专利名称：一种基于亲和层析的分离鹿角胶中功能多肽的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域中的多肽分离技术，尤其涉及一种基于亲和层析方法从鹿角胶中分离功能多肽的方法。
背景技术：
鹿角胶是鹿角经煎煮、浓缩制成的固体胶，它的主要成分是胶原蛋白。鹿角胶胶原蛋白是指以鹿角为原料采用热处理、酸/碱处理、酶法降解或结合多种方式降解获得的混合物，其主要成份是鹿角胶中胶原降解后形成的分子量不均一的多肽类物质。鹿角胶可作为保健品或药品原原料，具有提高人体免疫力、促进钙的吸收、改善血液微循环以及补充氨基酸营养成份等功能，从鹿角胶胶原蛋白中有效识别不同功能的多肽组份是近年来胶原蛋白产品开发中的热点。传统的鹿角胶原蛋白产品开发的重点主要集中于鹿角胶制备过程对分子量范围及产品性能的影响，而且采用的制备方法一般是酶解法。Hoon H. Simwoo等人利用酸水解法提取鹿角胶原蛋白，对鹿角从上到下分为四部分，对其每一部分分别进行了研究，发现鹿角最顶端的胶原蛋白含量最高(J. Agric. Food Chem. ,1995,43 =2846-2849) ；Rajaram 等人利用凝胶电泳从鹿茸骨中粗提胶原蛋白，然后用硝酸纤维素膜进一步纯化胶原蛋白 (Resonance, 2004) ；Li Yinqing等人采用醇提法制备鹿茸胶原，并利用动物实验发现鹿茸胶原对大鼠成骨细胞具有明显的促贴壁和增殖作用，对去势雌性大鼠骨质疏松症具有一定的治疗作用(AfricanJournal of Biotechnology，2010，9，38 :6437-6441)；徐云凤等人采用胰蛋白酶酶解法制备鹿茸胶原蛋白，并确定了其最佳制备工艺，利用高效凝胶色谱测定了酶解胶原蛋白的分子量分布，酶解池后，分子量低于15kDa(中华中医药杂志， 2011，26，1 :53-56)；韩国Hee-Guk Byim利用离子交换色谱和凝胶过滤色谱的方法从胶原蛋白中分离出具有抑制血管紧张素转化酶活性的多肽(Process Biochemistry, 2001, 36 1155-1162)；日本Maruyama S从胶原蛋白中分离出可抑制血小板活性的多肽(Biochimi. Biophysi. Acta ；1993,1164, 215-223)；传统的胶原蛋白中不同多肽的分离方法主要基于分子量范围、带电荷状态等性质进行分离，存在分辨率低和特征性不强等缺点，而且研究者主要研究鹿茸胶原蛋白对骨细胞的作用，对鹿茸胶原蛋白的很多功能作用都尚未开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于亲和层析的分离鹿角胶中功能多肽的分离方法。 纤维连接蛋白或凝血因子等血浆中的蛋白质可与胶原蛋白降解物中的许多多肽特异性结合，利用纤维连接蛋白或凝血因子等血浆中的蛋白质作为配基采用亲和层析的方法可分离鹿角胶中的部分多肽，本发明涉及的胶原蛋白中功能多肽分离方法具有分辨率高和特征性强等优点。本发明的详细内容(1)将鹿角胶溶于水制成胶原蛋白溶液，并将该溶液的pH值调至6. 0-9. O ；
(2)将胶原蛋白溶液上亲和层析柱，循环上样至亲和层析柱吸附样品达到饱和。(3)使用淋洗剂将未与层析介质配基结合的多肽淋洗出。(4)使用洗脱剂将与亲和层析介质配基结合的多肽洗脱出，洗脱过程的温度可控制在 15-37°C。(5)利用凝胶过滤层析法或膜超滤的方法将得到的洗脱液浓缩，得到浓缩液；(6)将浓缩液冷冻干燥，所得白色粉末即鹿角胶胶原蛋白中的功能多肽。本发明基于亲和层析的鹿角胶中功能多肽的分离方法中，如果待分离的胶原蛋白原料是水溶液，则省去(1)所述的胶原蛋白溶解过程，直接将胶原蛋白溶液的PH值调制 6. 