专利名称：通过对随机序列聚合物的组合物基于血清蛋白的检测，改进含随机序列聚合物的组合物 ...的制作方法
通过对随机序列聚合物的组合物基于血清蛋白的检测，改进含随机序列聚合物的组合物的设计、生物利用度和效能
的方法
相关申请本申请要求2009年11月17日递交的美国临时申请No. 61/281，470和2010年9月27日递交的美国临时申请No. 61/386,909的优先权益。
背景技术：
现有技术中已有检测简单多肽的方法。然而，由于受检多肽的异质性，检测一组多肽混合物而非具有明确氨基酸序列的一种多肽的有效血浆浓度方法很复杂。例如，含随机序列聚合物(RSP)的组合物包括随机掺入多肽链的氨基酸的复杂混合物。RSP组合物由氨 基酸的特性和比例而不是特定序列决定。鉴于多肽的多样性，需要对多种制造方法制备的这些RSP组合物的均一性和组成进行评估的改进方法。确定RSP组合物在体内的状态具有重要的免疫学意义，因为取决于给药途径和/或给药频率及血清蛋白与RSP组合物的结合，这种肽混合物可能激发初级炎症反应(THl型)或初级调控反应(TH2型)，导致其在受试对象中的药代动力学和药效学改变。更加严谨的设计和坚持给予RSP组合物可能提高治疗效果或者减少潜在的不良炎症应答反应。因此，为了治疗目的，需要定量分析RSP组合物的方法，例如有助于评估这种肽混合物在体内的状况和确定合适的剂量及给药方式。
发明概述本申请提供检测和评价RSP组合物的改进的方法。本发明提供检测和定量分析RSP组合物的方法。本发明提供基于肽亚组与特定捕获多肽相互作用的测定，和富集RSP组合物中多肽亚组亚组的方法。本发明进一步提供对需要接受治疗的患者给予RSP组合物的方法，其中可根据上述检测和定量方法来确定或评估给药方案和剂量。本申请还提供检测RSP组合物的方法，包括以下步骤(a)将所述RSP组合物附着于固相支持物上；(b)使(a)所述固相支持物与含蛋白质生物液体接触；(c)鉴定特异性结合于(a)所述固相支持物的(b)所述的蛋白质；(d)获得基本纯的(C)所述结合蛋白产物；(e)将(c)所述蛋白质附着于定量检测所述RSP组合物用的工具上；和(f)测定所述RSP组合物与(e)所述蛋白每一种的结合。本说明书也提供一种改进RSP组合物设计的方法，包括以下步骤(a)将所述RSP组合物附着于固相支持物上；(b)使(a)所述固相支持物与含蛋白的生物液体接触；(c)鉴定特异性结合于(a)所述固相支持物的(b)所述的蛋白质；(d)获得基本纯的(C)所述的结合蛋白产物；(e)使(C)所述蛋白质附着于定量检测RSP组合物用的工具上；(f)测定所述RSP组合物与(e)所述蛋白质结合的每一种肽；(g)调整所述RSP组合物的设计以增加或减少与(e)所述一种或多种蛋白质的结合；(h)重复步骤(f) ；(i)任选地重复步骤(f_h)，其中调整所述RSP组合物的设计可导致一种或多种效果提高生物利用度、减少毒性和提高效能。
此外，本申请提供一种检测RSP组合物中肽种类的方法，包括以下步骤(a)将所述RSP组合物附着于固相支持物上；(b)使(a)所述固相支持物与含蛋白的生物液体接触；
(C)鉴定特异性结合于(a)所述固相支持物的(b)所述的蛋白质；(d)获得基本纯的(C)所述结合蛋白制品；(e)使(C)所述蛋白质附着于固相支持物上；(f)使(e)所述固相支持物与所述RSP组合物接触；(g)测定所述RSP组合物中每种肽与(f)所述固相支持物的结合。另外，本申请提供一种改进RSP组合物中肽种类设计的方法，包括以下步骤(a)使所述RSP组合物附着于固相支持物上；(b)使(a)所述固相支持物与含蛋白的生物液体接触；(C)鉴定特异性结合于(a)所述固相支持物的(b)所述蛋白质；(d)获得基本纯的(C)所述结合蛋白制品；(e)使(C)所述蛋白质附着于固相支持物上；(f)使(e)所述固相支持物与所述RSP组合物接触；(g)测定所述RSP组合物中与(f)所述固相支持物结合的每一种肽；(h)调整所述RSP组合物的设计以增加或减少与(f)所述一种或多种蛋白质的结合；(i)重复步骤(g) ；(j)任选地重复步骤(g_j)，其中调整所述RSP组合物肽种类的设计可导致一种或多种效果提高生物利用度、减少毒性，和提高效能。 通过应用本申请所述方法，研究者不仅可以更可靠地检测RSP组合物中的低含量组分，而且可以特异性地检测RSP组合物中与生物活性如毒性或效力有关或对其有贡献的肽种类。本发明的基础是，发现RSP组合物中的一种肽或多种肽可与某些具有蛋白质性质的物质特异性结合。相反，一旦鉴定到本说明书称为“捕获多肽”的蛋白质，即可利用一种或多种这类捕获多肽定量分析RSP组合物中所含的肽，并分离RSP组合物中功能更优良的肽亚组，或者根据结合特异性给RSP组合物中的各组分分类。为了实施本发明，鉴定到能与(RSP组合物所含)肽结合的捕获多肽后，即可将其制备成可用于实施本发明的形式，SP对其进行分离和纯化，纯度达到足以结合(RSP组合物所含)肽而不受到存在的其他组分干扰。本发明的一个方面提供了一种评价或测定RSP组合物不同制造的制剂、用不同方法制造的、或不同的制造后加工的产品的差异的方法。本发明的具体方法是，比较不同的RSP组合物制品与捕获多肽的结合来确定各制品之间的相似性和/或差异。本发明的另一方面提供一种定量分析RSP组合物或含RSP组合物的样品中所含肽的方法。本发明的一些实施方式是检测给予RSP组合物后其在体内的生物可利用含量或浓度(如血浆浓度)的方法。本发明的方法是检测受试对象组织中存在的RSP组合物，所述受试对象先前曾接触过RSP组合物或用其治疗过，在这种接触后立即、或在接触后至少大约10、20、30、或45分钟，或者 1、2、4、6、12、24、36 或 48 小时，或 3、4、5、6、7 或 10 天，或 2、3、4、6、8 或 12 周进行一次或多次所述方法的检测。本发明的一种具体方法是检测哺乳动物血清或血浆中存在的RSP组合物的各组分，所述哺乳动物在进行所述方法前曾在上述期间内用所述DSP组合物治疗过。在某些具体实施方案中，所述哺乳动物是人。在某些实施方案中，本发明方法包括通过使RSP与一种或多种预先确定的捕获多肽结合然后用例如免疫检测方法检测RSP组合物的存在，和任选地检测其含量。因此。本发明的一个方面包括选择或鉴定能与RSP组合物优先结合的血清蛋白。在某些实施方案中，鉴定一种或多种血清蛋白的方法包括使RSP组合物与包括血清的生物样品接触；如果样品中存在RSP组合物中的肽，则检测其与血清中一种或多种组分的结合；分离得到结合组分，鉴定一种或多种结合组分。在一些实施方式中，分离这种结合组分的方法是，使样品接触设计的能与RSP组合物所含肽结合的亲和柱、随后洗脱结合组分，然后鉴定结合组分。任何能与RSP组合物所含肽结合的血清结合蛋白可用于上述方法。合适的检测方法包括直接竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹法、免疫流式细胞检测法、放射免疫检测法(RIA)，或者任何其他能定量检测特异性抗原的免疫学检测方法。本发明的一个方面是一种检测生物样品中RSP组合物存在与否的方法，包括使生物样品与至少一种捕获多肽接触；检测捕获多肽与RSP组合物有无结合，其中存在这种结合表明在生物样品中存在RSP组合物中的肽组分。可进一步延伸用这种方法检测样品中RSP组合物的含量或浓度。本发明的另一个方面是测量RSP组合物在哺乳动物中的生物利用度方法，包括给予哺乳动物一定剂量的RSP组合物；取得对象的生物样品；使该生物样品与至少一种捕获多肽接触；进而检测该生物样品中RSP组合物的生物利用度或者生物可利用的程度。
