专利名称：一种制备生长抑素的方法
技术领域：
本发明属于多肽领域，具体涉及一种制备生长抑素的方法。
背景技术：
生长抑素，即生长激素释放抑制因子，是人体内存在的一种内源性调节激素，对多种生理功能具有广泛的抑制作用。生长抑素英文名 Somatostatin,分子式为=C76Hltl4N18O19S2，分子量1637. 89。氨基酸结构简写为
Al a- GI y- C y S- Ly S-As ri- P h e- P h e-Trp-Ly s-Th r- P h e-Th r- Ser-Cys 其分子结构式如下
生长抑素是由下丘脑的正中隆起和胰岛的S细胞合成的，1973年由德国的Guillemin 博士从绵羊的下丘脑分离得到并阐明其结构。Guillemin博士因此获得1977年诺贝尔医学和生理学奖。生长抑素化学结构为分子内带有一对二硫键的十四肽，在人体中主要存在于中枢神经系统和周围器官(如胃，肠，胰，皮肤等)，最大浓度见以下丘脑，但以消化道含量最大。生长抑素生物功能可抑制腺体释放生长激素、抑制促甲状腺和肾上腺皮质激素、 抑制胰腺的内分泌与外分泌、抑制胃粘膜释放胃泌素、抑制肠粘膜释放肠促胰激素和肾脏释放肾素，降低门静脉压力、松驰胆道口扩约肌、刺激单核巨噬细胞系统而减轻内毒素血症，抑制血小板活化因子的释放，直接或间接调节细胞因子链产生细胞保护作用，并可增强抗癌药物的抗增殖作用。临床常应用于严重急性食管静脉曲张破裂出血，严重急性胃、十二指肠溃疡出血，急性糜烂性胃炎或出血性胃炎，胰、胆和肠屡的辅助治疗，糖尿病酮症酸中毒的辅助治疗。其他一些作用和用途正随着其基础研究和临床的深入而不断被发现。因此生长抑素的应用前景广阔，市场需求量正逐年增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备生长抑素的方法，该方法首先对还原型生长抑素粗肽采用高效液相色谱法进行纯化得到还原型生长抑素精肽，然后对还原型生长抑素精肽进行液相氧化得到氧化型生长抑素，然后再采用高效液相色谱法纯化得到高纯度生长抑
ο本发明的目的是这样来实现的，其方法步骤为
1)将固相合成所得还原型生长抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟醋酸水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集还原型精肽溶液。2)将第一步所得还原型精肽溶液用纯化水稀释至约Ig肽/IL纯化水，用稀氨水调节PH至6-8之间，加入适量的H2A氧化，得到氧化型粗肽溶液。
3)将氧化型粗肽溶液浓缩至一定体积，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸三乙胺溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集氧化型精肽溶液。4)将氧化型精肽溶液转换成醋酸盐。纯化规模包括以下规格的色谱柱2CMX 25CM(直径X长度)、5CMX 25CM、 15CMX25CM
本发明的优点在于本方法制得的产品纯度高、收率高、操作简便，非常适合工业化生产。
具体实施例方式下面以实例对本发明做进一步详细说明 实施例一
1)将固相合成所得还原型生长抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，色谱柱规格为2CMX25CM(直径X长度)；以0. 05%_0.洲三氟醋酸水溶液为A 相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化。流速15-20ml/min。检测波长220nm。梯度 B%:15%-35% 40-60mino上样量为120_150mg。收集还原型精肽溶液。2)将第一步所得还原型精肽用纯化水稀释至约Ig肽/IL纯化水，用稀氨水调节 PH至6-8之间，加入0. 01%-1· 5% (ν/ν)的H2O2氧化1-3小时，得到氧化型粗肽溶液备用。3)将氧化型粗肽溶液在35°C以下减压旋蒸浓缩至10_15ml。以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，色谱柱规格为2CMX25CM (直径X长度)；以PH2. 5-3. 5磷酸三乙胺溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化。流速15-20ml/min。检测波长220nm。梯度B%:10%-30% 60-80min。上样量为90_130mg。收集氧化型精肽溶液。4)将氧化型精肽溶液转换成醋酸盐，取15_20g阴离子交换树脂置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后加入氧化型精肽溶液，充分搅拌后减压抽滤并收集滤液，再向树脂中加入纯化水洗一至两遍，减压抽滤收集滤液，合并所有滤液在35°C以下减压旋蒸浓缩至10-15ml。转移至50ml西林瓶中，冷冻干燥可得到纯度大于99. 5%高纯度生长抑素。实施例二
1)将固相合成所得还原型生长抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，色谱柱规格为5CMX25CM(直径X长度)；以0. 05%_0.洲三氟醋酸水溶液为A相、 色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化。流速80-120ml/min。检测波长220nm。梯度 B%:15%-35% 40-60mino上样量为1200_1500mg。收集还原型精肽溶液。2)将第一步所得还原型精肽溶液用纯化水稀释至约Ig肽/IL纯化水，用稀氨水调节PH至6-8之间，加入0. 01%-1· 5% (ν/ν)的H2O2氧化1-3小时，得到氧化型粗肽溶液备用。3)将氧化型粗肽溶液在35°C以下减压旋蒸浓缩至30_50ml。以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，色谱柱规格为5CMX25CM (直径X长度)；以PH2. 5-3. 5磷酸三乙胺溶液为 A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化。流速80-120ml/min。检测波长220nm。梯度B%:10%-30% 60-80min。上样量为l_2g。收集氧化型精肽溶液。4)将氧化型精肽溶液转换成醋酸盐，取40_50g阴离子交换树脂置于合适大小的
4砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后加入氧化型精肽溶液，充分搅拌后减压抽滤并收集滤液，再向树脂中加入纯化水洗一至两遍，减压抽滤收集滤液，合并所有滤液在35°C以下减压旋蒸浓缩至10-15ml。转移至50ml西林瓶中，冷冻干燥后即可得到纯度大于99. 5%高纯度生长抑素。实施例三
1)将固相合成所得还原型生长抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，色谱柱规格为15CMX25CM(直径X长度)；以0. 05%-0.洲三氟醋酸水溶液为A相、 色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化。流速400-500ml/min。检测波长220nm。梯度 B%:15%-35% 40-60min。上样量为20_30g。收集还原型精肽溶液。2)将第一步所得还原型精肽溶液用纯化水稀释至约Ig肽/IL纯化水，用稀氨水调节PH至6-8之间，加入0. 01%-1· 5% (ν/ν)的H2O2氧化1-3小时，得到氧化型粗肽溶液备用。3)将氧化型粗肽溶液在35°C以下减压旋蒸浓缩至80_120ml。以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，色谱柱规格为15CMX25CM(直径X长度)；以PH2. 5-3. 5磷酸三乙胺溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化。流速400-500ml/min。检测波长220nm。 梯度B%:10%-30% 60-80min。上样量为16_25g。收集氧化型精肽溶液。4)将氧化型精肽溶液转换成醋酸盐，取250_300g阴离子交换树脂置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后加入氧化型精肽溶液，充分搅拌后减压抽滤并收集滤液，再向树脂中加入纯化水洗一至两遍，减压抽滤收集滤液，合并所有滤液在35°C以下减压旋蒸浓缩至150-200ml。转移至50ml西林瓶中，每瓶15_20ml，冷冻干燥后即可得到纯度大于99. 5%高纯度生长抑素。
权利要求
1.一种制备生长抑素的方法，其特征在于方法步骤为1)将固相合成所得还原型生长抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟醋酸水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集还原型精肽溶液；2)将第一步所得还原型精肽溶液用纯化水稀释至约Ig肽/IL纯化水，用稀氨水调节 PH至6-8之间，加入适量的H2A氧化，得到氧化型粗肽溶液；3)将氧化型粗肽溶液浓缩至一定体积，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸三乙胺溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集氧化型精肽溶液；4)将氧化型精肽溶液转换成醋酸盐，取阴离子交换树脂置于砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后加入氧化型精肽溶液，充分搅拌后减压抽滤并收集滤液，再向树脂中加入纯化水洗一至两遍，减压抽滤收集滤液，合并所有滤液，在35°C以下减压旋蒸浓缩，浓缩液转移至西林瓶中，冷冻干燥后即可得到纯度大于99. 5%高纯度生长抑素。
2.根据权利要求1所述的一种制备生长抑素的方法，其特征是所述步骤1)A相三氟醋酸水溶液浓度为0. 05%-0. m。
3.根据权利要求1所述的一种制备生长抑素的方法，其特征是所述步骤2)氧化PH值范围为 6-8，H2O2 浓度为 0. 01%-1. 5%ο
4.根据权利要求1所述的一种制备生长抑素的方法，其特征是所述步骤3)磷酸三乙胺溶液PH值为2. 5-3.5。
全文摘要
一种制备生长抑素的方法，它包括如下步骤1)将固相合成所得还原型生长抑素粗肽用注射用水溶解，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟醋酸水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集还原型精肽溶液；2)将第一步所得还原型精肽溶液用纯化水稀释至约1g肽/1L纯化水，用稀氨水调节PH至6-8之间，加入适量的H2O2氧化，得到氧化型粗肽溶液；3)将氧化型粗肽溶液浓缩至一定体积，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸三乙胺溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集氧化型精肽溶液；4)将氧化型精肽溶液转换成醋酸盐。本发明的优点在于产品纯度高、收率高、操作简便、达到产业化要求，利于推广。
文档编号C07K7/08GK102268073SQ20111020080
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月19日 优先权日2011年7月19日
发明者杨丽琴, 胡小光, 黄文华 申请人:南昌佰泰生物科技有限公司