步骤涉及通过将混合物装载在反相液相色谱柱上，从包含分子的混合物纯化该分子。优选地，柱用粒径为约5-40 μ，更优选约10-40 μ，以及最优选约 10-13 μ的介质填充。优选地，柱具有约100-2000埃，更优选约100-500埃的孔径大小。在本发明的上下文中，填充在柱中的树脂的孔径大小为120埃。接着进行洗涤以除去未结合的分子，从固定相洗脱结合的分析物，然后进行再生以除去在给定洗脱条件下未洗脱的任何紧密结合的分子。使用5% -65%的各种有机改性剂来进行平衡和洗涤，如乙腈、异丙醇、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺等。纯化在2. 5-8. 5的ρΗ 下进行。柱的介质可以是任何适宜的材料，包括基于聚合物的树脂介质、基于二氧化硅的介质、或甲基丙烯酸酯介质。本发明的一个方面在于，离子对试剂在RP-HPLC制备线性色谱中的应用，用于获得基本上纯的蛋白质和肽。能够和蛋白质形成离子对的典型离子对试剂可以用于本发明， 其可以包括三氟乙酸(TFA)、己烷磺酸(HSA)、五氟丙酸(PFPA)、三乙胺(TEA)、七氟丁酸(HFBA)、七氟丁酸(HFBA)等。 具体地，本发明涉及HSA和TEA在RP制备线性色谱中的应用，如在优选实施方式中举例说明的。HSA具有由6C长烃链和磺酸(SO3-)官能团构成的结构。在酸性PH下，尤其是在低于肽/蛋白质的Pl值下，存在于蛋白质结构的表面上的碱性氨基酸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸的所有功能性氨基由于质子化而带正电荷。SO3-基团将特异性地靶向在蛋白质结构上的带正电荷的基团。当HSA与表面电荷相互作用时，HSA的己基将暴露在蛋白质的表面上，这将增大它的疏水性。HSA与不同肽的相互作用的程度将导致它们的选择性变化。 HSA在分析性RP色谱法中可以改善蛋白质峰的分辨率是众所周知的。而在本发明中，已观测到，HSA在制备色谱法中也有助于改善产率和纯度水平。三乙胺(TEA)也以与HSA类似的方式起作用。TEA与在蛋白质表面上的带负电荷部分离子配对并增大蛋白质的疏水性。本发明的另一个目的涉及离子对试剂的应用，这有助于改变杂质的选择性，其中的杂质与感兴趣的蛋白质非常密切相关并且是纯化中的主要关注点。杂质主要是产物相关的。通过使用离子对试剂，在门冬胰岛素粗产物中已被靶向的杂质是Des前导序列des B精氨酸门冬胰岛素前体。这与门冬胰岛素的不同在于，在B链的C端具有5个氨基酸的延伸，该5个氨基酸是Arg-Asp-Ala-Asp-Asp，其显示，在酸性pH 下，相对于门冬胰岛素(其将是HSA的靶标)，它具有额外的正电荷。在甘精胰岛素中，HSA 有助于分离甘精胰岛素前体，因为相对于甘精胰岛素，该前体具有额外的正电荷。本发明的又一个方面是，即使在增大蛋白质装载之后，所期望的蛋白质增加的纯度。本发明的有效实施需要待使用的色谱基质、用于有效纯化的缓冲液的pH值和离子强度的正确组合的个别化(individuation)。缓冲体系的pH影响分离以及化合物的疏水性。归因于在色谱分离的不同步骤期间的PH的变化会影响化合物在柱中的迁移性。本发明的具体实施方式
的前述描述提供用于举例说明和描述的目的。它们不是用来穷举的或将本发明限于所披露的精确形式。鉴于以上教导，各种改进和变化是可能的。另夕卜，可以进行许多改进以使特定情形、材料、物质的组成、方法、过程步骤或多个步骤适于本发明的目的、精神和范围。所有这样的改进包括在所附权利要求的范围内。借助于以下实施例来进一步详细描述本申请的技术。然而，这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。以下实施例用来进一步举例说明本发明的实施方式，但并不用来限制本发明的范围。虽然它们是可能使用的那些的典型，但可以可替换地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法、或技术。通过参考以下具体实施例可以获得更充分的理解，这些实施例仅用来举例说明而不是用来限制本发明的范围。实施例对照1用纯化水将纯度 75% (约75% )的粗门冬胰岛素材料稀释10倍，并添加IPA至 5%的最终浓度。在Kromasil ( 100 A "13 μ _C8)柱上纯化粗混合物。流动相A是250mM乙酸钠，pH 4. 0并且流动相B是异丙醇。