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本发明的另一个方面是提供给予哺乳动物对象RSP组合物的方法，给药量取决于用上述检测方法或者本说明书描述的其他方法检测的该剂量的生物可利用部分。在某些实施方式中，本发明方法还包括对照样品，和进行药效学试验，通过比较样品与对照两者的检测结果，测定生理标志(例如激素、酶、血清蛋白、细胞因子、免疫调节剂，或者这些功能蛋白的效应物或调节剂)的变化，并确定能引起所需药效学参数变化的有效剂量。在某些实施方案中，观察对象报告的行为改变、自觉症状改变，例如疼痛或疾病症状的减轻或其他间接效应。在一些具体实施例中，所述哺乳动物是小鼠或大鼠等啮齿动物，其他的实施例中，所述对象是人。本发明这个方面的某些实施方案，提供确定给予需要的受试对象RSP组合物合适剂量的方法包括(a)给予受试对象一个剂量RSP组合物；(b)取得受试对象的生物样品；(c)使此生物样品与至少一种捕获多肽接触；(d)检测该生物样品中RSP组合物各组分的水平；(e)任选地用不同剂量重复步骤(a)至(d) ；(g)将所测得的水平与预先确定的生物样品中的RSP组合物合适水平作比较；其中所述合适剂量是导致生物样品中RSP组合物达到预定合适水平的剂量。本发明的某些实施方案提供预测RSP组合物所含的有生物利用价值组分的方法。这种方法包括使含RSP组合物的样品与RSP组合物给予和递送后预期可到达部位原位的预定捕获多肽接触，测定RSP组合物与该捕获多肽的结合。被大量RSP组合物结合，可表明较大比例的肽是与治疗和/或生理相关的肽，结合较紧密(对每种肽测定其解离常数)可能表示延长那些肽体内半衰期的保护作用。本发明的又一个方面提供根据从实验对象获得的数据预测拟给予治疗对象(如人)的RSP组合物的治疗有效量的方法。在某些实施方案中，该方法包括给予非人哺乳动物实验对象RSP组合物，测定该剂量的生物可利用部分(例如用本说明书所述的定量测定方法)，测定功能读出，根据从哺乳动物实验对象获得的数据和治疗对象与实验对象之间的相关比率，预测拟给予治疗对象的RSP组合物的治疗有效量。为了本发明的目的，“功能读出”可以是受试对象的表型或功能、受试对象细胞的表型或功能、或受试对象产生的一种或几种液体的组成。功能读出还可包括或者包括测量一种或几种生物合成或代谢产生的组分，如激素、酶、血清蛋白、细胞因子、趋化因子、生长因子、免疫调节剂，或所述功能读出的效应器或调节剂。在某些实施方式中，检测步骤可以各种有规律或无规律的时间间隔后重复进行，来测定给予RSP组合物后其生物利用度、代谢和/或清除的时间进程。在某些实施方案中，可用此方法测定一组RSP组合物的血浆半衰期。在又一个实施方案中，可用此方法测定RSP组合物中一种肽类的半 衰期。在具体实施方案中，实验对象是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。本发明另一个方面提供通过给予RSP组合物治疗患者的有效方法，包括通过合成肽(例如简单地接着合并每轮延伸产生的多个肽，或同时利用合并的氨基酸单体)制备RSP组合物，制备所述RSP组合物的药学上可接受的制剂，给予治疗对象所述RSP组合物，取得治疗对象的组织样品，测定所述组织样品中RSP组合物的含量和/或浓度，测定功能读出，将RSP组合物含量与功能读出相关联，及调整给予治疗对象的RSP组合物剂量以改善功能读出。本发明的另一个方面是治疗或预防治疗对象产生不希望有的免疫应答反应的方法，包括给予治疗对象合适剂量的RSP组合物，确定合适剂量可通过(i)给予治疗对象一个剂量的RSP组合物；(ii)取得治疗对象的生物样品；(iii)使该生物样品与至少一种捕获多肽接触；(iv)检测生物样品中该捕获多肽的水平；(V)任选地用不同剂量重复步骤(i)至(iv) ；(vi)将测得的水平与预定的生物样品中RSP组合物的合适水平作比较；其中合适剂量是导致生物样品中RSP组合物达到预定合适水平的剂量。在前述某些方面和实施方案中，捕获多肽是标记的多肽。在某些实施方案中，捕获多肽附着于固相支持物。在某些实施方案中，检测和/或分离包含捕获多肽的复合体和RSP组合物的一个或多个肽组分。在具体实施方案中，用对所述复合体而不是对捕获多肽或RSP组合物的肽组分具有特异性的抗体来检测和/或分离这种复合体。本发明另一个方面提供一种分离所选择的组成RSP组合物的肽亚组的方法。在特别的例子中，该亚组由氨基酸序列不同的一种或多种肽组成。在其他例子中，可根据结合特异性利用捕获多肽对RSP组合物所含组分分类。在某些实施方案中，分离含RSP组合物样品中肽的方法包括(a)使该样品与至少一种捕获多肽接触；(b)分离混合物中结合于捕获多肽的肽。在这样的实施方案中，捕获多肽附着于固相支持物上。在一些实施方式中，捕获多肽是表位示踪或标记的多肽。在一些实施方式中，该方法还包括分离与捕获多肽结合的肽，以分离得到这些肽。在具体实施方式
中，该方法还包括测定该分离肽的特性，例如合并的分离肽中的氨基酸组成和/或分离肽的氨基酸序列。在某些实施方案中，鉴定在受试对象中RSP组合物的生物可利用肽的方法包括(a)给予受试对象RSP组合物；(b)在执行步骤(a)后取得受试对象的生物样品；(c)鉴定该样品中结合于至少一种捕获多肽的肽。在某些实施方案中，鉴定能结合捕获多肽的肽亚组的方法包括按拟定方案制备RSP组合物，使所述RSP组合物与预先确定的捕获多肽(如适合作为体内靶标或运载体的多肽)接触，测定RSP组合物中的结合肽，鉴定能区别结合肽和未结合肽的特征，制备能反映一种或多种差别特征的改进的RSP组合物。本发明的另一个方面是改进含RSP组分的组合物制备工艺的方法。在某些实施方案中，根据鉴定结合捕获多肽的肽亚组的上述方法设计RSP组合物。在某些实施方案中，设计的RSP组合物其氨基酸组成和/或氨基酸序列接近于结合捕获多肽的肽亚组的氨基酸组成和/或氨基酸序列。在某些实施方案中，RSP组合物与参比RSP组合物相比效力增强，其中参比RSP组合物与接触捕获多肽的最初RSP组合物的效力相同或基本相同。在其他实施方式中，RSP组合物的毒性比参比RSP组合物低。在可替代的实施方案中，一种方法包括按拟定方案制备RSP组合物，配制含RSP的组合物，通过检测功能读出的水平或程度确定所述组合物中生物可利用的RSP组分的含量，将功能读出与标准值作比较，和调整拟定方案或组合物的配方以获得满意的生物利用度。