专利名称：一种高效提取绵羊内脏组织蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及绵羊内脏组织蛋白的提取，将冰冻破碎勻浆法和漩涡混合法相结合， 对绵羊内脏组织中的蛋白质进行高效提取，以绿色荧光蛋白基因表达验证其重要的实用价值。
背景技术：
动物内脏组织是多种生物活性物质合成、代谢的场所，内含多种蛋白质，经常被用来检测生物活性物质以及某些蛋白的表达及其表达量。动物蛋白质在组织或细胞中一般以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质，其提取和纯化是一项艰巨而复杂的任务；要从复杂的混合物中完全提取出某种动物蛋白质，尚无普遍适用的方法；但任何一种动物蛋白质都可以根据其物理、化学性质及生物学特性，通过实验摸索，选择一套合适的提纯程序获取高纯度的蛋白质。
由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即使是同类蛋白质，因选用材料不同，提取方法差别也很大，不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离和提取；因此从动物组织中分离提取蛋白，建立快速、简便、重复性好的方法十分必要。根据文献检索①Nihan Burul-Bozkurt等在小鼠坐骨神经组织中加入裂解缓冲液(裂解液组成20mM Tris HCl (pH 7. 5), ImM EDTA, 5mM MgCl2, 5mM DTT，1 % SDS, ImM PMSF和cocktail蛋白酶抑制剂)进行组织勻浆，4°C、14，000转/分钟离心20min,分离上清，SDS-PAGE和Western-Blot检测芳香酶蛋白表达，在55 kD处检测到清晰的目的蛋白带。②专利号为CN 101252849A的《从结缔组织中分离蛋白质的系统和方法》的发明， 公开了从结缔组织中分离肌肉蛋白质，通过包括肌肉组织和结缔组织的动物组织置于水性溶剂中生成浆液，然后该浆液在低剪切力环境下加速，能够从结缔组织中分离肌肉蛋白质，但该方法操作复杂，技术要求高。③2007年吴燕燕、王剑河，李来好等在《食品科学》 2007, 28 (7): 245-248.发表的“罗非鱼内脏蛋白酶超声波提取工艺的研究”以罗非鱼内脏为原料，用蒸馏水洗净，按1 5 (W/V)加入0. 02mol/L的磷酸缓冲液，勻浆破碎，将勻浆后的样品分别放置于4°C冰箱和超声波仪中处理一段时间，取出，勻浆液在4°C 10000r/min离心30min，收集上清液为提取蛋白酶液。本发明依据动物蛋白质的物理、化学性质及生物学特性，通过实验，选择一套合适的提纯程序获取高纯度的蛋白质；即将冰冻破碎勻浆法和漩涡混合法相结合，对绵羊内脏组织中的蛋白质进行高效提取，并对其体内表达水平进行Western blot免疫组化验证，具有重要的科学实践意义。
发明内容
本发明的目的在于提供高效提取绵羊内脏组织蛋白的方法，为绵羊内脏组织蛋白的提取和分析提供简便、高效、快速的技术方法，具较强的实用性。本发明目的是这样实现的一种高效提取绵羊内脏组织蛋白的方法，以绵羊肝、脾、肺、肾的内脏组织为样品，按细胞破碎、蛋白定量、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的步骤实施
细胞破碎称取20-25mg样品，剪成3mm X 3mm的小块，置于预冷的2mL离心管中，其样品与裂解液的加量比为1:3-1:5 ；继续加入直径为4-5cm的无菌钢珠，置于TissueLyser LT仪器中勻浆，勻浆40-50秒即粉碎，取出钢珠，置于冰盒中3分钟，在漩涡振荡器上涡旋 10秒，再置于冰盒、再涡旋，反复6-8次，使其充分溶解；取勻浆液在4°C、14000转/分钟、 离心25-30分钟，取上清得蛋白提取物；其中LT仪器在使用前先置于-70°C冰箱预冷；
蛋白定量以BSA为对照，选用BCA法，依据多功能酶标仪的检测结果，制定标准曲线， 以计算蛋白浓度将其定量；取定量蛋白lOOPg，加入等量2X上样buffer，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白；
其中蛋白裂解液的配方取9M尿素2. 7克，质量体积比为4 % 3-[(3_胆固醇氨丙基) 二甲基氨基]"I"丙磺酸0. 2克，用高压灭菌去离子水溶解，补至5ml，冻存于-20°C冰箱中， 使用前在裂解液中加入体积比为4 %的蛋白酶抑制剂；
其中2 X上样buffer的配方取20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH为8.0，IOOmM 二硫苏糖醇，2%十二烷基磺酸钠，20%丙三醇，0.016%溴酚蓝，依次加入试剂瓶中完全溶解后使用；