经20柱容积，在流动相A中，进行15%至18%的流动相B的梯度洗脱。观测到desocta(脱八)门冬胰岛素的分离，但未实现des前导序列 desB-精氨酸门冬胰岛素前体分离。总体纯度达到 90%。实施例1用纯化水将纯度 75%的粗门冬胰岛素材料稀释10倍，然后添加IPA至5%的最终浓度。在Kromasil ( 100 A"13y-C8)柱上纯化粗混合物。流动相A是在250mM乙酸钠中的己烷磺酸(HSA) (w/v),pH 4. 0并且流动相B是异丙醇。经20柱容积，在流动相 A中，进行18% -22%的流动相B的梯度洗脱。HSA的添加有效地除去desocta(脱八)门冬胰岛素并且还观测到des前导序列desB-精氨酸门冬胰岛素前体从 2. 77%的水平降低到低于0. 27%，并且达到的总体纯度为 97. 85%。对照2用纯化水将纯度 75%的粗制门冬胰岛素材料稀释10倍，然后添加乙醇至10% 的最终浓度。在KromaSilTM( 100 A "13 μ _C8)柱上纯化粗混合物。流动相A是在250mM 乙酸钠中的25mM硫酸铵，pH 4. 0并且流动相B是乙醇。经20柱容积，在流动相A中，进行 26% -32%的流动相B的梯度洗脱。des前导序列desB-精氨酸门冬胰岛素前体从 2%的水平降低至1%。完全除去了 desocta(脱八)门冬胰岛素杂质，并且单糖基化门冬胰岛素从 3%降低至1. 3%。达到的总体纯度为 94%。实施例2用纯化水将纯度 75%的粗门冬胰岛素材料稀释10倍，然后添加乙醇至10%的最终浓度。在Kromasil ( 100 A "13 μ _C8)柱上纯化粗混合物。流动相A是在25mM硫酸铵中的在250mM乙酸钠中的1 %己烷磺酸(HSA) (w/v)，pH 4. 0并且流动相B是乙醇。经20 柱容积，在流动相A中，进行25 % -35 %的流动相B的梯度洗脱。HSA的添加使des前导序列 desB-精氨酸门冬胰岛素前体从 3%的水平降低至小于0. 3%。完全除去了 desocta(脱八)胰岛素门冬胰岛素并且单糖基化门冬胰岛素水平从 2%降低到0.3%。达到的总体纯度为 98%。对照3用纯化水将纯度 67%的粗制门冬胰岛素材料稀释10倍，然后添加甲醇至10% 的最终浓度。在KromaSilTM(100 A_13y-C8)柱上纯化粗混合物。流动相A是在250mM 乙酸铵中的25mM硫酸铵，pH 4. 0并且流动相B是甲醇。经20柱容积，在流动相A中，进行 45% -55%的流动相B的梯度洗脱。des前导序列desB-精氨酸门冬胰岛素前体从 2% 的水平降低至小于1%。单糖基化门冬胰岛素杂质没有显示任何显著减少。从2%降低至 1.5%。desocta(脱八)门冬胰岛素从 10%降低至小于 2%。达到的总体纯度为 89%。实施例3用纯化水将纯度 67%的粗制门冬胰岛素材料稀释10倍，然后添加甲醇至10% 的最终浓度。在Kromasil ( 100 A "13 μ _C8)柱上纯化粗混合物。流动相A是在25mM硫酸铵中的在250mM乙酸铵中的己烷磺酸(HSA) (w/v),pH 4. 0并且流动相B是甲醇。经 20柱容积，在流动相A中，进行55% -65%的流动相B的梯度洗脱。HSA的添加将des前导序列desB-精氨酸门冬胰岛素前体从 2%的水平纯化至小于1%。单糖基化门冬胰岛素杂质从3%降低至小于0.5%。desocta (脱八)门冬胰岛素从 10 %降低至小于 2 %。 达到的总体纯度为 92%。实施例4用纯化水将纯度 67%的粗门冬胰岛素材料稀释10倍，然后添加甲醇至10%的最终浓度。在Kromasil ( 100 A "13 μ _C8)柱上纯化粗混合物。流动相A是在25mM硫酸铵中的在250mM乙酸铵中的己烷磺酸(HSA) (w/v)，pH 4. 0并且流动相B是甲醇。经5 柱容积，在流动相A中，进行20 % -50 %的流动相B的梯度洗脱，接着是经20柱容积，在流动相A中，进行55% -65%的流动相B的梯度洗脱。HSA的添加将des前导序列desB-精氨酸门冬胰岛素前体从 2%的水平纯化至小于1 %，以及单糖基化杂质从 3%降低至0. 6%。 desocta(脱八)门冬胰岛素从 10%降低至小于 2%。达到的总体纯度为 92%。实施例5用纯化水将纯度 67%的粗门冬胰岛素材料稀释10倍，然后添加甲醇至10%的最终浓度。在KromaSilTM(100 A_13y-C8)柱上纯化粗混合物。