本发明还有一个方面是通过将RSP组合物(例如参比RSP组合物或用本说明书所述方法产生的改进的RSP组合物)或RSP组合物的一个组分与受关注的治疗剂缔合而使该 药物靶向特定组织，其中所述RSP组合物或其组分与具有组织特异性靶向性能的捕获多肽结合，可将这种缔合药剂给予患者使所述药物靶向能与相应捕获多肽结合的组织。本发明这一方面的一些实施方式提供了将治疗剂转运到治疗对象特定组织的方法，该方法包括(a)使RSP组合物与组织特异性肽接触并分离混合物中结合于该组织特异性肽的肽，得到标记肽；(b)将标记肽与治疗剂偶联，(C)给予治疗对象该偶联物。本发明的其它实施方式包括通过上述方法的步骤(a)和(b)制备这种靶向治疗剂的方法，及用此方法制备的靶向治疗剂。本发明的又一个方面是上述方法之一中有用的组合物。本发明这一方面的一个实施方式是一种组合物，可用其检测生物样品中包含YEAK或YEAK肽的RSP组合物，这种组合物包含至少一种捕获多肽。在一些实施方式中，所述捕获多肽选自正常人血清、正常非人灵长类动物血清、正常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常猪血清、正常狗血清、正常马血清、正常绵羊血清、正常母牛血清中的一种组分，哺乳动物HDL蛋白质组的一种组分，哺乳动物LDL蛋白质组的一种组分，补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α -胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶酶，载脂蛋白A_IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(BLAST检索表明它是IgM重链)，载脂蛋白E，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，IgM的C链，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子ΙΙ(凝血酶)，IgK轻链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur,富含组氨酸的糖蛋白前体，a -2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体,抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号NO.CAA28659)，及IgJ-链。在上述任何一个实施方式和任何一个方面中，所述RSP组合物包括YEAK肽或YFAK肽。YEAK肽或YFAK肽是本领域已知的，下面对其进行描述，它们是RSP组合物所包含的肽，可称为YFAK RSP组合物或YEAK RSP组合物。另外，不依赖于选择YFAK或选择YEAK肽，在具体实施方式
中，捕获多肽可以是血清结合蛋白。在更具体的实施方式中，捕获多肽选自α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-I、α _1_Β_糖蛋白、载脂蛋白A_IV、载脂蛋白D和前白蛋白，或选自本段落前一段所枚举的捕获多肽，或选自本说明书公开的血清多肽。在上述任何一个实施方式中，RSP组合物所含肽可在生理上相关的其它组分存在下与捕获多肽(例如血清蛋白)进行结合。在具体实施方式
中，其它组分是脂质，如胆固醇或甘油三酯。在具体实施方式
中，其它组分是除捕获多肽外基本上没有蛋白成分的HDL或LDL复合物。
附图的简单描述图I是测定RSP组合物与血清结合蛋白(已结合于支持物上)结合所用的试验的示意图。在血清蛋白被鉴定后，将其结合于固相支持物。将RSP组合物(单独或包含于血清中)加到支持物上。加入抗RSP组合物(或抗RSP组合物与血清蛋白的偶联物)的第一抗体，再用第二抗体和检测试剂检测第一抗体与其靶标的结合。
图2显示当抗体结合于它们的靶标后，结合了抗YFAK和抗YEAK抗体的HRP组合物的A450比色吸光度。靶标包括含有与正常人血清中所含(或所加)血清蛋白结合的YFAK和YEAK肽的RSP组合物。在RSP组合物浓度较高时，用抗YFAK和抗YEAK抗体检测的偶合物高于较低浓度RSP组合物。在病人中，12. 5ng/mL对应于大约2mg剂量。图3显示能结合PI-2301或考帕松(Copaxone)的血清蛋白列表。血清蛋白的来源是正常小鼠血清或正常人血清(已标明)。PI-2301可以是乙酰化或非乙酰化的。用抗YFAK和抗YEAK抗体识别PI-2301或考帕松的结合复合体，并用第二抗体和检测试剂加以检测。洗脱该复合体中的血清蛋白并鉴定。根据检测试剂的A450吸光度给蛋白评分。与背景吸光度相比，70分对应的P值< O. 001，认为具有统计学显著意义。图4显示小鼠静脉内给予4mg/kg或皮下给予21mg/kg剂量的YEAK后血清中的YEAK,用比色法和偶联有HRP的抗-YEAK抗体检测YEAK与其结合于正常人血清所含血清蛋白的靶标YEAK肽结合后的A450吸光度。该图显示，给予GA(乙酸格拉默)片段后约15分钟,GA达到了血清最高浓度1800ng/mL。皮下给予Copaxone 的估计生物利用度为静脉给予Copaxone⑧的12%。给药后2小时仍可测到GA组分。图5显示给予小鼠YEAK后血清或血浆中对YEAK应答产生的可溶性因子紧急释放的示范例，此例中为CCL22，也称为MDC。如该图所示，皮下给予小鼠的YEAK剂量与观察到的最大CCL22血浆浓度之间存在线性相关。图6显示用LC-MS观察从固定于CNBr-S^h柱的YEAK片段洗脱所得血清蛋白的肽图像。用Mascot搜索引擎鉴定肽序列。简言之，将胰蛋白酶消化产生的YEAK片段偶联于溴化氰Sepharose (CNBr-Seph) 4b,与人或小鼠血清一起室温培育2小时。用0. IM甘氨酸-盐酸，PH 2. 8液洗脱结合于YEAK片段的血清蛋白，在50%甲醇/50mM碳酸氢铵中用胰蛋白酶消化，干燥后用液相色谱法(LC)分离，除去溶剂，电离后喷雾到质谱仪(MS)中，直视观察并用Mascot搜索引擎鉴定。图7显示用图I所示的本发明方法进行ELISA试验，其中，将YEAK加入到男性和女性正常人血清后合并男性和女性正常人血清。该试验显示检测血清YEAK浓度的线性范围在l-100ng/ml之间。用小鼠血清或用无关对照,如抗匙孔戚血兰蛋白(anti-Keyole LimpetHemocyanin, KLH)多克隆血清,不能重复该试验。图8 显示第 P53218 和 119142 批次 Copaxone (YEAK)分子量的 SE-HPLC 图形，二批的图形相似。图9显示用图I所示本发明方法检测图8中两批Copaxone⑧的结果。