其中电泳检测蛋白将凝胶放入电转缓冲液中，用湿转法100V转印60 min，加入5% 脱脂奶粉室温封闭2 h，用一抗为GFP单抗1 400稀释，在4°C孵育12-14h，PBST洗涤5 次，每次10 min，用二抗为IRDye 800CW标记的羊抗鼠IgG抗体1 12000稀释，室温下孵育50 min,用PBST洗涤5次，每次10 min,再用PBS洗涤一次，采用Odyssey近红外双色激光扫描成像。所述的方法，PBS是IXPBS磷酸缓冲液的配方NaCL 8g，KCL 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4 0. 24 g，加去离子水800ml，用HCL调pH值至7. 4，定容至1L，高压灭菌；PBST 是在1 XPBS磷酸缓冲液中加入体积比为0. 05 %的Tween 20。本发明采用冰冻破碎勻浆法和漩涡混合法提取绵羊内脏组织蛋白并进行蛋白定量，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白分离，利用Western blot检测绵羊内脏组织中绿色荧光蛋白GFP基因的表达；该方法与已有的试剂盒提取蛋白方法相比，制备蛋白的纯度高、质量好，可用于不同蛋白的制备和Western Blot分析；不论成年动物或幼年动物的内脏组织提取蛋白均可用此法，其优点是难溶性蛋白少，丢弃的组织残渣少，是目前提取蛋白效率最好方法之一，具有重要的实用价值，彰显技术进步。
本发明对照附图作进一步说明。附图1、2、3为Western blotting免疫印迹的表达结果； 图1为试剂盒提取的蛋白，其蛋白上样量为IOOPg ；
图2为试剂盒提取的蛋白，其蛋白上样量为200μβ ；
如图1、2所示采用试剂盒法提取的蛋白上样量无论是10(^g还是200μβ，均检测不到肺脏蛋白；图3为本专利所述方法提取的蛋白，其蛋白上样量为10(^g ；
如图3所示采用本方法上样量为10(^g时，检测在27KDa处即出现清晰的目的蛋白条
市ο图4为蛋白定量标准曲线。
具体实施例方式本发明对照实施例作进一步说明。 实施例本发明提供的快速且经济的提取绵羊内脏组织蛋白的方法，以羊的肝、脾、肺、 肾等内脏组织为原材料，由样品预处理、细胞破碎、蛋白定量、蛋白检测(SDS-PAGE和 Western-Blot)几步过程组成，具体方法如下
1)称取25mg不同内脏组织样品置于提前遇冷的2mL离心管中，用高压灭菌剪将样品剪碎成3mm X 3 mm的小块；
2)用前按4%体积加入预冷的含cocktail蛋白酶抑制剂的裂解液，样品与裂解液比例为1 3，同时加入直径为5cm的无菌钢珠，置于QIAGEN公司的TissueLyser LT仪器中勻浆 (仪器在使用前置于-70冰箱预冷)，对于内脏组织勻浆50秒，直至样品彻底粉碎；
其中裂解液配方取9M尿素2.7克，4 % CHAPS3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸0. 2克，使用前加入体积比为4%的蛋白酶抑制剂，用灭菌去离子水补至 5ml ；裂解液按照500微升/管分装，冻存与-20°C冰箱，勿反复冻融；
3)勻浆结束后，取出钢珠，将样品置于冰盒中3min，在漩涡振荡器上涡旋10秒，再次置于冰盒中3min再次涡旋10秒，如此反复6次，使其充分溶解；将勻浆组织液4°C、14000转 /分钟、离心30分钟；取上清转移至新的冷冻离心管中，即为内脏组织蛋白提取物；
4)用BCA法测定上清中的蛋白浓度，以BSA作为对照，根据多功能酶标仪的结果制定标准曲线计算提取的蛋白浓度，进行蛋白定量，并将样品分装保存于-70°C冰箱，避免反复冻融。5)在100微克的定量蛋白中加入等量2X上样buffer，其配方为取20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，PH8.0，IOOmM 二硫苏糖醇，2%十二烷基磺酸钠，20%丙三醇，0.016%溴酚蓝，依次加入试剂瓶中完全溶解，再按常规方法进聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分离蛋白。6) Western blot免疫印迹检测蛋白的表达，具体方法如下将聚丙烯酰胺凝胶放入电转缓冲液中，湿转法100V转印60 min后，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用一抗为GFP 单抗1 400稀释，即为IXPBS稀释抗体；在4°C、孵育12-14h，用PBST洗涤5次，每次10 min ；用二抗为IRDye 800CW标记的羊抗鼠IgG抗体1 12000稀释，即为1 XPBS稀释抗体；在室温孵育50 min, PBST洗涤5次，每次10 min,再用PBS洗涤一次，采用Odyssey近红外双色激光扫描成像。实验所用的TissueLyser LT仪器为德国QIAGEN公司生产；4%蛋白酶抑制剂由 Roche公司生产；一抗为GFP单抗，购自北京天根生化科技有限公司；二抗为IRDye 800CW