流动相A是在25mM硫酸铵的在250mM乙酸铵中的己烷磺酸(HSA) (w/v)，pH 3.5并且流动相是甲醇。经20柱容积，在流动相A中，进行55% -60%的流动相B的梯度洗脱。HSA的添加将单糖基化门冬胰岛素从 3%的水平纯化至小于0.4%。desocta(脱八)门冬胰岛素从 10%降低至小于 1%。达到的总体纯度为 90%。对照6用纯化水将纯度 94%的部分纯化的甘精胰岛素材料稀释3倍，然后添加甲醇至 10%的最终浓度。在Kromasil ( 100 A "13 μ _C8)柱上纯化粗混合物。流动相A是IOOmM 硫酸铵，PH 4.0并且流动相B是甲醇。经20柱容积，在流动相A中，进行51 % -59 %的流动相B的梯度洗脱。甘精胰岛素前体水平从 2. 0%降低至1. 2%并且DesB32-R甘精胰岛素未降低。达到的总体纯度为 97.5%。实施例6用纯化水将纯度 94%的部分纯化的甘精胰岛素材料稀释3倍，然后添加甲醇至10%的最终浓度。在KromaSilTM(100 A-13y-C8)柱上纯化粗混合物。流动相A是在 IOOmM硫酸铵中的0. 5%己烷磺酸(HSA) (w/v)，pH 4.0并且流动相B是甲醇。经20柱容积，在流动相A中，进行51% -59%的流动相B的梯度洗脱。HSA的添加将甘精胰岛素前体从 2. 5%的水平纯化至小于0. 8%并且DesB32-R从0. 7%降低至小于0. 2%。达到的总体纯度为 99. 2%。实施例7用纯化水将纯度 77%的部分纯化的赖脯胰岛素(赖脯人胰岛素)材料稀释3 倍，然后添加乙腈至10%的最终浓度。在KrOmaSilTM(100 A-13y-C8)柱上纯化粗混合物。流动相A是在20mM氯化镁和IOOmM Tris中的三乙胺(TEA) (ν/ν)，pH 8. 5并且流动相B是乙腈。经25柱容积，在流动相A中，进行M % -30 %的流动相B的梯度洗脱。TEA 的添加将des前导序列desB-精氨酸赖脯胰岛素前体水平从15%纯化至小于1%。达到的总体纯度为 97. 5%。对照8在一个纯化步骤之后的阿托西班粗产物的纯度为 95%。第一步骤的洗脱池以获得5%的最终溶剂浓度的方式稀释。然后在DaiSO(120A-10y -C8)柱上纯化加载(load)。 流动相A是50mM乙酸并且流动相B是乙腈。经15柱容积，在流动相A中，进行9%至12% 的流动相B的梯度洗脱，接着经10柱容积，在流动相A中，进行12%至17%的流动相B的梯度洗脱。达到的纯度为 96%，这显示仅完全除去1.05RRT杂质。0. 85RRT和0. 9RRT杂质没有显示出任何减少。实施例8在一个纯化步骤之后的阿托西班粗产物的纯度为 95%。第一步骤的洗脱池以获得5%的最终溶剂浓度的方式稀释。然后在Daiso (120A-IOy-C8)柱上纯化加载。流动相A是在50mM乙酸中的0. 05%己烷磺酸(HSA) (w/v)并且流动相B是乙腈。经25柱容积，在流动相A中，进行10%至17%的流动相B的梯度洗脱。HSA的添加有助于增加纯度至 98. 6%，这显示 0. 85RRT、0. 90RRTU. 05RRT 和 1. 07RRT 杂质的完全除去。对照9在一个纯化步骤之后的阿托西班粗产物的纯度为 95%。第一步骤的洗脱池以获得5%的最终溶剂浓度的方式稀释。然后在Daiso (120A-IOy-C8)柱上纯化加载。流动相A是PH为8. 0的50mM磷酸盐缓冲液并且流动相B是乙腈。经25柱容积，在流动相A中， 进行18%至M %的流动相B的梯度洗脱。达到的纯度为98. 5%。0.97RRT从 1.7%降低至 0. 6%。0. 95RRT杂质未被除去，1. 05RRT和1. 07RRT杂质从 0. 8%降低至 0. 3%。实施例9在一个纯化步骤之后的阿托西班粗产物的纯度为 95%。第一步骤的洗脱池以获得5%的最终溶剂浓度的方式稀释。然后在DaiSO(:120A-10y-C8)柱上纯化加载。流动相A是在50mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)中的0.2%三乙胺(TEA) (ν/ν)并且流动相B是乙腈。 经25柱容积，在流动相A中，进行20%至M %的流动相B的梯度洗脱。TEA的添加有助于增加纯度至99. 14%，这显示0. 95RRT、0. 97RRT杂质的完全除去以及1. 05RRT和1. 07RRT杂质减少50%。实施例10粗依替巴肽的纯度为 58%。通过将该粗产物溶解在50mM乙酸和5%乙腈中来制备加载。然后在DaiSO(120A-10y-C8)柱上纯化加载。流动相A是0. 三氟乙酸(TFA) (ν/ν)并且流动相B是乙腈。经25柱容积，在流动相A中，进行8%至14%的流动相B的梯度洗脱。TFA的添加有助于增加纯度至94%，这显示0. 86RRTU. 22RRTU. 8RRT和2. IRRT 杂质的完全除去。已披露了本发明的优选实施方式。然而，本领域技术人员将明了，在本发明的教导的范围内可以发生某些改进。因此，应当考虑所附权利要求以确定本发明的真正范围和内容。