图10显示，对图8和图9所用的两批Copaxone 作的生物试验，其中单核细胞系RAW264. 7细胞接触YEAK后以浓度依赖方式释放CCL22。
图11显示，用MALDI-T0F检测，长度明确不同的YEAK共聚体的实际平均分子量与理论平均分子量之间有严格的线性关系。将计算的理论值乘以共聚体的氨基酸长度，即
20、40、60和80乘以一个氨基酸加一个水分子的理论平均分子量。用Y、E、A和K各自的质量减去在氨基酸偶联过程中丢失的一个水分子的质量，计算出一个氨基酸的理论质量，这4个氨基酸的比例为1.0 : 1.5 : 4.5 : 3.6。图12显示固相合成制备的长度不同YEAK共聚体的氨基酸分析，按100个氨基酸标准化后的输出比例，以及对图8、9和10所示的两批Copaxone 进行的相同分析。用含20、40、60和80个氨基酸的YEAK共聚体产生标准曲线。为了比较，也用Copaxone产生标准曲线。图12显示YEAK共聚体的大小与基于竞争性ELISA的PK试验检测结果之间的关系。20-聚YEAK共聚体的抑制作用很小，但用80-聚YEAK共聚体产生的标准曲线与用Copaxone获得的曲线重叠。
图13显示ELISA试验结果,其中家兔多克隆血清的Ig组分与Copaxone 相互作用强烈，表明随着固相合成的YEAK共聚体长度增加，其识别能力也提高。图14显示用先前PCT公开文本W02009/075854(其内容纳入本说明书作参考的)所描述的PK方法与固相合成的YEAK共聚体所作的ELISA试验结果，证明YEAK共聚体的大小与用上述试验方法测得的结果之间相关。图15显示，单核细胞系RAW264. 7细胞与图12、13和14所示固相合成的大小不同的共聚体一起培育后，随着共聚体长度的增加，CCL22的产量也增加。图16显示，图8、9、10和12所用的两批Copaxone 与图12、13、14和15所用的固相合成的长度不同的YEAK共聚体,能在体内诱导用2. 5mg/kg Copaxone⑧每周一次X 3周免疫的小鼠的脾细胞增殖。最后一次皮下给予后，收集脾脏，制备细胞悬液，将脾细胞与不同浓度的不同共聚体一起培养4天。用本领域熟知的方法通过测定氘化胸腺嘧啶的掺入检测脾细胞增殖。
发明详述
含随机序列聚合物的组合物为描述本发明目的的含随机序列聚合物(RSP)的组合物，可以是一种以不同比例包含两个或多个随机顺序氨基酸残基的氨基酸聚合物(典型地为通过肽键相连)的任意混合物，当给予哺乳动物时可用于激发或减弱某些免疫反应或其他反应。因为序列混和的随机多样性,该混合物中存在大量肽序列。肽序列的这种多样性可赋予比多样性差的组合物更闻的效能。RSP组合物的定义包括一组聚合物的氨基酸序列和这些氨基酸的摩尔比。例如，以YFAK命名的RSP组合物含有酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)和赖氨酸(K)，但不表示该聚合物的氨基酸顺序就是Y-F-A-K，这些氨基酸残基是随机掺入序列中的，因此，该RSP组合物包含具有各种顺序Y、F、A、K的肽，并且没有或基本上没有其它氨基酸。相对摩尔比的表示有两种方式输入摩尔比和输出摩尔比。“输入摩尔比”指合成RSP所用氨基酸的摩尔比。例如，如果所述RSP的Y F A K输入摩尔比为I : I : 10 : 6，那么用固体相合成法合成时，对于每轮循环延伸，将受保护的Y、F、A和K氨基酸以摩尔比I : I : 10 : 6混和的混合物通过反应延伸肽链。另一方面，“输出摩尔比”指产物RSP肽中所见氨基酸的摩尔比。通过分析RSP组合物的氨基酸含量测定输出摩尔比。输入与输出摩尔比不同是由于氨基酸掺入效率的差异所致。合适的RSP 包括在 PCT 国际公开出版物 W 00/05250、TO00/0524、WO 02/59143、WO 0027417、WO 96/32119，美国专利申请 US2008/0021192,2004/003888,2002/005546,2003/0004099、2003/0064915 和 2002/0037848，美国专利 6，514，938、5，800，808 和5，858，964中描述的和PCT申请PCT/US05/06822中描述的那些。这些文献描述了合成RSP的方法，含RSP的组合物，RSP的治疗制剂，给予受试对象RSP组合物的方法，可用RSP治疗的疾病，及可与RSP同时给予受试对象的治疗有效药物。本发明所用的另外的RSP和合成它们的方法可参见文献，如 Shukaliak Quandt, J.等· (2004)Mol. Immunol. 40(14-15)1075-87 ；Montaudo, MS (2004)J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15 (3) :374-84 ；Takeda,N.等· (2004) J. Control Release 95(2) :343-55 ;Pollino，JM 等· (2004) J. Am. Chem.Soc.126(2) :563-7 ；Fridkis-Hareli, M 等· (2002)J.Clin Invest.109(12) :1635-43 ；Williams，DM 等· (2000) J. Biol. Chem. 275(49) :38127-30 ；Tselios,T.等· (2000)Bioorg.Med. Chem. 8(8) :1903-9 和 Cady, CT 等· (2000) J. Immunol. 165(4) : 1790-8。所有这些专 利、专利申请和出版物的完整内容均纳入本说明书作为参考，特别是其中所描述的RSP的结构、制备和功能。某些RSP可包含适量带正电的氨基酸如赖氨酸或精氨酸，和带负电的氨基酸(含量宜较少)如谷氨酸或天冬氨酸，任选地与电中性的氨基酸如丙氨酸或甘氨酸(起填充作用)联合，任选地还可进一步包含适合赋予共聚体免疫原性的氨基酸，例如芳族氨基酸如酪氨酸或色氨酸。这类组合物可包含WO 00/005250中所述的任何一种氨基酸，其全部内容纳入本说明书作为参考，特别关注所披露的讨论RSP结构、制备和功能的那些部分。在本发明的某些实施方式中，RSP组合物是一种聚合物的混合物，这些聚合物包含随机或部分随机组成的氨基酸序列和含有以下四组氨基酸(a)带正电氨基酸，即赖氨酸和精氨酸；(b)带负电氨基酸，即谷氨酸和天冬氨酸；(C)小的中性氨基酸，即丙氨酸、苏氮酸、丝氨酸和甘氨酸；(d)大的氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。这类RSP的具体实施方式
有YEAK (包括下文描述的Cop-l)、VEAK和FEAK。在其它实施方式中，RSP是由三个氨基酸组成的三聚体，选自上述四组中三组的各个氨基酸。具体的实施方式有YAK，YEK, KEA和YEA，下文中有进一步描述。在本发明的其它实施方式中，RSP组合物是由随机或部分随机氨基酸序列组成的聚合物的混和物，含有(a)谷氨酸，(b)天冬氨酸和选自以下各组的氨基酸(C)小中性氨基酸，即丙氨酸、苏氮酸、丝氨酸和甘氨酸；和(d)疏水性氨基酸，即缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。这类RSP的具体实施方式