0-9. O0所述的鹿角胶原料可以是鹿角胶或其胶原蛋白降解物。所述的亲和层析介质的基质是直径为40-120微米琼脂糖微球。所述的亲和层析柱中层析介质的配基可以是纤维连接蛋白或血浆中的其他蛋白质。所述的洗脱剂可以是含2-8mol/L脲、pH值为3. 0_8. 0的缓冲液，也可以是含 5-50%乙醇的水溶液或5-50%乙腈的水溶液。如果采用5-50%乙醇的水溶液或5-50%乙腈的水溶液作为洗脱剂，则省去(5)所述的利用凝胶过滤层析法或膜超滤的方法将得到的洗脱液浓缩，得到浓缩过程，洗脱液直接进行冷冻干燥。
具体实施例方式实施例1原料2mg/ml鹿角胶胶原蛋白水溶液(1)将原料鹿角胶水溶液的pH调至7. 0-9. 0。(2)将鹿角胶水溶液上样至亲和层析柱至透过液中检测出胶原蛋白，亲和层析介质的基质琼脂糖微球。亲和层析柱配基人血浆纤维连接蛋白，柱填料体积40ml，填料粒径:60-120微米。(3)使用20ml 0. 2mol/L碳酸氢铵作为淋洗剂淋洗层析柱，流速lml/min。(4)使用20%乙醇溶液在30°C下洗涤层析柱，流速lml/min，收集前30min组份，(5)将收集到的组份直接冷冻干燥，获得的白色粉末即为鹿角胶胶原蛋白中的功能多肽。实施例2原料鹿角胶水溶液(1)将原料鹿角胶水溶液的pH调制7. 0，浓度控制在3-10mg/mL。(2)将鹿角胶水溶液上样至亲和层析柱至透过液中检测出胶原蛋白，亲和层析介质的基质琼脂糖微球。亲和层析柱配基人血浆纤维连接蛋白，柱填料体积40ml，填料粒径:60-120微米。(3)使用20ml 0. 2mol/L碳酸氢铵作为淋洗剂淋洗层析柱，流速lml/min。(4)使用8M脲溶液(含0. INH4HCO3)在20°C下洗涤层析柱，流速lml/min，收集前 35min组份，(5)将收集到的洗脱液使用凝胶过滤层析柱(S^hadex G10)除去溶液中的脲。
(6)脱盐后的多肽直接冷冻干燥，获得的白色粉末即为鹿角胶中的功能多肽。
权利要求
1.一种基于亲和层析的分离鹿角胶中功能多肽的方法，其特征在于将从鹿角胶溶解后上样至亲和层析柱，淋洗去除未被亲和吸附的多肽，使用洗脱剂将鹿角胶中与层析介质亲和的功能多肽洗脱出，使用干燥方法获得功能多肽粉末。
2.按照权利要求1所述的方法，鹿角胶中的功能多肽分离是基于亲和层析的分离技术。
3.按照权利要求1所述的方法，亲和层析介质的配基是纤维连接蛋白或凝血因子等人血浆中的蛋白质。
4.按照权利要求1所述的方法，亲和层析介质的基质是直径为40-120微米琼脂糖微球。
5.按照权利要求1所述的方法，从鹿角胶中分离出的功能多肽是指鹿角胶中可以与纤维连接蛋白或凝血因子等人血浆中的蛋白质相结合的多肽。
6.按照权利要求1所述的方法，原料是鹿角胶溶解后溶液或从鹿角胶中分离出的胶原蛋白降解物。
7.根据权利要求1所述的方法，干燥方法是冷冻干燥或喷雾干杂。
全文摘要
一种基于亲和层析的分离鹿角胶中功能多肽的方法，其工艺过程为将鹿角胶胶原蛋白水溶液上样至以纤维连接蛋白为配基的亲和层析柱，循环上样至亲和层析柱吸附样品达到饱和，使用淋洗剂将未吸附的多肽淋洗出，使用洗脱剂将与亲和层析介质配基结合的多肽洗脱出，将洗脱液浓缩，冷冻干燥后所得白色粉末即鹿角胶胶原蛋白中的功能多肽。该方法具有过程简单和分离获得的多肽特征性强的优点。
文档编号C07K1/22GK102199193SQ20111007635
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者孔英俊, 张宏, 张贵锋, 查圣华, 苏志国, 马光辉, 高建萍 申请人:中国科学院过程工程研究所, 北京同仁堂健康药业股份有限公司