5标记的羊抗鼠IgG抗体，由Odyssey公司生产；PBS是1 XPBS磷酸缓冲液购自Sigma公司。
实验所用的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、二硫苏糖醇、十二烷基磺酸钠、丙三醇、溴酚蓝由上海生工生物工程有限公司生产。
权利要求
1.一种高效提取绵羊内脏组织蛋白的方法，其特征在于以绵羊肝、脾、肺、肾的内脏组织为样品，按细胞破碎、蛋白定量、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的步骤实施细胞破碎称取20-25mg样品，剪成3mmX3mm的小块，置于预冷的2mL离心管中，其样品与裂解液的加量比为1:3-1:5 ；继续加入直径为4-5cm的无菌钢珠，置于TissueLyser LT仪器中勻浆，勻浆40-50秒即粉碎，取出钢珠，置于冰盒中3分钟，在漩涡振荡器上涡旋 10秒，再置于冰盒、再涡旋，反复6-8次，使其充分溶解；取勻浆液在4°C、14000转/分钟、 离心25-30分钟，取上清得蛋白提取物；其中LT仪器在使用前先置于-70°C冰箱预冷；蛋白定量以BSA为对照，选用BCA法，依据多功能酶标仪的检测结果，制定标准曲线， 以计算蛋白浓度将其定量；取定量蛋白lOOPg，加入等量2X上样buffer，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白；其中蛋白裂解液的配方取9M尿素2.7克，质量体积比为4 % 3-[(3_胆固醇氨丙基) 二甲基氨基]"I"丙磺酸0. 2克，用高压灭菌去离子水溶解，补至5ml，冻存于-20°C冰箱中， 使用前在裂解液中加入体积比为4 %的蛋白酶抑制剂；其中2 X上样buffer的配方取20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH为8.0，IOOmM 二硫苏糖醇，2%十二烷基磺酸钠，20%丙三醇，0.016%溴酚蓝，依次加入试剂瓶中完全溶解后使用；其中电泳检测蛋白将凝胶放入电转缓冲液中，用湿转法100V转印60 min，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用一抗为GFP单抗1 400稀释，在4°C孵育12-14h，PBST洗涤5次， 每次10 min，用二抗为IRDye 800CW标记的羊抗鼠IgG抗体1 12000稀释，室温下孵育 50 min,用PBST洗涤5次，每次10 min,再用PBS洗涤一次，采用Odyssey近红外双色激光扫描成像。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于PBS是IXPBS磷酸缓冲液的配方=NaCL 8g, KCL 0.2 g，Na2HPO4 1. 44 g，KH2PO4 0. 24 g，加去离子水 800ml，用 HCL 调 pH 值至 7. 4， 定容至1L，高压灭菌；PBST是在1 XPBS磷酸缓冲液中加入体积比为0. 05 %的Tween 20。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于AissueLyserLT仪器为德国QIAGEN公司生产；4 %蛋白酶抑制剂由Roche公司生产；一抗为GFP单抗，购自北京天根生化科技有限公司；二抗为IRDye 800CW标记的羊抗鼠IgG抗体，由Odyssey公司生产；PBS是IXPBS 磷酸缓冲液购自Sigma公司。
全文摘要
本发明提供了一种高效提取绵羊内脏组织蛋白的方法，即采用冰冻破碎匀浆法和漩涡混合法，对提取的绵羊肝、脾、肺、肾等内脏组织蛋白进行蛋白定量，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对提取的蛋白进行分离，利用Westernblot检测转基因绵羊绿色荧光蛋白GFP基因的表达；其技术特点1、所提取的蛋白浓度高，成本低廉；2、适应成年或幼年羊的内脏组织蛋白的提取；3、难溶性蛋白少，丢弃的组织残渣少，具有重要的实用价值。
文档编号C07K1/14GK102443046SQ201110352210
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者刘明军, 张宁, 张雪梅, 李文蓉, 贺三刚 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心