为DALE、DAIE、DAVE、DGLE、DGIE和DGVE。本发明有用的RSP的其它实施方式是不含疏水性氨基酸的RSP。
具体实施方式
是DASE、DATE、DGSE和DGTE。其他合适的RSP是具有随机或部分随机的氨基酸序列并含有选自以下四组之一氨基酸的聚合物的混和物(a)带负电氨基酸，即天冬氨酸和谷氨酸；(b)小脂族氨基酸，即丙氨酸和甘氨酸；(C)疏水性氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸；和(d)含小疏水侧链的氨基酸(如丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸)，此外，所述共聚体可包含脯氨酸残基。在一种实施方式中，所述共聚体由氨基酸谷氨酰胺(E)和/或天冬氨酸(D)、亮氨酸(L)、丝氨酸(S)和丙氨酸(A)产生，本说明书称之为"ELSA"共聚体。在某些其他实施方式中，RSP是随机或部分随机氨基酸序列的混和物，含有以下四组的氨基酸(a)带负电氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)；(b)疏水性脂族氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸；大疏水性氨基酸，即酪氨酸、苯丙氨酸；和(d)有小中性侧链的氨基酸，即丝氨酸、苏氮酸、丙氨酸、甘氨酸；此外，所述共聚体可含脯氨酸残基。一种示例性共聚体由氨基酸残基谷氨酰胺(E)和/或天冬天氨酸(D)、亮氨酸(L)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)形成，本说明书称之为"DLYV"共聚体。RSP的其他具体实施方式
是VYAK、VffAK和YFAK，下文有进一步描述。在还有的其他实施方式中，适合用于本发明的RSP包含氨基酸残基K、E、A、S、V和任选的P。更优选，K E A S V 的比例是 O. 3 : O. 7 : 9 : O. 5 : O. 5 : O. 3。RSP 优选长约 10-100个氨基酸残基，更优选长约20-80个个氨基酸残基，甚至更优选长约40-60个氨基酸残基，最优选长约50个氨基酸残基。典型的RSP制备物是各种长度肽的混合物，主要是所需长度的肽，但可含有某些较短或较长的肽。一种适合于本说明书描述的组合物和方法的特异性RSP是YEAK，它包含L-丙氨 酸㈧、L-谷氨酸(E)、L-赖氨酸⑷和L-酪氨酸⑴的组合，带净正电荷。一具体实施方式
是共聚体I (Cop-I),也称为glatiramer acetate。几个国家已批准用Cop-I来治疗多发性硬皮症(MS)，其商品名为C0PAX0NETM(Teva药物有限公司的商标，Petah Tikva,以色列)。由于Cop-I是随机多肽的混合物，可能它包含的肽的所有亚组或只有一个亚组是“活性肽”。受关注的Cop-IRSP分子量约2，000—13, 000道尔顿(Da)。Cop-I的平均分子量约4，700—13, OOODa，但也可包含较小和较大的肽。最受关注的Cop-I的平均分子量约
5,000—9, OOODa0因此，Cop-IRSP可以是由长约15-100个氨基酸残基(优选长约40-80个氨基酸残基)组成的肽。在一种具体实施方式
中，Cop-IRSP的长度在35—75个氨基酸残基之间。更优选的Cop-IRSP长度在35—65个氨基酸残基之间。在一种具体实施方式
中，Cop-I长约50个氨基酸。在另一种具体实施方式
中，Cop-I长约52个氨基酸。在某些实施方式中，用本领域熟知的液相或固相化学合成的Cop-I的平均输出摩尔比Y E A K分别约为I. O : 2.0 : 6.0 : 5.0。与传统的肽合成相反，但与其他RSP的制备相似，进行Cop-I的合成是通过加入明确比例的受适当保护的Y、E、A和K的混合物，而不是每轮只加入一种氨基酸。输出比例的差异范围在不同氨基酸之间约为10%。优选形式Cop-I的分子量范围和制备方法可参见美国专利No. 5，800，808，其全部内容纳入本说明书，特别是其中描述的RSP的结构、制备和功能。在含约52个氨基酸残基的Cop-IRSP的某些实施方式中，31_52位氨基酸中丙氨酸组分的比例高于11-30位氨基酸中的比例，和11-30位氨基酸中丙氨酸组分的比例高于1-10位氨基酸中的比例。在一种具体实施方式
中，Cop-IRSP序列中的1-10位残基中的输出摩尔比为约1.0 2. O 5. 5 5.0，而11-30位残基的输出摩尔比约为1.0 2.0 6.0 5. O ;31-52位残基的输出摩尔比约为L O 2. O 6. 5 5. 0，以上标示的所有比例是按Y、E、A、K顺序的摩尔比。就本发明的目的而言，短语“Cop-Ι或Cop-I-相关肽或多肽”意味着包括与髓磷脂碱性蛋白(MBP)有功能交叉反应、在抗原提呈中能与MBP竞争MHC II类分子的任何肽或多肽。对于本说明书所述的用途，预期如果只进行以下一个或几个氨基酸的替换，即天冬氨酸
(D)替换谷氨酸(E)，甘氨酸(G)替换丙氨酸(A)，精氨酸(R)替换赖氨酸(K)，色氨酸(W)替换酪氨酸(Y)，可保留Cop-I的活性。
在其他实施方式中，RSP组合物包含以下组别的三种不同氨基酸(a)带负电氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)；(b)疏水性脂族氨基酸，即亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸；(c)大疏水性氨基酸，即酪氨酸、苯丙氨酸；和(d)小中性侧链氨基酸，即丝氨酸、苏氮酸、丙氨酸、甘氨酸；此外，所述共聚体可包含脯氨酸残基。这些共聚体在本说明书中指“三聚体”。平均分子量在约2，000-40, OOODa之间，优选在约3，000—35，OOODa之间。在一种更具体实施方式
中，平均分子量约5，000—25，OOODa。以下表格中显示了示例的三聚体。这些三元共聚体的氨基酸平均摩尔分数可以不同，显示为一般范围。表A适合于本发明使用的三元共聚体
权利要求
1.一种检测RSP组合物的方法，包括以下步骤 a.提供一种或多种捕获多妝的基本纯制剂； b.使一种或多种捕获多肽附着于定量检测RSP组合物的工具；和 c.测定RSP组合物与一种或多种所述捕获多肽的结合。