权利要求
1.一种用于从具有至少一种相关杂质的混合物中纯化多肽的色谱方法，所述方法包括以下步骤采用RP-HPLC，所述RP-HPLC利用浓度为约0. 01 %至约2%的离子对试剂连同浓度为约5%至约85%的有机改性剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，最优选地，所述离子对试剂和所述有机改性剂的浓度分别为约0. 05%至约和约8%至约65%。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离子对试剂选自由己烷磺酸、三氟乙酸、五氟丙酸、三乙胺和七氟丁酸组成的组。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有机改性剂选自包括乙腈、乙醇、甲醇和异丙醇的组。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多肽选自包括胰岛素类似物、依替巴肽和阿托西班的组。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述胰岛素类似物是门冬胰岛素、赖脯胰岛素和甘精胰岛素。
7.一种用于从具有至少一种相关杂质的混合物中纯化多肽的色谱方法，所述方法包括以下步骤a)用基于二氧化硅(C4-C18)的树脂填充RP-HPLC柱，并用约5%至约85%的有机改性剂进行平衡；b)以约180cm/h至约360cm/h的流速将所述多肽混合物装载到所述柱上；c)用浓度为约0.05%至约的离子对试剂连同浓度为约5%至约85%的所述有机改性剂洗涤所述柱；以及d)实施约10%至约70%的线性梯度，以从所述柱洗脱所述纯化的多肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述二氧化硅树脂优选为C8。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述色谱纯化在约2.5至约8. 5的pH下进行。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述树脂具有约5μ至约40μ的颗粒大小，优选为约7 μ至约20 μ，以及最优选为约10 μ至约13 μ。
11.根据权利要求7所述的方法，其中，所述树脂珠具有约50Α至约2000Α的孔径大小，优选为约100Α至约500Α，以及最优选为120Α。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述多肽的纯度为约90%至约 100%，优选为至少99%。
13.通过权利要求1至12中任一项所述的方法获得的一种胰岛素类似物，纯度为约 90% 至约 100%。
14.纯化的门冬胰岛素，纯化后的纯度为至少98%。
15.纯化的甘精胰岛素，纯化后的纯度为至少99%。
16.纯化的赖脯胰岛素，纯化后的纯度为至少97%。
17.通过权利要求1至12任一项所述的方法获得的一种多肽，纯度为约90%至约 100%。
18.纯化的阿托西班，纯化后的纯度为至少99.14%。
19.纯化的依替巴肽，纯化后的纯度为至少94%。
全文摘要
本发明说明了离子对试剂在制备级纯化中的效用。更具体地，本发明涉及离子对试剂在RP制备线性色谱中的应用，使得能够获得所期望的最终产物的高纯度。本发明显示了离子对试剂对所期望的多肽纯度具有显著影响。
文档编号C07K14/62GK102471368SQ201080035701
公开日2012年5月23日 申请日期2010年8月9日 优先权日2009年8月11日
发明者克里萨纳·海坦亚·古拉, 哈里什·耶尔, 尼特斯·戴夫, 苏恩达雷什·尚卡尔 申请人:拜康有限公司