2.一种改进RSP组合物设计的方法，包括以下步骤 a.提供一种或多种捕获多妝的基本纯制剂； b.使一种或多种捕获多肽附着于定量检测RSP组合物的工具； c.测定RSP组合物与一种或多种所述捕获多肽的结合； d.调整所述RSP组合物的设计以增加或减少所述RSP组合物与一种或多种捕获多肽的结合； e.重复步骤(C)； f.任选地重复步骤(c_e), 其中调整所述RSP组合物的设计导致提高其生物利用度、减小毒性和提高效能中的一种或多种。
3.一种检测RSP组合物中肽种类的方法，包括以下步骤 a.提供一种或多种捕获多妝的基本纯制剂； b.使一种或多种捕获多肽附着于固体支持物上； c.使所述固体支持物与RSP组合物接触；和 d.测定所述RSP组合物中单个肽种类与固体支持物的结合。
4.一种改进RSP组合物中肽种类设计的方法，包括以下步骤 a.提供一种或多种捕获多妝的基本纯制剂； b.使一种或多种捕获多肽附着于固体支持物上； c.使所述固体支持物与RSP组合物接触； d.测定所述RSP组合物中单个肽种类与固体支持物的结合； e.调整所述RSP组合物的设计以增加或减少所述RSP组合物与一种或多种捕获多肽的结合； f.重复步骤⑷； g.任选地重复步骤(d-f), 其中调整所述RSP组合物的设计导致提高生物利用度、减小毒性和提高效能中的一种或多种。
5.如权利要求1-4之一所述的方法，其中(a)所述一种或多种捕获多肽通过以下步骤进行鉴定 i.使RSP组合物附着于固体支持物上； .使(i)中所述固体支持物与含蛋白质生物液体接触； iii.鉴定特异性结合于(i)所述固体支持物的(ii)所述的蛋白质； 其中，Qi)中的蛋白质是一种捕获多肽。
6.如权利要求1-5之一所述的方法，其中所述捕获多肽选自补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号No. CAA34971)，载脂蛋白E，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及IgJ-链。
7.一种测定RSP组合物存在的方法，包括以下步骤 a.将一种或多种蛋白质附着于定量检测样品中所述RSP组合物的工具，所述一种或多种蛋白质选自以下物质补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α -胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A_IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白E，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子ΙΙ(凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，IgAI Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a -2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体,抑制剂Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及IgJ-链；和 b.测定所述样品中所述RSP组合物的水平。
8.如权利要求1-4之一所述的方法，其中所述捕获多肽选自补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号No. CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，IgAI Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及IgJ-链。
9.一种检测生物样品中RSP组合物存在的方法，包括以下步骤 a.将生物样品与正常人血清、正常非人灵长类动物血清、正常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常猪血清、正常狗血清、正常马血清、正常绵羊血清、正常母牛血清中所含的至少一种捕获多肽接触；和 b.检测捕获多肽与RSP组合物的结合存在与否， 其中，存在这种结合表明生物样品中RSP组合物的存在。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述捕获多肽选自包括HDL蛋白质组、LDL蛋白质组的至少一种组分或至少一种血清蛋白的多肽。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述RSP组合物包含YFAK肽。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述RSP组合物包含YEAK肽。
13.一种检测生物样品中包含YFAK肽或YEAK肽的RSP组合物存在的方法，包括以下步骤 a.将生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包括选自以下物质的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链；和 b.检测捕获多肽与RSP组合物的结合存在与否， 其中，存在这种结合表明生物样品中YFAK肽或YEAK肽的存在。
14.一种测定生物样品中包含YFAK肽或YEAK肽的RSP组合物含量的方法，包括以下步骤 a.将生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包括选自以下物质的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链；和 b.定量测定捕获多肽与RSP组合物的结合水平， 其中，结合水平表示生物样品中RSP组合物的量。
15.一种测定含YFAK肽或YEAK肽的RSP组合物在哺乳动物体内生物利用度的方法，包括以下步骤 a.给予哺乳动物一个剂量的含RSP组合物的组合物； b.从受试对象取生物样品； c.将该生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包括选自以下物质的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号No. CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a 2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，α-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； 从而确定生物样品中RSP组合物的生物利用度。
16.一种确定对有需要的对象给予含YFAK或YEAK肽RSP组合物的合适剂量的方法，包括以下步骤 a.给予受试对象一个剂量RSP组合物； b.从受试对象取生物样品；C.使生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包括选自以下物质的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号No. CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a 2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，α-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； d.检测该生物样品中捕获多肽的水平； e.任选地用不同剂量重复步骤(a)至(d)； f.将生物样品中测得的这些水平与RSP组合物预定的合适水平比较； 其中合适剂量是导致生物样品中RSP组合物达到预定合适水平的剂量。
17.一种治疗或预防受试对象不希望有的免疫应答反应的方法，包括以下步骤 a.给予受试对象合适剂量的含YFAK或YEAK肽RSP组合物，其中所述合适剂量由如下步骤确定 (i)给予受试对象一个剂量的RSP组合物； ( )从受试对象取生物样品； (iii)使生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包括选自以下物质的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α -胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α _1_Β_糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； (iv)检测生物样品中该捕获多肽的水平； (v)任选地用不同剂量重复步骤(i)至(iv);和 (vi)将生物样品中测得的水平与预定的RSP组合物合适水平作比较；其中合适剂量是导致生物样品中RSP组合物达到预定合适水平的剂量。
18.如权利要求13-17之一所述的方法，其中所述捕获多肽是被标记的多肽。
19.如权利要求13-17之一所述的方法，其中所述捕获多肽附着于固体支持物上。
20.如权利要求13-17之一所述的方法，还包括分离含结合于RSP组合物的捕获多肽的复合物。
21.如权利要求13-17之一所述的方法，还包括用抗捕获多肽的抗体检测捕获多肽与RSP组合物的结合。
22.如权利要求13-17之一所述的方法，其中所述组合物是皮下注射给予的。
23.一种用于检测生物样品中含YFAK或YEAK肽RSP组合物的组合物，其包含至少一种捕获多肽，所述捕获多肽包括选自以下组的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A_IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白E，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，IgAI Bur,富含组氨酸的糖蛋白前体，ct -2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体,抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及IgJ-链。
24.—种分离含YFAK或YEAK肽RSP组合物样品中的肽的方法，包括以下步骤 a.将样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包含选自以下物质的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链；和 b.从混合物中分离结合于捕获多肽的肽。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述捕获多肽固定于固体支持物上。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述捕获多肽是表位标记的多肽。
27.如权利要求24所述的方法，还包括从捕获多肽分离结合的肽。
28.如权利要求24所述的方法，还包括测定所分离的肽的特性。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述测定所述特性包括测定结合肽的氨基酸序列或测定结合肽中氨基酸的相对比例。
30.一种在受试对象上鉴定含YFAK或YEAK肽的RSP组合物的生物可利用肽的方法，包括以下步骤 a.在第一时间给予受试对象RSP组合物； b.在给药后的第二时间从受试对象取组织样品；和 c.鉴定样品中结合于至少一种捕获多肽的肽，所述捕获多肽包含选自以下物质的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2_HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链。
31.一种制备含毒性减弱的YFAK或YEAK肽的RSP组合物的方法，包括以下步骤a.将RSP组合物与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包含选自以下物质的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号No. CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a 2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，α-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； b.将结合于捕获多肽的肽与混合物分离； c.测定所分离肽的特性；和 d.制备具有所分离肽的特性的一系列肽。
32.一种制备含效应增强的YFAK或YEAK肽的RSP组合物的方法，包括以下步骤 a.将RSP组合物与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包含选自以下物质的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号No. CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a 2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，α-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； b.将结合于捕获多肽的肽与混合物分离； c.测定所分离肽的特性；和 d.制备具有所分离肽的特性的一系列肽。
33.一种治疗或预防受试对象不希望有的免疫应答反应的方法，包括 a.提供一种含YFAK或YEAK肽的RSP组合物； b.给予受试对象该RSP组合物； c.从受试对象取生物样品； d.将此生物样品与至少一种捕获多肽接触，所述捕获多肽包含选自以下物质的肽序列补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间- α -胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α _1_Β_糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A-IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号No. CAA34971)，载脂蛋白Ε，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a 2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，Ig Al Bur,富含组氨酸的糖蛋白前体，a -2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及 IgJ-链； e.将结合于捕获多肽的肽与混合物分离；f.测定所分离肽的特性； g.制备具有所分离肽的特性的一组肽；和 h.将这组新的肽给予受试对象。
34.如权利要求30或33所述的方法，其中所述肽给予受试对象一次以上。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述肽以1，2，3，4，6，12，18，24，36，48或72小时的间隔给予受试对象。
36.一种比较含YFAK或YEAK肽的RSP组合物不同制剂的方法，包括以下步骤 a.将第一种RSP组合物与正常人血清、正常非人灵长类动物血清、正常家兔血清、正常血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常猪血清、正常狗血清、正常马血清、正常绵羊血清、正常母牛血清中所含的至少一种捕获多肽接触； b.使第二种RSP组合物与正常人血清、正常非人灵长类动物血清、正常家兔血清、正常小鼠血清、正常大鼠血清、正常雪貂血清、正常猪血清、正常狗血清、正常马血清、正常绵羊血清、正常母牛血清中所含的至少一种捕获多肽接触； c.必要时重复步骤(b)； d.从步骤(a-c)的混合物中分离结合于捕获多肽的肽； e.测定步骤(d)分离的肽的特性；和 f.比较具有步骤(d)分离的肽的特性的所述一组分离肽。
37.一种制备靶向受试对象组织的治疗剂的方法，包括以下步骤 a.提供含YFAK或YEAK肽的RSP组合物；和 b.将治疗剂与RSP组合物偶联以形成偶联物。
38.一种向受试对象特定组织递送治疗剂的方法，包括以下步骤 a.通过以下步骤分离标记肽 (i)使含YFAK或YEAK肽的RSP组合物与组织特异性肽接触，所述组织特异性肽包含选自以下物质的肽补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间- α -胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α -I-B-糖蛋白，α -I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A_IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白E，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子II (凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，IgAI Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a-2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体，抑制剂Kunitz型蛋白酶，未命名的蛋白产物(NCBI基因座 / 登记号 No. CAA28659)，及 IgJ-链； ( )从混合物中分离结合于组织特异性肽的肽； b.将标记肽与治疗剂偶联；和 c.将偶联物给予受试对象。
39.一种包含偶联有标记肽的治疗剂的偶联物，其中所述标记肽包含YEAK或YFAK肽。
40.如权利要求39所述的偶联物，其中所述肽根据其对以下物质的结合亲和力从RSP组合物中分离得到，所述物质选自补体组分C3，载脂蛋白A-I前原蛋白，载脂蛋白A-II前原蛋白(载脂蛋白D)，补体组分C4A，胰蛋白酶抑制剂，间- α -胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白(IHRP)、α-I-B-糖蛋白，α-I-抗胰蛋白酶，载脂蛋白A_IV，血浆铜蓝蛋白，未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登录号NO.CAA34971)，载脂蛋白E，补体因子B，前白蛋白，载脂蛋白C-III，a2-HS糖蛋白，载脂蛋白J前体，C链，IgM，免疫球蛋白λ轻链，凝血因子ΙΙ(凝血酶)，IgK链V-III (KAU冷凝集素)，载脂蛋白J前体，IgAI Bur，富含组氨酸的糖蛋白前体，a -2-HS糖蛋白，凝溶胶蛋白同工型a前体,抑制剂Kunitz型蛋白酶,未命名的蛋白产物(NCBI基因座/登记号No. CAA28659)，及IgJ-链。
41.如权利要求37或38所述的方法或权利要求39所述的偶联物，其中所述治疗剂是有机小分子或生物大分子。
42.如权利要求37或38所述的方法或权利要求39所述的偶联物，其中所述组织是脑、肺或肝组织。
43.如权利要求37或38所述的方法或权利要求39所述的偶联物，其中所述标记肽包含YEAK或YFAK肽。
44.如权利要求37或38所述的方法或权利要求39所述的偶联物，其中所述标记肽通过共价键、络合、离子键或氢键偶联于治疗剂。
全文摘要
本领域已有检测简单肽的方法。然而，由于受检肽的异质性，检测一组肽混合物而非具有明确氨基酸序列的各别肽的有效血浆浓度的方法很复杂。本申请提供检测和评估随机序列聚合物(RSP)组合物的改进方法，检测和和定量测定RSP组合物的方法，根据肽亚组与某些捕获多肽的相互作用确定和富集RSP组合物中肽亚组的方法，和对需要的对象给予RSP组合物的方法，其中，剂量方案和用量可根据上述检测和定量方法加以确定和评估。
文档编号C07K4/00GK102869989SQ201080052757
公开日2013年1月9日 申请日期2010年11月17日 优先权日2009年11月17日
发明者E·扎内利, J·克里格, J·康诺利, K·H·柯林斯 申请人:阿雷斯贸易股份有限公司